-Drucken Chlorella mit dem Photolyten gesättigt ist; und da man die Quantenausbeute 1 nur finden kann, wenn Chlorella mit dem Photolyten gesättigt ist. Denn nur aus Chlorophyll, das mit dem Photo- lyten verbunden ist, kann absorbiertes Licht 0_> entwickeln. 2 Warburg, Zellphysiologie 18 Einleitung fältig mit Wasser ausgewaschenen grünen Grana im Licht Sauerstoff entwickelt nach der Gleichung 2 Chinon + 2 Ha0 = 2 Hydrochinon A 0a Hier schien der Weg über die Kohlensäure noch besser als durch Waschen der Grana dadurch ausgeschlossen zu sein, daß die Grana nicht imstande waren, aus zugesetzter Kohlensäure Sauerstoff zu entwickeln. Bei einer genaueren Untersuchung der Chinonreaktionen mit neuen Methoden in den Jahren 1959 und 1960 fanden wir jedoch, daß Kohlensäure für den Ablauf der Chinonreaktionen notwendig ist, allerdings nur sehr wenig Kohlensäure, da die Kohlensäure bei den Chinonreaktionen nicht stöchiometrisch, sondern kata- lytisch wirkt. Tatsächlich unterscheiden sich die Chinonreaktionen von der Photo- synthese in ihrem Verhalten gegenüber Kohlensäure nur dadurch, daß bei den Chinonreaktionen die reduzierte Kohlensäure durch überschüssiges Chinon immer wieder vollständig zu Kohlensäure zurückoxydiert wird, während bei der Photo- synthese ein Teil der reduzierten Kohlensäure als „fixierte Kohlensäure" übrig bleibt. So war 1960 die einzige Stütze der Wasserphotolyse gefallen und mit ihr das ganze Gebäude der Theorien, deren Fundament die Photolyse des Wassers gewesen war. Insbesondere haben wir es nie ernst genommen, daß die von uns entdeckte20 Reduktion der Phosphoglycerinsäure durch Dihydro-Nikotinsäureamid diejenige Reaktion sein sollte, durch die die Kohlensäure bei der Photosynthese reduziert wird. Das Auftreten der Phosphoglycerinsäure in den Radiogrammen nach Be- lichtung war hinreichend erklärt durch die lichtinduzierte Atmung. 6. Der Photolyt der Photosynthese Schüttelt man Chlorella aerob und im Dunkeln mit Kohlensäure, so wird Kohlen- säure chemisch gebunden. Belichtet man nach Beendigung der Kohlensäureauf- nahme, so verschwindet die aufgenommene Kohlensäure unter Entwicklung von Sauerstoff, bis Zersetzung und Aufnahme von Kohlensäure sich das Gleichgewicht halten und die Photosynthese stationär geworden ist. Die im Dunkeln sich anhäu- fende Kohlensäureverbindung, aus der der Sauerstoff entwickelt wird, nennen wir den Photolyten der Photosynthese. Die Konzentration des Photolyten, die man in Chlorella maximal erreichen kann, hängt von dem Druck der Kohlensäure und der Zucht der Zellen ab. In den A-Zellen, die im Licht die besten Quantenausbeuten geben, ist die Sättigung mit dem Photolyten bei einem Kohlensäuredruck von 10 bis 20° ,, einer Atmosphäre erreicht. Dann ist die Photolytkonzentration in der Regel gleich der Chlorophyll- konzentration. Der Photolyt bildet sich nur unter aeroben Bedingungen, wenn die Zellen atmen, und zerfällt unter Abspaltung von Kohlensäure, wenn man den Zellen den Sauerstoff entzieht. Die Bildung des Photolyten wird gehemmt, wenn man die Zellen in Arseniat anstatt in Phosphat suspendiert, steigt aber wieder auf den Normalwert, wenn man zu der Arseniatlösung Phosphat zusetzt. Einleitung 19 Der Gehalt an Photolyt steht zu dem Gehalt an Glutaminsäure in einer nahen Beziehung. Läßt man in der lebenden Chlorella die Glutaminsäure zu y-Amino- buttersäure und Kohlensäure zerfallen, so zerfällt auch der Photolyt unter Ent- wicklung von Kohlensäure; mit der Re- Synthese der Glutaminsäure in der leben- den Chlorella wird auch der Photolyt zurückgebildet. In den A-Zellen, die im Licht die besten Quantenausbeuten geben, findet man in der Regel, daß die Photolytkonzentration gleich der Glutaminsäurekonzentration ist. Alle die erwähnten Reaktionen der Bildung und des Zerfalls des Photolyten sind sehr schnelle Reaktionen, sie sind Teilreaktionen im Mechanismus der Photosyn- these und haben mit den langsamen Reaktionen der Proteinsynthese, den Umami- nierungen usw., nichts zu tun. Zum Beispiel beträgt die Kalbwertszeit der Bildung des Photolyten beim Wechsel von anaeroben zu aeroben Bedingungen bei 20° 5 Minuten. Wahrscheinlich ist die erste Reaktion bei der Bildung des Photolyten die rever- sible Phosphorylierung der Kohlensäure durch das A.T.P. der Atmung H2C03 - ATP # HCO3H2PO3 -f ADP eine Reaktion, die die Abhängigkeit vom Kohlensäuredruck und von der Atmung erklärt. Das gebildete Carboxyphosphat reagiert dann reversibel mit der Glutamin- säure, die entstandene Glutaminsäureverbindung reagiert reversibel mit dem Chlorophyll (vergl. Seite 567 und 627). 7. Die lichtinduzierte Atmung der Grana Von den Eigenschaften der Grana seien hier die folgenden hervorgehoben: 1 . Grana aus Blättern oder durch Beschallung von Chlorella gewonnen, haben keine Dunkelatmung. 2. Grana sind unfähig, im Licht reduzierte Kohlensäure zu fixieren. 3. Die SauerstofTentwicklung aus belichteten Grana wird durch Blausäure nicht gehemmt. Es sei hinzugefügt, daß die Atmung der Chlorelle sehr leicht, zum Beispiel durch wenig Chinon, zerstört werden kann und daß Chlorella dann folgende Eigenschaf- ten der Grana annimmt : daß sie zwar im Licht noch Sauerstoff entwickeln kann, aber unfähig zur Fixierung reduzierter Kohlensäure und unfähig zur Blausäure- hemmung wird. Es war das Hauptproblem der Granareaktionen, wie es energetisch möglich ist, daß die Grana aus Kohlensäure Sauerstoff entwickeln, obwohl ihnen doch keine Atmungsenergie zur Umwandlung der Kohlensäure in den Photolyten zur Ver- fügung zu stehen scheint. Die Antwort ist, daß die Grana zwar keine Dunkelat- mung haben, daß sie aber eine durch Licht induzierte Atmung haben. Ist Chinon — ein natürliches oder ein zugesetztes Chinon — der Oxydations- katalysator, so sind die Gleichungen der lichtinduzierten Atmung: 20 Einleitung 2 Chinon + 2 H20 + C = 2 Hydrochinon + C02 [1] 02 + 2 Hydrochinon = 2 Chinon - 2 H20 [2] Bilanz C + 02 = C02 [3] Licht CQ2 = C - Q2 [4] Bilanz 0 = 0 [5] Wie aber kann man, unter den Umständen dieser Bilanz, die lichtinduzierte Atmung der Grana nachweisen und messen ? Im Dunkeln kann man sie nicht nach- weisen, da sie im Dunkeln nicht vor sich geht. Im Licht kann man sie nicht nach- weisen, da die gebildete Atmungskohlensäure im Licht gemäß Gleichung [4] in C + O2 gespalten wird. Trotzdem ist es gelungen, die lichtinduzierte Atmung zu messen. Gibt man nämlich soviel Blausäure zu den belichteten Granasuspensionen, daß die Katalase der Grana gehemmt wird, so wird nunmehr in Reaktion [2] die doppelte Menge Sauerstoff verbraucht : 2 02-2 Hydrochinon = 2 Chinon + 2 H202 und für jedes Molekül Sauerstoff, das im Licht entwickelt wird, entstehen 2 Mole- küle Wasserstoffperoxyd. Dann wird die Bilanz von [1] bis [5] nicht Null, sondern Siewird: 02 + 2 H20 = 2 H202 so daß man nunmehr die lichtinduzierte Atmung der Grana durch Verbrauch von Sauerstoff und Bildung von Wasserstoffperoxyd messen kann — eine Methode, die man dem glücklichen Umstand verdankt, daß die Sauerstoffentwicklung in den belichteten Grana durch Blausäure nicht gehemmt wird. Dies ist die Methode, mit der die lichtinduzierte Atmung der Grana entdeckt worden ist und mit der bewiesen worden ist, daß auch in den Grana die Sauer- stoffentwicklung aus Kohlensäure quantitativ mit Oxydationsprozessen gekoppelt ist. Das Energieproblem der Granareaktionen war damit gelöst. Die Entdeckung der lichtinduzierten Atmung erlaubt es nun auch, die Nicht- fixierung der reduzierten Kohlensäure bei den Granareaktionen in einfacher Weise zu erklären. Man braucht nur anzunehmen, daß in den Grana die Oxydation der reduzierten Kohlensäure schneller geht als die Reduktion der Kohlensäure, wäh- rend in Zellen die Reduktion schneller geht als die Oxydation, und man versteht, warum in Zellen, aber nicht in Grana, beim Verdunkeln reduzierte Kohlensäure übrig bleibt, das heißt, warum in den Zellen aber nicht in den Grana Kohlensäure fixiert wird. Introduction* Motto: «De fixer les objets longtemps sans etre fatigue.» General remarks about our methods and their applications As a co-worker of Emil Fischer, I prepared the first optically active peptides in the years from 1903 to 1906, and thereby, as one who belonged to the inner circle of his co-workers, I came to know the methods and experimental techniques of this greatest organic chemist of our times. Later on I began work on the quan- tum requirement of photosynthesis in the radiation laboratory of the Physikalisch- Technische Reichsanstalt, where my father Emil Warburg was president from 1906 to 1922. From the experiments of this laboratory, Max Planck derived his law of radiation and calculated "the quantum of action", h = 6.55 • 10~2T erg ■ sec. In the same laboratory Emil Warburg measured the first quantum yields of photochemical reactions. Thus it came about that in the Kaiser- Wilhelm- Institut für Zellphysiologie the methods of two widely separated fields, those of radiation physics and organic chemistry, were united in one hand. The result was the elucidation of the chemical mechanism of enzyme action — the very fast intermediate reactions of protein- bound active groups, that we were able to separate from the enzymes and to cry- stallize. Coenzymes and many vitamins proved to be nothing eise than free active groups of enzymes. Here are some examples to illustrate the interplay of physical and chemical methods that is characteristic of our institute. By the methods of radiation physics the substance was discovered, that reacts in the living world with the molecular oxygen. By the methods of organic chemistry this substance which is an iron Compound was isolated and crystallized. — By the methods of radiation physics the acting groups of the hydrogen-transferring enzy- mes were discovered, by the methods of organic chemistry these acting groups were separated and crystallized. — From the interaction of the oxygen- and hydrogen- transferring enzymes resulted the respiratory chain — the general Solution of the problem of Lavoiser's respiration. — By the methods of radiation physics the main reaction of fermentations was recognized as a hydrogen transfer by nicotinamide, by the methods of organic chemistry 1, 3, Diphosphoglyceric acid has been iso- lated from yeast, the reactions of which explain the production of phosphateenergy in fermentations. — By methods of physics the fermentation of Cancer cell was discovered and the de-differentiated growth of Cancer cells was explained by a type of energy transformation at a time when the atmosphere of the earth did not yet contain oxygen — a result, which explained the ultimate cause of Cancer by the anaerobic past of life. * The italicized figures in this introduction are the reference numbers of the papers listed in the previous table of contents. * Other literature references (superscripts) are quoted in this introduction only when older works of the author or works of other authors are being cited. 22 Introduction The methods of radiation physics were employed to measure the quantum requirement of photosynthesis. It was found that in Chlorella somewhat less than three light quanta are necessary to split 1 CO > into C + O2 ; this means that in red light there is an almost complete conversion of light energy into chemical energy. In this energy tranformation 1 light quantum splits off 1 molecule of oxygen from the photolyt which is a carbonic acid, transformed by the energy of respiration; 2/3 of the produced C and O^ enter into a back reaction so that, in the net balance, three light quanta split one molecule of carbon dioxide. Thus the problem of the multiquanta reactions no longer exists in photosynthesis. The process of photo- synthesis is part of the ordinary photochemical reactions of the nonliving world. On this basis, the special chemistry of photosynthesis is nowadays being investigated with the methods of manometry and organic chemistry ; our findings in general energetics have thereby found excellent confirmation. The best physical and chemical methods, however, would not have been able to advance cell physiology, had they not been combined with a simplification of the biological technique. Instead of measuring the flow of blood through the surviving organs, the use of thin tissue slices was introduced ; instead of tissues, single cells were employed later. Red blood cells — nonnucleated ones of mam- mals, and nucleated ones of birds — were the first objects used to investigate the chemical mechanism of cell respiration. Instead of green leaves employed to study photosynthesis, unicellular green algae were introduced ; the algae were sometimes replaced by the green grana of spinach chloroplasts or the even much smaller green grana of Chlorella, produced by exposure to sound waves. In the investi- gation of Cancer cells, ascites Cancer cells were substituted for tumors ; whole animal cells were replaced by the grana of liver cells as early as 19141. In all this experi- mentation it was always our aim to simplify the technique and to attain a speed and precision comparable to the methods of Volumetrie chemical analysis. With com- plicated methods we have never discovered anything significant. SPECIAL PART I. Optical measurement of hydrogenation and dehyrogenation No one who has not worked in biochemistry before the hydrogentransferring function of nicotinamide was discovered can fully appreciate the significance of a method that is based on the absorption of light by the dihydropyridine nucleo- tides in the near ultraviolet ränge, at 340 ma. It is no exaggeration to say that this method has reduced the time previously required for detecting and measuring the most important metabolic reactions to about onehundredth. The method is not limited to hydrogenation and dehydrogenation but can be extended to degra- dations, phosphorylations, and all processes that can be coupled in any way with hydrogenation or dehydrogenation. Paper {2) in this collection illustrates the foregoing for fermentation reactions. If c is the concentration of dihydronicotinamide, d the path of light of wave- length 340 m\i, and ß the absorption constant of the dihydronicotinamide, then In — — = ß X c X d i If we express c in micromoles per cubic centimeter and d in centimeters, the dimension of ß becomes Square centimeters per micromole. The numerical value ofjS ß = 14 cm- //mole is one of the most important and most frequently used quantities in biochemistry. If this value is known, one may immediately derive from it, by means of the following expression, the number of micromoles of hydrogen per cubic centimeter 20 that were transferred in any one liquid, provided has been measured : z'o I /// 1 Ac ß x d //mole cm-5 For instance, if — = 2 and d = - 1 cm, then i ■Un — i 0,7 ß x d 14 //mole crrr from which it may be seen that the optical method is very sensitive, approximately 10 times as sensitive as our biological manometry. The directions for carrying out this method have not changed since 1935-, since the function and the UV-bands of dihydronicotinamide were discovered. However, this method did not become generally accessible until our photoelectric cell was replaced by the spectrophotometer of Beckman and Zeiss-Oberkochen and until the firm of Böhringer began to market pure metabolic enzymes. 24 Introduction Nicotinamide cannot be synthesized in adequate amounts in the human body and is, therefore, a vitamin indispensable to man. It is less known that nicotin- amide is also a therapeutically effective chemical. Ten years after the discovery of the physiological function of nicotinamide, in 1945, Vital Chorine3 found that tubercular guinea pigs and leprous rats could be healed by the use of nicotinamide, whereby 0.3 to 1 g per kg of body weight was sufficient to effect a eure. Free nicotinic aeid proved therapeutically ineffective. This action of nicotinamide, a com- pletely nontoxic substance, a component of hydrogen-transferring enzymes, was responsible for the testing of nicotinamide and its isomers and homologs with regard to the effect of these Compounds on human tuberculosis. The result of this work was the discovery by Gerhard Domagk of the action of isonicotinic aeid hydrazide, the most effective remedy against human tuberculosis today. II. Manometry Complicated manometric equipment, such as was used to measure the quantum requirement of photosynthesis — differential manometers, readings by means of the cathetometer-microscope, the rotary motion of round vessels — was replaced in 1945 by simple manometers, readings with the unaided eye, and the straight- line motion of reetangular vessels (8). The transition in the motion of the mano- metric vessels from circular to rectilinear caused one of the prineipal sources of error in manometry to disappear, i. e., the formation of foam when the vessels are shaken. A cell Suspension, formerly füll of bubbles after being shaken for no more than 1 hour, is today free of bubbles after being shaken for 24 hours. This enabled us to change over to experiments of any desired duration and, thereby, to obtain manometric effects of any desired magnitude — an example of what may be achieved by means of apparently minor modifications in technique. If irradiated manometric vessels moving in a straight line run the risk, at the end of their paths, of moving beyond the beam of light, this can be prevented by the use of mirrors that are attached to and move along with the manometers. Metabolism measurements in serum have also become simplified, because the complicated calculation of carbon dioxide retention has been replaced by a simple direct method of determination. The introduction of the new "side Chamber" and "trough" vessels, which will completely displace the older types of manometric vessels, represents a decisive advance in manometry (41, 42, 72). Carbonate-bicarbonate mixtures put into the side Chambers maintain constant pressures of carbon dioxide within the entire side-chamber vessels, over the ränge of 0.3 to 600 mm Brodie; cells maintained in their physiological environment in the main compartment of the vessel can thus no longer be damaged by the carbonate mixtures in which they formerly were suspended. This method constitutes the Solution of the oldest problem of biologi- cal manometry: to determine the oxygen metabolism under physiological carbon dioxide pressures by means of one vessel. It obviates the use of the two-vessel method in all cases in which the carbon dioxide is of no interest. The new manome- tric vessels may be obtained from Aminco, Silver Springs, Maryland, USA. Introduction 25 The new procedure has already been employed to determine the quantum requirement of photosynthesis with only one irradiated vessel. It has also been employed to determine the oxygen consumption of Cancer cells ; the respiration of these cells is determined only inaccurately by means of the two-vessel method because of the cells' large aerobic fermentation. The new trough vessels are conical and have insets that are located within the upper third, rather than at the bottom, of the main vessel. These trough insets are no longer shaped like cylinders but rather like flat troughs. They are connected to a sidearm, from which substances may be introduced into the trough; a second sidearm is connected to the main vessel rather than to the trough. If we mix in the trough via its sidearm, substances that are neutral and that do not become alkaline until they are mixed, we can determine the carbon dioxide content of the manometric vessel. If the cell Suspension in the main compartment of the vessel is fvrst acidified via the second sidearm, and the contents of the trough are only then made alkaline, the total carbon dioxide in the manometric vessel can be determined. If we mix in the trough substances which, upon contact with one another, give off oxygen without a simultaneous change in the pressure of carbon dioxide — for instance, catalase and hydrogen peroxide — we can make the transition from anaerobic to aerobic conditions without opening the vessel. If, on the other hand, we mix in the trough substances that, upon contact with one another, absorb oxygen, without the reaction becoming alkaline, we can make the transition from aerobic to anaerobic conditions without opening the vessel. Of the application of trough vessels to date we should like to mention the meas- urement of the fixation of CO-2 in green cells, a determination that can be made much more reliably and precisly by the use of through vessels compared to the usual C14 methods. We should further like to mention the measurement of the uptake of carbon dioxide by Chlorella as a result of the transition from anaerobic to aerobic conditions, as well as the measurement of the evolution of carbon dioxide by Chlorella on transition to anaerobic conditions. In addition, we should like to mention the measurement, in a Single vessel, of the retention of carbon dioxide and lactic acid. III. Radiation measurement (Bolometer) The bolometer in use today was developed at the Physikalisch-Technische Reichs- anstalt by Lummer and Kurlbaum. It is an instrument that has a great past; with it Lummer and Pringsheim4 measured the radiation of black bodies. From their experiments in 1900, Planck5 derived his formula for radiation in 1900 and calculated the constant h (h = 6.55 • 10~27 erg • sec, as compared to today's value of h = 6.63 • 10 --' erg • sec). It is the same instrument with which Emil War- burg6 in the years 1911 to 1930 laid the foundations of quantitative photochemistry. The bolometer has one advantage that distinguishes it from all other instruments for the absolute measurement of radiation : If one permits a beam of light to fall on the platinum Strips of the bolometer and then shifts the beam over the surface of the 26 Introduction bolometer, the electrical response of the bolometer remains constant; whereas, if a ray is shifted along the surface of a thermopile, the deflections of the galvano- meter change so considerably that absolute radiation measurements are impossible. We have simplined (11) the calibration of the bolometer by substituting for the Hefner lamp the calibrated carbon-filament lamp of the Bureau of Standards in Washington. If, during calibration, the bolometer opening is covered by means of a lithium fluoride window rather than a quartz window, no corrections need be made for selective absorption; correction must be made only for the reflection of the Standard light. As light sources we use the mercury and xenon high-pressure lamps manufac- tured by the Osram A.G., or 500-watt metal-filament lamps that have a small area of intense brightness. Nowadays we rarely employ monochromators to isolate the spectal regions but, most of the time, use colored glass filters and interference disks. We test each spectral region before using it for measurements of photosyn- thesis, employing a Solution of 1 mg/cm3 ethyl chlorophyllide in pyridine; the So- lution should not transmit any light in a layer of 1-cm thickness. Another contribution to the development of radiation methods (11) is the Splitting of light beams by means of prisms or of mirrors that permit only partial transmission; and the bolometric adjustment of the two parts to the same intensity, as is required in the two-vessel method. This technique has been improved in such a way for the measuring the absorption of the blue-green action spectrum of photosynthesis, that it became possible to add, to two red beams of equal intensity, two blue-green beams of equal intensity. IV. Radiation measurement (Quantum actinometer) (4) In addition to using the bolometer for absolute radiation measurements, we deve- loped the quantum actinometer for special purposes, In this instrument, oxygen is transferred to thiourea by chlorophyllide or pheophorbide and the oxygen absorbed is measured manometrically. If the quantum intensities are below a cer- tain threshold, the amount of oxygen consumed when one light quantum is ab- sorbed is almost exactly one molecule. If monochromatic light beams are to be measured, the bolometer is to be preferred to the actinometer. But if diffuse light is to be measured, the actinometer is prefer- red. The actinometer may also be used to measure the sum of light intensities that are not constant, since the actinometer integrates the intensities of the absorbed light. V. Radiation measurement (Absorption measurement) (25) The most difficult part of the determination of the photosynthetic yield by radiation measurements was the measurement of the light absorption in the turbid media of the cell suspensions. Our first Solution of the problem consisted Introduction 27 in putting so many cells into the manometric vessels that the radiated light was completely absorbed. But the great respiration of these many cells was inconve- nient. Nowadays the respiration is compensated for by means of düfused blue- green light before the incident light is allowed to irradiate the manometric vessel; therefore, extensive respiration no longer presents an obstacle to the application of the method of complete absorption. Incomplete absorptions we measured first by means of the quantum actinometer, which we placed around the manometric vessel containing the cells. Later we developed an Ulbricht sphere for measuring incomplete absorptions ; in the center of the sphere the manometric vessels were moved about and irradiated as they were in the yield determinations. If the photomultiplier built into the surface of the sphere showed the deflection zD for white cells and i for green cells, the fraction of irradiated light absorbed by the green cells was i a = —^ Thus, it is now possible to measure both very small and very large quan- tities of absorbed light that is to determine the yields of photosynthesis for very dilute as well as very dense suspensions of cells. The fact that we found almost the same quantum yield for 5% light absorption as for 100" 0 light absorption may be considered a confirmation of the reliability of our methods of absorption measurement. As may be gathered from all the aforesaid, two instruments are required for measuring light absorption: one instrument to measure the incident quanta, and another to measure the absorbed fraction of the incident quanta. A bolometer and an Ulbricht sphere are examples of such instruments. Because both Calvin and Daniels used the bolometer quite incorrectly, we should like to point out that this instrument is not suitable for measuring light absorption (34) by light- scattering suspensions. VI. Metallo-enzymes (2) The role of iron or copper in oxygen-transferring enzymes has been completely explained from a chemical point of view by a valence change of these metals. However, there is a second type of metallo-enzyme, in which the function of the metal is not a valence change, e.g., when zinc is effective or when several metals are interchangeable with one another. A metallo-enzyme of this type is yeast zymohexase, which splits hexosediphosphate into triosephosphate and which is activated by zinc, cobalt, or iron. The method we introduced in 1938 for the detection of functional heavy metals in enzymes is not an analytical one, since the high molecular weights of the enzymes make analytical results uncertain and since analysis does not give an explanation of the function of metal. Instead, our method consists in removing the metal by dialysis against complexing substances, e.g., phenanthroline, and in resynthesizing the enzymes by addition of metals. Many functional heavy metals have been dis- 28 Introduction covered by this method since 1938 and it seems to become increasingly evident that heavy metals contribute to the action of most enzymes. Obviously the long polemics directed against the first functional heavy metal that was discovered — the iron of iron oxygenase — was an attack that could not have been more unjustified. The chemical mechanism of the function of metals in the metallo-enzymes of the second type is still unknown. One of the mysteries of enzyme chemistry is the fact that of the zymohexases we have crystallized, yeast zymohexase is a metallo- enzyme but muscle zymohexase is not. VII. Respiration {19) Since the active groups of the oxidizing and reducing enzymes and their chain reactions have been discovered", [1] 0-2 — iron oxygenase -> cytochrome — flavin — * nicotinamide [2] O2 -> copper oxygenase — orthoquinone -»■ nicotinamide the question has been discussed whether these pathways provide a complete explanation for the mechanism of biological oxidation and reduction or whether they are valid for only a limited number of substrata — for the initial attemps at in vitro oxidation by enzymes of, for instance, fatty acids and the so-easily-com- bustible acetic acid, were unsuccessful. Coenzyme A, which Lipmann8 discovered in 1945, supplied the answer to this question. In 1951 Lynen9 discovered that coenzyme A acts through its SH group, which forms thioesters with organic acids and thereby makes the acids capable of reacting with the components of the enzyme chains. Flavoproteins dehydrogenate Coat bound fatty acids10; the //-hydroxy acids thus formed are dehydrogenated to keto acids by pyridine proteins. The latter dehydrogenate the CoA-bound pyruvic acid to acetyl CoA, whose acetic acid constituent then combines with oxalacetic acid to form citric acid: COOH COOH CH3COOH H 1 CO 1 | OH C \ xCH2COOH CH2 CH2 COOH COOH In the citric acid cycle discovered by H. A. Krebs11, the equivalent of the acetic acid is oxidized to carbon dioxide and water, and at the same time oxalacetic acid is formed once more. The enzymes, which effect these oxidations within the cycle — the oxidation of isocitric acid, ketoglutaric acid, succinic acid, and malic acid — are none other than the pyridine proteins, flavoproteins, and heme proteins. Many similar examples could be cited today. Indeed, all the biological hydro- genations and dehydrogenations that we know of are effected by reactions of members of our enzymatic chains. Thus they provide the universal and complete Solution to the problem of biological oxidation and reduction. Introduction 29 If we ask why Substrates are "activated" by combination with coenzyme A, I should like to point out that coenzyme A contains triply phosphorylated adenine, which also occurs in triphosphopyridine nucleotide and, serves to bind the nucleotide to the enzyme proteins. I should mention further that phosphate is generally the group that binds Substrates and coenzymes to the enzyme proteins, as has been discovered by a comparison, for instance, of the reactivities of phospho- rylated and nonphosphorylated glyceraldehyde or phosphorylated and nonphos- phorylated lactoflavin. The idea thus readily suggests itself that the coenzyme A fixation may be interpreted as a phosphorylation which proceeds, although not directly, via the pantothenic bridge. This is supported by the fact that Sub- strates such as glucose phosphate or triosephosphate, which already are phos- phorylated, do not require coenzyme A. On the other hand, it is true that there are nonphosphorylated Substrates, such as acetaldehyde and pyruvic acid, which combine with enzyme proteins and are subsequently hydrogenated by nicotinamide without any intermediary action on the part of coenzyme A. In the field of respiration, the crystallization of the prosthetic group of iron oxygenase, the "cytohemin", constituted significant progress (13, 24, 25, 26). This substance which in the living world transfers the oxygen thus was chemically isolated and became accessible to chemical investigation. Cytohemin, like blood hemin, contains two propionic acids; unlike blood hemin, it contains a formyl group but, only one vinyl group. Also unlike blood hemin, cytohemin contains a side chain having a molecular weight of the order of magnitude of 200; this side chain is responsible for its lower contents of iron and nitrogen as compared to the iron and nitrogen contents of the blood hemin. A comparison of the elementary analyses of these two chlorferri Compounds yielded the following percentages : C H N Fe Cl Cytohemin 64.47 6,79 6.50 6.42 4.20 Blood hemin 62.63 4.94 8.59 8.40 5.43 On fusion with resorcinol, cytohemin yields a "deuterohemin" that forms beau- tiful crystals and that contains three free ß positions. S. F. MacDonald1'2, a Student of Hans Fischer, who took over the study of this important substance, proposes the following structure for "cytodeuterohemin" : CH3 H CH3 H I H propionic acid propionic acid CH3 The structure of the quinone in the enzymatic chain [2] (above) is still unknown, That of dehydrogenated chlorogenic acid, an ester formed by 3,4-dihydrocin- namic acid and quinic acid, is open to question, at least in the case of plants. Martius13 assumes that naphthoquinone proteins are generally members of the enzymatic chains. 30 Introduction VIII. Fermentation (2) If Arthur Harden14 is right, that the oxido-reduction offer mentations is the main reaction of fermentations because by the oxidation-reduction the meaning of the fermentations is fulfilled, then 1939 was the year the chemical mechanism of fer- mentations was discovered. In 1939 at Dahlem the chemical reactions were dis- covered15 by which triosephosphate is oxidized to pyruvic acid and pyruvic acid is reduced to lactic acid : (I) 3-Phosphoglyceraldehyde + H3PO4 =^ 1,3-diphosphoglyceraldehyde (II) 1,3-Diphosphoglyceraldehyde + DPN ^ 1,3-diphosphoglyceric acid DPNHo (III) 3-Phosphoglyceraldehyde + H3PO4 r DPN = (Balance) 1,3-Diphosphoglyceric acid -f DPNHo 1,3-Diphosphoglyceric acid is then dephosphorylated by ADP (adenosine diphos- phate) to pyruvic acid, and the latter is hydrogenated to lactic acid by the DPNHo formed in reaction (II). All these reactions occur in vitro upon addition of the pure Substrate and the crystallized enzymes to one another. 1,3-Diphosphoglyceraldehyde is the only one of these Compounds which we did not isolate, because 1,3-diphosphoglyceraldehyde in aqueous Solution hydro- lyzes to 3-phosphoglyceraldehyde and H3PO4. Thus, in the entire chemical mechanism of fermentations, there remained in 1939 one single sustance about which it was possible to quarrel. Therefore began the long argument about 1,3-diphosphoglyceraldehyde. Meyerhof initiated the fight in 1943 and Lipmann and many distinguished biochemists followed suit. Because the question at issue — the mechanism of fer- mentations— was a biochemical problem that had resisted Solution for a hundred years, the course of this controversy may be described. The fact that needed explanation was that 3-phosphoglyceraldehyde was dehy- drogenated only in the presence of phosphate and that, after dehydrogenation, the added phosphoric acid turned up in the 1-position of the 3-phosphoglyceric acid. No one could come to any conclusion other than that the aldehyde was first phosphorylated in the 1-position R R C<^ + H3PO4 5* C^OH ^O XOP03H2 and that the aldehydic group was subsequently dehydrogenated to a carboxyl group by means of DPN (disphosphopyridine nucleotide). Because of earlier experimental results, this Interpretation Struck us as particularly plausible. In purely chemical experiments we had found16 that the aldehyde group of the gly- ceraldehyde is activated by the addition of phosphate to the neutral aqueous Solu- tion without enzymes to such a degree that it is oxidized to the carboxyl group by molecular oxygen. Dorothy Needham17 later made the Observation that DPN can replace the oxygen in this reaction. Thus, in the chemical model DPN actually de- hydrogenates glyceraldehyde, if phosphate is added to the neutral aqueous Solution. Introduction 31 The pole micists pointed to the possibility that in the case of biological dehydrc- genation by DPN, as opposed to chemical dehydrogenation, the 3-phosphogly- ceraldehyde bound to the enzyme protein, be dehydrogenated by DPN; and that the phosphoric acid reacts only afterwards, displacing the protein from the glyceric acid by means of a process that was called "phosphorolysis". In the meantime, a decisive experiment was made. If the theory of phosphoroly- sis was correct, the initial velocity of dehydrogenation had to be independent of the phosphate concentration; according to our equations, however, the phosphate had to exert its influence from the beginning. The experiment showed that the initial velocity depends on the phosphate concentration, as required by our equations. This is how the last problem of the chemical mechanism of fermentations was solved in 1957 {23, 24). IX. Cancer cells The transition from tumors to single Cancer cells constituted the most essential improvement in this field since 1945. 1. Ascites Carcinoma cells (17, 22, 35, 58) Our first unicellular material consisted of the cells of the Ehrlich ascitic Carcinoma of mice. These Cancer cells were available in large amounts in the form of stable, easily centrifuged, and almost pure suspensions. Thus, tissue from the original organ, connective tissue, and necrotic tissue no longer constituted sources of error in measurements of metabolic rate, and fermentation rates rose to values two- to three-times higher than those found earlier in the case of even the purest tumors. The two-vessel method, which requires the use of equal amounts of identical cell material in both vessels, only then became truly applicable to Cancer cells; quantitative experimentation with Cancer cells only then became possible, a progress comparable to the transition from mixtures to chemically pure sub- stances in chemistry. 2. Earle cells Cancer cells as suspensions of single cells may be obtained by the method of W. Earle who uses a shaking machine to agitate Cancer cells (contained in large bottles) over a period of years. Like Goldblatt and Cameron in experiments with the Carrel method, Earle succeeded with his new method to transform normal cells to Cancer cells. Two lines of Cancer cells were of special interest for use in metabolism tests : These two lines, one of high virulence and the other one of low virulence, had separated spontaneously from a culture Earle had prepared from a single normal cell. Dean Burk and his collaborators, Wood, Hunter and Hobby, have measured 32 Introduction the metabolic rates of these two lines. In the highly virulent line they found extensive fermentation and limited respiration ; in the line of low virulence, limited fermentation and extensive respiration. Anyone who, until then, may have doubted the significance of the fermentation of tumors, could no longer do so (36). 3. Cells according to Dulbecco-Vogt The fastest technique to prepare large amounts of single cells from body cells that are capable of growth is the method of Dulbecco-Vogt, in which a Suspension of animal tissues is made by addition of a dilute Solution of trypsin. We have measured the metabolism of such cell suspensions immediately after preparation and after in vitro growth and have found that the purely aerobic meta- bolism of rabbit kidney cells and of chick embryonic cells changes during growth in vitro into the fermentation metabolism of Cancer cells. In the case of embryonic cells this conversion proceeds with special rapidity. Within one to two cell divi- sions their metabolism changes to the fully developed metabolism of Cancer cells, characterized by extensive anaerobic fermentation, limited respiration, and, conse- quently, extensive aerobic fermentation. Since a large part of the inoculum in the Petri dishes grows in the in vitro culture and since the metabolism changed after only a few cell divisions, the theory of carcinogenesis by selection (in which all of us believed for many years) must be definitely and totally abandoned. We interpret this readiness for anaerobiosis by the long anaerobic history of living matter, a history which evidently the genes have not yet forgotten (59, 61, 63, 67, 71, 76).* The anaerobic past of living matter may also explain the anaerobic fermentation of embryonic cells. This fermentation was discovered soon after that of the Cancer cells but has no physiological significance, because the extensive respiration of embryonic cells always eliminates any anaerobic fermentation by them in the body. The most striking property of this "latent" fermentation is that it is especially strong in early development but then decreases rapidly, for example, to one-fourth of its initial value within a few days. This is the behavior of properties that were necessary in phylogenesis but that later became superfluous. X. Effect of X-rays on Cancer cells If Cancer cells and embryonic cells are irradiated with x-rays under otherwise equal conditions, and if the decrease in metabolism caused by the rays is measured, the reduction in the metabolism of Cancer cells is found to be greater than in the case * 1961 Addition. In the meantime, we have discovered that the metabolism characteristic of Cancer is produced in vitro by a substance present in added calf serum ; this substance can be removed from the calf serum by addition of alumi- num hydroxide. Indeed, embryonic cells may now be grown in vitro, with or without fermentation, depending on whether the serum is treated with aluminum hydroxide or not. Introduction 33 of embryonic cells. Since Cancer cells contain less catalase than normal cells, and since hydrogen peroxide is produced in aqueous Solutions lipon irradiation with x- rays, the obvious explanation was to regard the effect of x-rays on metabolism as a process of hydrogen peroxide poisoning. In order to test this theory we developed the manometric x-ray actinometer (analogous to our actinometer for visible light), in which the test cells are first shaken and then irradiated and in which a Fricke's Solution of ferrous sulfate is subse- quently shaken and irradiated under the same conditions. As a result of the radi- ation, ferrous iron is transformed into ferric iron. If, in addition to making the metabolic determination, one assays the amount of iron oxidized in each experi- ment, the effective x-ray dosage becomes known in each instance, regardless of complicated geometrical conditions. In order to find the connection between the radiation effect and hydrogen perox- ide, we added catalase to the cells during irradiation; this proved to diminish the radiation effect. Or, better still, we irradiated the Solutions without the cells, then added catalase to the irradiated Solutions, and then added the cells. We found that the irradiated Solutions lowered the fermentation of Cancer cells almost like irradiation; after the addition of catalase, however, the irradiated Solutions no longer affected the fermentation of Cancer cells. Studies of this kind, which were extended to the formation of methemoglobin by x-rays showed that it is essentially the hydrogen peroxide formed that inhibits the fermentation of dilute suspensions of Cancer cells during irradiation, rather than the H atoms and OH radicals, which, according to Joseph Weiss, are the primary degradation products of water. Thus, the reactions in which hydrogen peroxide is formed during irradiation 2 OH = H2O2 2 H + 02 = H2O2 obviously proceed more rapidly under our experimental conditions than do reac- tions of H and OH with fermentation enzymes (60, 63, 64, 65, 66, 82). XI. Photosynthesis* 1. Experimental material We no longer use continuous light to cultivate Chlorella for yield determinations ; since 1956, we have used fluctuating light, whose light-dark time intervals corre- spond to the day, night, and twilight periods. This, above all, but also other meas- ures are responsible for the fact that good quantum yields are now reproducible any time at will, and explains failures in earlier times. * 1961 Addition. In 1960 "Problems in Photosynthesis" by W. Bladergroen was published in the American Lecture Series (Charles C Thomas, Publisher, Springfield, 111.). This is the first constructive presentation of this field of investi- gations that has appeared in many decades. It does not detail theories but describes experiments and techniques. 3 Warburg, Zellphysiologie 34 Introduction 2. Blue-green light In 1955 we discovered that blue-green light acts as a catalyst in photosynthesis. Other very pure spectral regions of visible light are either ineffective or only of very poor effectiveness in photosynthesis, unless small amounts of blue-green light are added. Since that time, blue-green light has always been added in measure- ments of the quantum requirement. The action spectrum of blue-green light yielded a peak at approximately 458 mit and is probably the absorption spectrum of an enzyme. The determination of this action spectrum is one of the more difficult tasks of radiation-physics, since it requires that each of two light beams of different color is split into two parts; also that four beams are bolometrically adjusted for each point of the action spectrum. These Operations can be carried out only in a well equipped radiation laboratory. 3. Quantum Requirement of Photosynthesis in Chlorella* When the quantum requirement of photosynthesis was newly determined in 1960, the progress in cell cultivation, radiation and absorption measurement, and mano- metry were taken into consideration as well as the necessity of adding blue-green light of low intensities. Experiments can now last as long as desired and produce manometric changes (almost exclusively in the region of positive pressure) of any desired magnitude. In addition, one has the choice of the two-vessel method — pro- vided the equipment necessary for Splitting the light beams is available — or a very simple one-vessel method, in which the carbon dioxide pressure is kept constant by carbonate mixtures separated from the cells. The following are examples of determinations we made by means of the new one-vessel method, when the incident light was red and the respiration was com- pensated for with blue-green light (see page 582) : C02 Pressure [ 1 Quanta (mm Brodie) cp O2 8 21 31 6.9 75 3.6 140 2.83 202 2.75 These figures show how remarkably the quantum requirement changes with the carbon dioxide pressure and that the limiting value of the quantum requirement is reached only when the carbon dioxide pressure exceeds 200 mm Brodie. The limiting value is 1 - = 2.75
24o der Phosphobrenztraubensäure (bei pH 7,4) : 4,0 • 103 in die Gleichung — = eß ■ c • d M.ole eingesetzt, in der c die Konzentration der lichtabsorbierenden Substanz in — r- bedeutet und d die Schichtdecke der Lösung in cm, die in auf i schwächt. Gemäß dieser Gleichung ist die Konzentration c der lichtabsorbierenden Sub- stanz In* ß-d IL Kinetik Wenn es auch für die Anwendung der Teste nicht notwendig war, so hat es sich doch bei der Ausarbeitung der Teste ergeben, daß die Kinetik der Fermentreak- tionen untersucht wurde. Die Ergebnisse sind wegen ihrer Einfachheit interessant. Wir gehen dabei von zwei vereinfachenden Bedingungen aus : daß die Ferment- proteine mit den Reaktionsteilnehmern — den prosthetischen Gruppen und den Substraten — gesättigt sind; und daß die verschwindenden und die entstehenden Stoffe gleich fest von den Fermentproteinen gebunden werden. Die erste Be- - cm- * Zusatz 1961. Wir rechnen heute mit ß34o = 1,42 • 10" — — = 14,2 Mole //Mole cm- Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 51 dingung ist, da die Bindungen fest sind, durch geeignete Wahl der Konzentrationen immer leicht zu erfüllen. Auf die zweite Bedingung hat man keinen Einfluß. Merk- würdigerweise aber ist sie so oft erfüllt, daß sie einen physiologischen Sinn zu haben scheint. Wenn nun nur die an das Ferment-Protein gebundenen Substanzen chemisch reagieren, so ist die Anfangsgeschwindigkeit in jedem Fall proportional der Pro- tein-Konzentration F , de , „ - — = ki • F [0] d t Da aber im Fortschritt der Reaktionen die Reaktionsprodukte entstehen, die gleichfalls von dem Protein gebunden werden, so nimmt im Fortschritt der Reak- tionen die Zahl der mit dem Ausgangsstoff verbundenen Proteinmoleküle ab und ist zum Beispiel bei halbem Umsatz auf die Hälfte gesunken. Allgemein ist der Q Bruchteil der mit dem Ausgangsstoff verbundenen Proteinmoleküle F • — 3 wenn C die Anfangskonzentration und c die Konzentration zur Zeit t bedeutet; so daß also für den gesamten Verlauf der Reaktion die Differentialgleichung gilt: de c dt C Ist die Reaktion umkehrbar, so ist die Rückreaktion von der Hinreaktion abzu- ziehen und wir erhalten : de c C — c ki • F • — — k2 • F • [2] dt C c wo — der Bruchteil der Proteinmoleküle ist, der mit dem Ausgangsstoff verbunden C — c ist und — — — der Bruchteil der Proteinmoleküle, der mit dem Reaktionsprodukt verbunden ist. Hat man nicht einen, sondern zwei Reaktionsteilnehmer, deren Konzentration sich im Verlauf der Reaktion ändert, so hat man, wenn die Ausgangskonzentration der beiden Reaktionsteilnehmer gleich C ist, anstatt [1] ki • F • (4T ■ [31 dt \C wo (— den Bruchteil der Proteinmoleküle bedeutet, der mit den beiden Ausgangs Stoffen verbunden ist. Setzt man in den Gleichungen [1] bis [3] c = c so geht jede der 3 Gleichungen über in d t das heißt, die Anfangsgeschwindigkeit ist immer unabhängig von C und nur ab- hängig von der Konzentration des Ferment-Proteins F. Setzt man in den Gleichungen [1] und [2] ki ' F _ , k2 • F „ r/1, — = Ri und — = = Ro [4] 52 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste und in Gleichung [3] so kann man schreiben : statt [1] statt [2] statt [3] ki • F C2 de dt de dt de R, dt = Ri • c Ri • c — R2 (C — c) Ri • c2 [5] [la] [2a] [3a] wo die Größen R die Bedeutung von Geschwindigkeitskonstanten haben und es nach der Form der Gleichungen scheint, als ob die Reaktionsteilnehmer nach dem Massenwirkungsgesetz in der Lösung reagierten. Variiert man aber C, dann zeigt sich, daß dies ein Irrtum ist. Denn die Anfangsgeschwindigkeiten bleiben kon- stant, während sie sich nach dem Massenwirkungsgesetz mit C ändern müßten, und die Größen R erweisen sich als umgekehrt proportional C oder C2, während sie bei Variationen von C konstant bleiben müßten, wenn sie Geschwindigkeits- konstanten im Sinn des Massenwirkungsgesetzes wären. Hat man R aus dem zeitlichen Verlauf einer Fermentreaktion in reziproken Minuten berechnet, so erhält man die Geschwindigkeitskonstanten k1 und k2, in- dem man F und C in die Gleichungen [4] oder [5] einsetzt. Drückt man dabei F und C in Molen/Volumeinheiten aus, so erhält k die Dimension Mole umgesetzter Substanz Mole Protein Minuten und wird deshalb im folgenden auch als die „molare Wirksamkeit" = W molar eines Ferments bezeichnet. Zum Schluß sei bemerkt, daß für jede der 3 Differentialgleichungen [1], [2] und [3] ausführliche experimentelle Belege vorliegen, insbesondere für Gleichung [1] Biochem. Z. 282, 206 (1935), für Gleichung [2] Biochem. Z. 310, 384 (1942), für Gleichung [3] Biochem. Z. 303, 40 (1939). Aus diesen Belegen wird man erkennen, daß die untersuchten Fermentreak- tionen strenger gesetzmäßig verlaufen, als die meisten einfachen chemischen Reaktionen; und daß es keine Methoden gibt, die für kinetische Untersuchungen geeigneter wären, als die ontisrhen Teste. III. Spezifizität Wenn bei der Gärung Pyridinnukleotid Wasserstoff überträgt oder wenn Adenin- nukleotid Phosphorsäure überträgt, so hätte es so sein können, daß sich die Über- tragung an einem für die Übertragung spezifischen Protein abspielte. Doch hat sich gezeigt, daß die Spezifizität noch weitgehender ist. Wenn Pyridinnukleotid bei der Gärung von dem diphosphorylierten Glycerinaldehyd an dem Protein des oxy- dierenden Gärungsferments hydriert worden ist, so wird es an einem andern Pro- tein, dem Protein des reduzierenden Gärungsferments, durch Brenztraubensäure Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 53 wieder dehydriert; und wenn Adenosindiphosphat an dem einen Protein durch Phosphobrenztraubensäure phosphoryliert worden ist, so wird es an einem andern Protein durch Hexose wieder dephosphoryliert. Offenbar ist dieser höhere Grad von Spezifizität nur möglich, wenn die prosthetischen Gruppen der wasserstoff- oder phosphatübertragenden Fermente nicht fest, sondern dissociierend gebunden sind. Dies ist die Theorie der „Kofermente", die ich 1935 aufgestellt habe und die heute allgemein angenommen ist. Anmerkung: Wenn jeder Teil Vorgang der Gärung durch ein spezifisches Ferment bewirkt wird, so folgt aus dieser physiologischen Spezifizität keineswegs, daß die spezifischen Gärungsfermente nicht auch unphysiologische chemische Reaktionen hervorrufen können. Die Oxydation des Glycerinaldehyds zu Glycerinsäure durch das oxydierende Gärungsferment, die Reduktion des Dioxyacetons zu Glycerin durch das reduzierende Gärungsferment sind Beispiele4 unphysio- logischer Reaktionen, die zwar 1000- bis lOOOOmal langsamer verlaufen als die physiologischen Gärungsreaktionen, aber bei großen Konzentrationen an Fermenten doch gut meßbar sind. Als weitere und allgemeinere Beispiele könnte man die pharmakologischen Wirkungen anführen. Was aber ist die Ursache der physiologischen Spezifizität der Fermente ? Ist die Bindung der Substrate spezifisch oder ist die chemische Reaktion der gebundenen Substrate spezifisch? Wir haben diese Frage geprüft, indem wir zu den Testen physiologische, aber nichtreagierende Substanzen zusetzten, zum Beispiel Brenztraubensäure zum Test des oxydierenden Gärungsferments und 3-Phosphoglycerinaldehyd zum Test des reduzierenden Gärungsferments; oder Triphospho-Pyridinnukleotid zum Test des oxydierenden Gärungsferments. Wären diese Substanzen gebunden worden, so hätten sie die Teste durch Verdrängung der Reaktionsteilnehmer hemmen müssen. Wir fanden in keinem Fall eine Hemmung und schließen daraus, daß die Ursache der spezifischen Wirkung die spezifische Bindung ist. Dieses Ergebnis ist methodisch und theoretisch wichtig. In einem ncch so kom- plizierten Gemisch von Substanzen und prothetischen Gruppen wird jede Fer- mentreaktion so ablaufen, als ob alle an ihr nicht teilnehmenden Stoffe nicht vor- handenwären. So kann im Leben keine physiologische Fermentreaktion eine andere stören. IV. Beschreibung der optischen Teste In der folgenden Liste der Teste stimmen die Nummern mit der Fermentliste in der Einleitung überein. Dort findet man auch die Gleichungen der Testreaktionen die deshalb in diesem Kapitel nicht wiederholt werden. 1. Zymohexase^ Hexosediphosphat, Pyridinnukleotid, Arsensäure und oxydierendes Gärungsfer- ment sind die Komponenten des Tests, der ohne Zymohexase reaktionslos ist. Gibt man Zymohexase hinzu, so entsteht Triosephosphat, dessen Aldoform durch das oxydierende Gärungsferment zu Phosphoglyzerinsäure oxydiert wird, während gleichzeitig Dihydropyridinnukleotid, also Lichtabsorption bei 340 m// entsteht. Ist dabei das oxydierende Gärungsferment im Überschuß, so ist die Spaltung des Hexosediphosphats geschwindigkeitsbestimmend und die Geschwindigkeit, mit 54 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste der der Logarithmus der Lichtschwächung zunimmt, ist der Konzentration der Zymohexase proportional. Das Gesagte gilt für Muskel-Zymohexase. Ist das zu bestimmende Ferment Hefe-Zymohexase, so ist zu den Komponenten des Test noch Zinksulfat und Cy- stein hinzuzufügen, wodurch eine sehr kleine, aber definierte Konzentration an freiem Zinksalz erzeugt wird. 2. Isomerase6 Zu einer Lösung von Phosphat, Phosphoglycerinaldehyd und Pyridinnukleotid gibt man soviel Protein des oxydierenden Gärungsferments, daß sich das Gleich- gewicht der Oxydationsreaktion Phosphat Phosphoglycerinaldehyd Pyridinnukleotid 1,3-Diphosphoglycerinsäure Dihydropyridinnukleotid schnell einstellt. Da bei der Reaktion hydriertes Pyridinnukleotid entsteht, so ent- steht Lichtabsorption bei 340 m//, die wir im Gleichgewicht messen. Geben wir dann Isomerase zu der Gleichgewichts-Lösung, so wird Phospho- glycerinaldehyd zu Phosphodioxyaceton isomerisiert, das Gleichgewicht wird ge- stört und es muß hydriertes Pyridinnukleotid zurückreagieren, also Lichtabsorption bei 340 m// verschwinden, bis zur Einstellung eines neuen Gleichgewichts. Aus der Geschwindigkeit, mit der das erste Gleichgewicht in das zweite Gleichgewicht übergeht, kann man die Wirksamkeit der zugefügten Isomerase berechnen. 3. Oxydierendes Gärungsferment7 Zum Nachweis und zur Messung des oxydierenden Gärungsferments benutzen wir nicht die physiologische, sondern die irreversible Oxydationsreaktion, bei der (bei Gegenwart von Arsensäure) 3-Phosphoglycerinaldehyd zu 3-Phosphoglycerin- säure oxydiert wird. Es sind also die Komponenten des Tests 3-Phosphoglycerinaldehyd, Pyri- dinnukleotid und Arsensäure. Gibt man das Protein des oxydierenden Ferments hinzu, so beginnt die Reaktion und es entsteht Dihydropyridinnukleotid, also Licht- absorption bei 340 rn.fi. Zu beachten ist bei dem Test, daß das oxydierende Gärungsferment durch sehr kleine Mengen von Schwermetallsalzen geschädigt wird. Z. B. hemmen die kleinen Mengen Kupfersalz, die im Blutserum normalerweise vorkommen, das Ferment schon sehr erheblich. Es ist deshalb zweckmäßig, bei dem Test Komplexbildner zuzusetzen, von denen sich Pyrophosphat besonders bewährt hat. Pyrophosphat hemmt das Ferment nicht nur nicht, sondern es fördert die Wirkung durch Be- seitigung hemmender Schwermetallsalze. Wenn aber das oxydierende Ferment bei den optischen Testen als Hilfsferment zur Bestimmung anderer Fermente benutzt wird, so kann man wegen der Kom- plexbildner in Schwierigkeiten geraten, zum Beispiel wenn die andern Fermente zu ihrer Wirkung Magnesium oder Zink oder Eisen benötigen. Dann würde durch den Komplexbildner das oxydierende Ferment zwar gefördert, aber die zu be- stimmenden Fermente würden gehemmt. In dem Test zur Bestimmung der Hefe- Zymohexase ist diese Schwierigkeit überwunden worden, indem wir Cystein als Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 55 Komplexbildner und außerdem Zinksulfat zusetzten; genug Zink, um die Hefe- Zymohexase zu aktivieren, aber so wenig Zink, daß das oxydierende Ferment, das bei diesem Test Hilfsferment ist, nicht geschädigt wurde. Die Spanne zwischen aktivierender und vergiftender Konzentration des Zinks war dabei durchaus nicht, wie man hätte befürchten können, eng; sondern lOmal soviel Zink, als zur Akti- vierung der Zymohexase notwendig war, vergiftete das oxydierende Ferment nicht. Doch ist bei der Verwendung von Cystein als Komplexbildner Vorsicht erfor- derlich, weil Cystein mit 3-Phosphoglycerinaldehyd unter Bildung von Thioace- talen oder Thiohalbacetalen reagiert. Trotzdem kann man beim Zymohexasetest Cystein als Komplexbildner verwenden, da hier der 3-Phosphoglycerinaldehyd in statu nascendi durch das oxydierende Ferment weggefangen wird; aber man könnte Cystein beim Test des oxydierenden Gärungsferments nicht verwenden, weil hier der Phosphoglycerinaldehyd, der hier zu den Komponenten des Tests gehört, Zeit hätte, mit dem Cystein zu reagieren. 4. Erstes dephosphorylierendes Ferment Wie beim Isomerase-Test erzeugt man zunächst das Gleichgewicht der Oxydations- reaktion. Anders als beim Isomerase-Test setzt man dabei so wenig Phosphat zu, daß nur wenig hydriertes Pyridinnukleotid, also nur wenig Lichtabsorption bei 340 mit entsteht. Entfernt man aber die 1,3-Diphosphoglycerinsäure aus der Lö- sung, indem man sie zu 3-Phosphoglycerinsäure dephosphoryliert, so geht die Oxydationsreaktion von links nach rechts weiter und es entsteht mehr hydriertes Pyridinnukleotid, also mehr Lichtabsorption bei 340 m//. Die Komponenten des Tests sind demnach: 3-Phosphoglycerinaldehyd, Pyri- dinnukleotid, Phosphat, Magnesiumsulfat und Adenosindiphosphat. Zunächst setzt man das Protein des oxydierenden Gärungsferments zu und mißt die nun auf- tretende Lichtabsorption bei 340 m/t. Hat man genug Protein zugesetzt, so wird diese Absorption sehr schnell (in einigen Sekunden) konstant. Fügt man dann das Protein des dephosphorylierenden Ferments zu, so nimmt die Lichtabsorption bei 340 m// zu, und aus der Geschwindigkeit dieser Zunahme kann man die Wirksam- keit des dephosphorylierenden Ferments berechnen. Mit Hilfe dieses Tests ist das Protein des ersten dephosphorylierenden Ferments unter meiner Leitung von Th. Bücher73 aus Hefe isoliert und kristallisiert worden. 5. Mutase8 Zu einer Lösung von 2-Phosphoglycerinsäure geben wir Magnesiumsulfat und soviel Enolase-Protein, daß sich das Gleichgewicht der Reaktion 2-Phosphoglycerinsäure ^ Phosphobrenztraubensäure + H^O schnell einstellt. Da die Phosphobrenztraubensäure (vergl. Test 6) bei 240 mu absorbiert, so entsteht bei der Reaktion Lichtabsorption bei 240 m/i, die wir im Gleichgewicht messen. Fügen wir dann Mutase zu der Lösung, so wird das Gleichgewicht durch die Reaktion 2-Phosphoglycerinsäure ü 3-Phosphoglycerinsäure 56 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste gestört, und Phosphobrenztraubensäure reagiert zu 2-Phosphoglycerinsäure zu- rück, das heißt, es verschwindet Lichtabsorption bei 240 m/i. Aus der Geschwindig- keit, mit der diese Absorption zurückgeht, kann man die Wirksamkeit der Mutase berechnen. 6. Enolase8 Gibt man zu einer Lösung von 2-Phosphoglycerinsäure und Magnesiumsulfat Enolase-Protein, so entsteht Phosphobrenztraubensäure, die als Enolverbindung bei 240 m// absorbiert. Aus der Geschwindigkeit, mit der diese Absorption zu- nimmt, kann man die Wirksamkeit der Enolase berechnen. Dies ist der einfachste unsrer optischen Teste. Doch hat er den Nachteil der Kurzwelligkeit. Bei 240 m// absorbieren die Nukleinsäuren, die Proteine und viele andere Stoffe und der Betrag dieser Absorptionen ist in jedem Fall durch Messun- gen zur Zeit Null zu bestimmen. Bei Testen, die auf der Dihydropyridin-Absorp- tion beruhen, sind derartige Nullpunktmessungen überflüssig, da Lichtabsorp- tionen im langwelligen ultraviolett bei 340 m// gegen die Dihydropyridin- Absorp- tion fast immer zu vernachlässigen sind. 7. Zweites dephosphorylierendes Ferment Das Ferment, das die Phosphobrenztraubensäure dephosphoryliert, kann man auf zweierlei Art optisch bestimmen, bei 240 m// und bei 340 mu. Bei 240 m/i. Die Komponenten des Tests sind: Phosphobrenztraubensäure, Magnesiumsulfat und Adenosindiphosphat. Gibt man das Protein des dephospho- rylierenden Ferments hinzu, so verschwindet Phosphobrenztraubensäure, die voll- ständig enolisiert ist, und an ihre Stelle tritt Brenztraubensäure, die bei neutraler Reaktion nur zu einem kleinen Teil enolisiert ist. Es verschwindet also Licht- absorption bei 240 m/t ; und aus der Geschwindigkeit, mit der dies geschieht, kann man die Wirksamkeit des dephosphorylierenden Ferments berechnen. Bei dem Test stört der hohe Nullwert der Lichtabsorption, hervorgerufen durch das Adenin des Adenosindiphosphats. Adenin absorbiert bei 240 m/u etwa doppelt so stark wie Phosphobrenztraubensäure. Bei 340 m//. Die Komponenten des Tests sind: Phosphobrenztraubensäure, Magnesiumsulfat, Adenosindiphosphat, Dihydropyridinnukleotid und Protein des reduzierenden Gärungsferments. Dieses Gemisch ist reaktionslos. Fügt man aber das Protein des dephosphorylierenden Ferments hinzu, so entsteht Brenz- traubensäure, die sofort von dem reduzierenden Ferment zu Milchsäure hydriert wird. Es verschwindet also Lichtabsorption bei 340 m//,und aus der Geschwindig- keit, mit der dies geschieht, kann man die Wirksamkeit des dephosphorylierenden Ferments berechnen. Mit Hilfe dieses Tests hat Negelein unter meiner Leitung das Protein des zweiten dephosphorylierenden Ferments aus Hefe isoliert und kristallisiert. 8. Reduzierendes Gärungsferment9 Brenztraubensäure und Dihydropyridinnukleotid sind die Komponenten des Tests, bei dem hydriertes Pyridinnukleotid, also Lichtabsorption bei 340 m/t, verschwindet. Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 57 Die Testreaktion ist zwar reversibel, aber sie verläuft, ihrem Zweck bei der Gärung entsprechend fast vollständig in der Richtung der Hydrierung der Brenztrauben- säure. Geht man von äquivalenten Mengen Brenztraubensäure und hydriertem Pyridinnukleotid aus, so macht die Reaktion erst halt, wenn mehr als 99% der Brenztraubensäure zu Milchsäure hydriert worden sind. Die Gleichgewichts- konstante der Reaktion ist 6 x 10~5 bei 22° und neutraler Reaktion. Mit Hilfe des optischen Tests sind die Proteine der reduzierenden Gärungs- fermente aus Muskeln und aus Tumoren der Ratte isoliert worden. Das Protein des reduzierenden Gärungsferment aus Hefe, dessen Substrat Acetaldehyd ist, kann Proteine, deren Substrat Brenztraubensäure ist, nicht ersetzen. 9. Adenosintriphosphata.se Gibt man zu Phosphobrenztraubensäure eine kleine Menge Adenosindiphosphat und das Protein des zweiten dephosphorylierenden Ferments, so wird eine kleine, dem Adenosindiphosphat äquivalente Menge Phosphobrenztraubensäure dephos- phoryliert, und es bildet sich eine kleine Menge Adenosintriphosphat. Fügt man dann Adenosintriphosphatase hinzu, so wird das Triphosphat zu Diphosphat und freier Phosphorsäure gespalten, und es kann neue Phosphobrenztraubensäure dephosphoryliert werden, bis schließlich die gesamte Phosphobrenztraubensäure in Brenztraubensäure und freie Phosphorsäure gespalten worden ist. Beobachten wir diese Vorgänge durch Absorptionsmessungen bei 240 mu, so verschwindet zunächst, da nur wenig Phosphobrenztraubensäure verschwindet, nur wenig Lichtabsorption. Nach Zusatz der Adenosintriphosphatase aber ver- schwindet die gesamte von der Phosphobrenztraubensäure herrührende Licht- absorption, und aus der Geschwindigkeit, mit der dies geschieht, kann man die Wirksamkeit der Adenosintriphosphatase berechnen. Es sei hervorgehoben, daß hier, anders als bei Test 7, die Absorption des Adenins des Adenosinphosphats nicht stört, da hier das Adenosinphosphat Katalysator und seine Konzentration so klein ist, daß sie optisch zu vernachlässigen ist. 10. Erstes phosphorylierendes Ferment Es bleiben noch die Reaktionen, die den Kreislauf des gebundenen Phosphats schließen; die stufenweise Phosphorylierung der Hexose durch Adenosintriphos- phat zu Hexose-6-Phosphat und Hexosediphosphat. Der optische Nachweis der bei- den Reaktionen gelang uns bisher nur für Lebedewsaft, aber nicht für Muskelsaft. Die Komponenten des ersten Tests waren Glukose, Adenosintriphosphat, Magnesiumsulfat und zwei gärungsfremde Substanzen, Triphospho-Pyridin- nukleotid und ein Protein, das ich, ehe wir die Bindung der Kofermente an die Proteine entdeckt hatten, „Zwischenferment" genannt habe. Es ist die Protein- Komponente des Ferments, das 6-Phospho-Glukose zu 6-Phosphohexonsäure oxydiert. Ohne das Protein des ersten phosphorylierenden Ferments ist der Test reak- tionslos. Fügt man aber das Protein hinzu, so entsteht 6-Phospho-Glukose, die sofort zu 6-Phosphohexonsäure oxydiert wird: Phospho-Glukose + Pyridinnukleotid + HoO = Phosphohexonsäure — Dihydropyridinnukleotid 58 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste Es entsteht also, wenn die Glukose zu Monophosphat phosphoryliert wird, Lichtabsorption bei 340 m/>, und aus der Geschwindigkeit, mit der dies ge- schieht, kann man die Wirksamkeit des ersten phosphorylierenden Ferments berechnen. Mit der gleichen Hilfsreaktion haben wir die Mutierung des Coriesters l-Phosphoglukose 5± 6-Phosphoglukose optisch nachgewiesen. Die Komponenten des Tests waren dabei Coriester, Triphospho-Pyridinnukleotid, Magnesiumsulfat und Zwischenferment. Bei Zu- satz des Mutase-Proteins entstand dann Lichtabsorption bei 340 m/t. 11. Zweites phosphory Her ende s Ferment. Um die Phosphorylierung von Hexosemonophosphat zu Hexosediphosphat optisch nachzuweisen, fügen wir Zymohexase, Arsensäure und oxydierendes Gärungs- ferment zu den Testlösungen hinzu. Sind die beiden Hilfsfermente im Überschuß, so wird das entstehende Hexosediphosphat sofort gespalten, und die Aldoform des Triosephosphats wird sofort zu Phosphoglycerinsäure oxydiert, wobei Dihydro- pyridinnukleotid, also Lichtabsorption bei 340 m/t entsteht. Aus der Geschwindig- keit, mit der diese Lichtabsorption zunimmt, kann man die Wirksamkeit des phosphorylierenden Ferments berechnen. Die Komponenten des Tests sind also Hexosemonophosphat, Magnesiumsulfat und Adenosintriphosphat ; und als Hilfssystem Zymohexase, Pyridinnukleotid, Arsensäure und Protein des oxydierenden Gärungsferments. Gibt man zu dieser Lösung, die reaktionslos ist, Protein des zweiten phosphorylierenden Ferments, so entsteht Hexosediphosphat, und die Spaltung und die Oxydation der Spaltungs- produkte beginnt. 12. Carboxylase. Der Vollständigkeit wegen sei erwähnt, daß man auch Carboxylase optisch be- stimmen kann. Wir lösen Brenztraubensäure in m/10 Acetatpuffer von pH 5,3 zu einer Konzentration von 1/200 molar, messen die Lichtabsorption bei 240 m/t für eine Schichtdicke von 0,5 cm und geben dann Carboxylase zu der Lösung. Dann verschwindet die Lichtabsorption in dem Maße, als die Brenztraubensäure zu Acetaldehyd und Kohlensäure gespalten wird. Die Methode beruht auf der Tat- sache, daß Brenztraubensäure bei pH 5,3 zwar nur zu einem kleinen Teil, aber doch optisch noch ausreichend enolisiert ist. (ßmoiar = 6 • 105 cm2/Mole Brenz- traubensäure). V. Vorbemerkung über die kristallisierten Fermente Die gut ausgearbeiteten Isolierungsverfahren von Gärungsfermenten sind ganz einfache Verfahren. Das oxydierende Gärungsferment der Hefe, die Enolase der Hefe, die Zymohexase des Muskels kann man heute grammweise mit einem Arbeitsaufwand von nur einigen Tagen in reinem Zustand gewinnen; und man kann die reinen Fermente, sofern sie von proteolytischen Fermenten völlig befreit Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 59 sind, bei 0° jahrelang ohne Wirkungsverlust aufbewahren. Die Unbeständigkeit der Fermente ist eine Schwierigkeit, die überwunden ist.* Will man ein Gärungsferment für katalytische Versuche benutzen, so kommt es darauf an, daß die andern Gärungsfermente entfernt worden sind; daß also zum Beispiel das oxydierende Gärungsferment frei ist von Isomerase und Zymohexase, die Enolase frei ist von Mutase usw. Der hierfür erforderliche Reinheitsgrad ist meistens nach einmaligem Umkristallisieren erreicht. Dagegen ist ein höherer Reinheitsgrad und vielfaches Umkristallisieren er- forderlich, wenn man die stöchiometrischen Reaktionen der Fermente, auf denen ihre katalytischen Reaktionen beruhen, untersuchen will. Dann sind wegen des großen Molekulargewichts der Fermente und wegen des kleinen Molekulargewichts der Wirkungsgruppen die reinsten Fermente noch zu unrein und Verunreinigun- gen von 0,1 %3 in der gewöhnlichen Chemie eine erlaubte Fehlergrenze, können Wirkungsgruppen vortäuschen oder die Entdeckung von Wirkungsgruppen ver- hindern. Nach dem Gesagten ist es auch klar, daß die Elementaranalyse keine Methode ist, mit der das Problem der Wirkungen der Fermente untersucht werden kann. Doch haben wir wegen der Klassifizierung der Ferment-Proteine unsere Kristalle analysiert; die Ergebnisse sind in den Originalarbeiten mitgeteilt. Erwähnenswert ist, daß wir in den meisten Fermentproteinen etwa 1 % Schwefel, in dem Enolase- protein aber nur 0,38 % Schwefel fanden. Die Ultraviolett-Banden der Fermentproteine, die von dem Tryptophan und dem Tyrosin der Proteine herrühren, fanden wir von bemerkenswert gleicher Höhe, Zum Beispiel : molarer Absorptionskoefficient bei 280 m// cm- Zymohexase aus Muskeln 2,0 10:! Enolase-Protein aus Hefe 2,06 10;! Protein des oxydierenden Gärungsferments aus Hefe 2,16 10:J VI. Kristallisation des Proteins des oxydierenden Gärungsferments7 Das Protein des oxydierenden Gärungsferments ist 1939 aus Hefe mit Hilfe des optischen Tests 3 isoliert worden. Zwei neue für die Fermentchemie wichtige Methoden sind dabei entwickelt worden: die Fraktionierung von Ferment-Pro- teinen als Nukleoproteide durch Variation der Konzentration der Wasserstoffionen und die Kristallisation von Ferment-Proteinen aus Ammonsulfat unter Zusatz von starkem Ammoniak. Wie die meisten Ferment-Proteine ist auch das Protein des oxydierenden Gärungsferments in Wasser sehr leicht löslich, während die Nukleinsäurever- bindung, die etwa 20% Nukleinsäure enthält, in salzarmem Wasser bei saurer Reaktion fast unlöslich ist. Befreit man also Hefesaft, der in der Regel reichlich * Zusatz 1961. Im wesentlichen nach diesen Methoden werden die reinen Stoff- wechselfermente gewonnen, die C. F. Böhringer (Mannheim -Waldhof), sehr zum Nutzen der Wissenschaft, seit einigen Jahren in den Handel bringt. 60 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste Nukleinsäure enthält, durch irgendeine Vorbehandlung von dem Hauptteil seiner Salze, setzt zur Sicherheit noch nukleinsaures Natrium hinzu und säuert mit Essig- säure an, so fallen Nukleoproteide aus und zwar je nach der Azidität, bis zu der angesäuert wurde, verschiedene Nukleoproteide. Bei pH 4,5 fällt das Nukleopro- teid des Proteins des oxydierenden Ferments. Man kann es ohne Wirkungs verlust auf der Zentrifuge waschen, es dadurch von vielen Begleitstoffen befreien und es auch, was methodisch oft von Vorteil ist, schnell beliebig stark konzentrieren. Um das Protein aus seiner Nukleinsäureverbindung wieder in Freiheit zu setzen, suspendieren wir das Nukleoproteid in wenig Wasser, lösen es durch tropfen- weisen Zusatz von Natronlauge bis pH 6 und fügen Protaminsulfat hinzu. Dabei fällt die Nukleinsäure als Protaminsalz aus, während das Protein in Lösung bleibt. Wegen der folgenden Kristallisation ist es wichtig, daß die Nukleinsäure mög- lichst vollständig abgetrennt wird. Wir prüfen den Erfolg unsrer Trennungs- methode optisch, indem wir die Lichtabsorption der Lösungen, die von Nuklein- säure befreit werden sollen, bei 260 m/< und 280 m/i vergleichen. Proteine haben ihr Maximum bei 280 m//, während das Maximum der Nukleinsäureabsorption bei 260 mit liegt. Zur Kristallisation versetzen wir eine 10%ige Lösung des Proteins bis zur Halb- sättigung mit Ammonsulfat und fügen zu der klaren Lösung 1/2obis 1/w ihres Vo- lumens Normal-Ammoniak. Dann erscheinen bald Nadeln und nach einigen Stun- den ist die Flüssigkeit zu einem Brei reiner Kristalle erstarrt. Auch in andern Fällen hat sich diese Methode der Kristallisation bewährt. Das Protein enthält keinen Phosphor. Es verbrennt ohne Rückstand, enthält also keine Metalle. Auch für dissociierende Bindung von Metallen haben sich bis- her keine Anhaltspunkte ergeben. Die prosthetische Gruppe des Ferments ist Diphospho-Pyridinnukleotid, dessen hydrierte und nicht hydrierte Formen gleich fest von dem Protein gebunden wer- den. Die Gleichgewichtskonstante dieser Bindungen hat bei 25° und pH 7,5 den Wert: Protein X Nukleotid . o « . in-; Proteid Mole Liter Die molare Wirksamkeit in der Richtung der Gärung beträgt bei 20° und pH 7,4, wenn wir mit dem von Bücher mit der Streulichtmethode gefundenen Mol. Gewicht 96000 rechnen: Wmoiar = 17000 Mole Substrat/Mole Ferment ; Minuten. VII. Oxydationsreaktion der Gärung Als wir das Nikotinsäureamid und seine wasserstoffübertragende Funktion bei der Gärung entdeckt hatten, war es sofort klar, und ließ es sich durch einfache Ver- suche beweisen, daß die Gärungsreaktion, in der das hydrierte Nikotinsäureamid seinen Wasserstoff wieder abgibt, die Hydrierung des Acetaldehyds oder der Brenz- traubensäure ist: Dihydro-Nikotinsäureamid + Acetaldehyd == Nikotinsäureamid + Aethylalkohol Dihydro-Nikotinsäureamid -j Brenztraubensäure = Nikotinsäureamid ! Milchsäure. Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 61 Dagegen wurde die Gärungsreaktion, in der das Nikotinsäureamid den Wasser- stoff aufnimmt — die Oxydationsreaktion der Gärung — erst aufgeklärt, nachdem das Protein des oxydierenden Ferments isoliert worden war. Warum diese Iso- lierung die notwendige Vorbedingung war, wird sich aus dem folgenden ergeben. Der Schlüssel-Versuch für die Oxydationsreaktion, ausgeführt mit kristalli- siertem Protein, ist in Figur 2 graphisch dargestellt. Man erkennt aus der Figur, daß die Oxydationsreaktion eine reversible Reaktion ist; daß die Phosphorsäure an der Reaktion beteiligt ist; und daß die Oxydation des Substrats um so voll- ständiger verläuft, je höher die Konzentration der freien Phosphorsäure ist. Qualitativ kann man die Beteiligung des Phosphats an der Oxydationsreaktion der Gärung durch einen einfachen Versuch demonstrieren. Im Licht der Queck- silberlinie 366 m/t zeigt das Dihydro-Pyridinnukleotid eine lebhafte weiße Fluo- rescenz, während die andern Teilnehmer der Oxydationsreaktion hier nicht fluorescieren. Läßt man also die Oxydationsreaktion vor dem Schwarzglas einer Analysen-Quecksilberlampe vor sich gehen, so kann man den Verlauf der Reak- tion durch Beobachtung der Fluorescenz sehen. Man löse zum Beispiel einige mg 3-Phosphoglycerinaldehyd und einige 1/10 mg Pyridinnukleotid in 3 cm3 m/100 Pyrophosphat von pH 7,9 und bringe die Lösung vor das Schwarzglas der Lampe. Die Lösung bleibt dunkel, auch wenn man einige y des Proteins des oxydierenden Gärungsferments hinzufügt. Läßt man aber einen Tropfen einer m/10 Orthophosphatlösung vorsichtig in die Lösung hineinfallen, so sinkt der Tropfen hell leuchtend zu Boden und schüttelt man dann um, so leuchtet die ganze Lösung hell auf. Figur 2. Oxydationsreaktion der Gärung 3-Phosphoglycerinaldehyd f- Pyridinnukleo- tid - Phosphat. Bei t(l 3/ des Proteins des oxydierenden Gärungsferments. In —7-, der i Logarithmus der Lichtschwächung, ist der Konzentration des Dihydro-Pyridinnukleotids proportional. /. 340 m/r, d == 0,557 cm; 20°. Kurve I : 0,87 • 10-6 Mole Phosphat pro cm3 • pH 7,4. Kurve II: 1,68 • IO-5 Mole Phosphat pro cm:! • pH 7,4. Kurve III: 3,36 ■ 10-5 Mole Phosphat pro cm3 • pH 7,4. Kurve IV: 3,36 • IO-5 Mole Phosphat pro cm3 • pH 8,45 2,2 2,0 1,8 1.6 1,1 12 K 0,8 0,6 0,1 02 """ In -?-für vollständige Reduk fion des Pyridins n^. m_^ #., c < > c >— — —0 /„ r 2 15 6 Minuten 10 Zur Erklärung der Phosphatwirkung habe ich angenommen*, daß sich zunächst Phosphorsäure an die Aldehydgruppe des Phosphoglycerinaldehyds anlagert, unter Bildung eines Phosphorsäureesters des Orthoaldehyds : * Zusatz 1961. Ist inzwischen bewiesen worden. Vergl. Arbeiten 23 und 24 die- ses Buchs. 62 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste CH0OPO3H2 CH2OPO3H2 I I CHOH + H3PO4 ^ CHOH [1] /H CHO ce-OH XOP03H2 Wahrscheinlich ist dies keine Fermentreaktion, sondern eine in der Lösung von selbst verlaufende Reaktion. Zur Begründung führe ich an10, daß nicht phosphory- lierter Glycerinaldehyd in wässriger neutraler Lösung — also ohne Mitwirkung eines Ferments — mit Phosphat reagiert und daß durch diese Reaktion die Aldehyd- gruppe des Glycerinaldehyds gegen Oxydationsmittel aktiviert wird. Ist durch die Reaktion [1] der diphosphorylierte Glycerinaldehyd entstanden, so wird er von dem Protein des oxydierenden Gärungsferments gebunden und wird hier von dem Pyridinnukleotid zu diphosphorylierter Glycerinsäure oxydiert: CH0OPO3H0 CH2OPO3H2 I " I CHOH + Pyridinnukleotid ^ CHOH + Dihydropyndinnukleotid [2] ceoH C00PO3H2 XOP03H2 Die 1,3-Phosphoglycerinsäure haben wir isoliert11. Sie ist unbeständig, zerfällt schon in wäßriger Lösung bei neutraler Reaktion und reagiert so schnell an dem Ferment zurück, daß man einen merklichen Umsatz von links nach rechts nur durch relativ große Konzentrationen an Phosphat und 3-Phosphoglycerinaldehyd erzielen kann. Deshalb ist es notwendig, daß das Protein des oxydierenden Gärungsferments rein ist. Enthält es Isomerase oder Zymohexase, so wird der 3-Phosphoglycerin- aldehyd fast vollständig zu Phospho-Dioxyaceton isomerisiert und zu Hexose- diphosphat kondensiert und die noch übrigbleibende Konzentration des3-Phospho- glycerinaldehyds reicht nicht mehr aus für einen merklichen Umsatz von links nach rechts in der Reaktion [2]. Die Arsensäure kann die Phosphorsäure bei der Oxydationsreaktion insofern ersetzen, als 3-Phosphoglycerinaldehyd auch bei Zusatz von Arsensäure oxydiert wird. Aber das Oxydationsprodukt, von dem man erwarten sollte, daß es eine in 1 -Stellung arsenylierte 3-Phosphoglycerinsäure wäre, ist gewöhnliche 3-Phospho- glycerinsäure; und da 3-Phosphoglycerinsäure nicht zurückreagiert, so ist die Oxydationsreaktion bei Gegenwart von Arsensäure eine nicht reversible voll- ständig verlaufende Reaktion. Wahrscheinlich reagiert die Arsensäure in den Reaktionen [1] und [2] genauso wie die Phosphorsäure, aber die in 1- Stellung arsenylierte 3-Phosphoglycerinsäure ist so unbeständig, daß sie schon in statu nascendi in Arsensäure und 3-Phospho- glycerinsäure zerfällt. So kommt es, daß die Arsensäure, thermodynamisch be- trachtet, kein Teilnehmer, sondern Katalysator der Oxydationsreaktion ist. Dies ist nur eine Theorie. Aber es spricht für die Theorie, daß sie die bisher völlig rätselhafte Wirkung der Arsensäure bei der Oxydationsreaktion einfach und einleuchtend erklärt. Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 63 VIII. Harden-Youngsche Gleichung Wenn bei der Oxydationsreaktion der Gärung die 1,3-Phcsphoglycerinsäure ent- standen ist, so folgt im weiteren Verlauf der Gärung die Dephosphorylierung der Säure in zwei Schritten: in dem ersten Schritt wird sie in 1-Stellung dephosphory- liert und es entsteht 3-Phosphoglycerinsäure, die dann über 2-Phosphoglycerin- säure in Phosphobrenztraubensäure übergeht. In dem zweiten Schritt wird die Phosphobrenztraubensäure zu Brenztraubensäure dephosphoryliert. Jede der bei- den Dephosphorylierungen geschieht durch Adenosindiphosphat, das selbst dabei zu Adenosintriphosphat phosphoryliert wird. Im ganzen entstehen jedesmal, wenn 1 Molekül Hexose zu Milchsäure oder Alkohol und Kohlensäure gespalten wird, 4 Moleküle Adenosintriphosphat. Gehen wir, indem wir den Kreislauf der Gärungsreaktionen verfolgen, von diesen 4 Molekülen Adenosintriphosphat aus, so werden in gärenden Zellen 2 Moleküle zu Adenosindiphosphat und Phosphorsäure hydrolysiert, während die andern beiden 1 Molekül Hexose zu Hexosediphosphat phosphorylieren. Würde diese Zweiteilung der Reaktionen des Adenosintriphosphats im Leben nicht ein- gehalten, so würde die Gärung schnell zum Stillstand kommen : durch Mangel an gebundenem Phosphat, wenn zuviel Adenosintriphosphat hydrolysiert würde; oder durch Mangel m freiem Phosphat, wenn zuviel Adenosintriphosphat zur Phosphory- lierung der Hexose verwendet würde. Wird aber die Zweiteilung eingehalten und haben sich die 4 Moleküle Adenosin- triphosphat, von denen wir ausgingen, im Kreislauf der Gärungsreaktionen wieder zurückgebildet, so sind das freie und das gebundene Phosphat konstant geblieben, während 1 Molekül Hexose verschwunden ist und 2 Moleküle Milchsäure oder Alkohol und Kohlensäure entstanden sind. In der lebenden Zelle ist also das Phosphat, thermodynamisch betrachtet, Katalysator, sowohl das gebundene als auch das freie Phosphat. Anders in Zellextrakten, zum Beispiel in Lebedewsaft von Hefezellen, in dem die Adenosintriphosphatase im wesentlichen fehlt. Hier reagieren von den 4 Molekülen Adenosintriphosphat nicht 2, sondern alle 4 Moleküle mit Hexose und es entstehen nicht 1 Molekül, sondern 2 Moleküle Hexosediphosphat. Verfolgt man unter diesen Umständen die Gärungsreaktionen bis zur Wiederbildung der 4 Moleküle Adenosintriphosphat, so sind hier weder das freie noch das gebundene Phosphat konstant geblieben; sondern das freie Phosphat hat (bei der Oxydations- reaktion) um 2 Moleküle abgenommen, während das gebundene Phosphat um 2 Moleküle, nämlich um 1 Molekül Hexosediphosphat, zugenommen hat. Die Bilanz für einen Kreislauf der Gärungsreaktionen ist also : 2 Phosphat — 1 Hexose = 1 Hexosediphosphat :- 2 Wasser 1 Hexose = 2 Kohlensäure + 2 Alkohol Bilanz : 2 Phosphat - 2 Hexose = 1 Hexosediphosphat - 2 Wasser + 2 Kohlensäure - 2 Alkohol. Dies ist die berühmte Gleichung von Harden und Young12, die man heute nach langen Jahren endlich versteht. Heute weiß man auch, warum es kein Einwand gegen die physiologische Bedeutung der Phosphorylierung war, daß lebende Hefe in phosphatfreier Lösung beliebige Mengen Zucker vergären kann. Denn im 64 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste Leben wirkt das Phosphat katalytisch; in Hefesaft wirkt es stöchiometrisch, weil in Hefesaft das Ferment fehlt, das die bei der Oxydationsreaktion gebundene Phosphorsäure wieder frei macht. Diesem glücklichen Umstand, daß in Hefesäften von den 12 Gärungsfermenten der Hefe eines fehlt, verdankt man also die weit- tragende Entdeckung von Harden und Young. Anmerkung: Den Versuch von Harden und Young, der die stöchiometrische Wirkung der Phosphorsäure bei der Gärung demonstriert und den man jedem Studenten der Biochemie zeigen sollte, führen wir folgendermaßen aus : In einem Manometergefäß mit Ansatzbirne werden 2 cm3 Lebedewsaft, der 5",, Glukose enthält und dessen pH 6 ist, solange geschüttelt, bis die Gärung sehr schwach geworden ist. Gibt man dann aus der Ansatzbirne 5 Mikromole Phosphat in den Hauptraum (wobei pH 6 bleiben soll), so setzt alsbald eine stürmische Entwicklung von Gärungs- kohlensäure ein, die wieder aufhört, wenn 5 Mikromole Kohlensäure entwickelt worden sind, also geradesoviel als man Phosphat zugegeben hatte. Würde hier die Phosphorsäure katalytisch wirken wie in lebenden Zellen, so würde die schnelle Gärung erst aufhören, wenn der gesamte Zucker des Lebedewsaftes vergoren wäre; wenn also nicht 5, sondern 1100 Mikromole Kohlensäure entwickelt worden wären. IX. Kristallisation des Enolase-Proteins8 Das Enolase-Protein ist mit Hilfe des optischen Tests 6 aus Hefe isoliert worden. Eine neue Methode der Kristallisation von Ferment-Proteinen ist dabei entdeckt worden: die Kristallisation der Proteine als Quecksilbersalze. Ich kam auf die Methode bei Versuchen, das Enolase-Protein durch Fällung mit Ammonsulfat zu kristallisieren. Dabei waren den amorphen Niederschlägen immer dann vereinzelte Kristalle beigemischt, wenn die Proteinlösungen vorher mit Mercks Faserton geschüttelt worden waren. Da nun Mercks Faserton unter Zusatz von Quecksilbersalzen hergestellt wird, und da Proteinlösungen in Berührung mit diesem Faserton Quecksilbersalze aufnehmen, so setzten wir bei unsern Kristalli- sationsversuchen Quecksilbersalze zu. Tatsächlich fiel nach Zusatz von viel Mer- curisulfat zu einer Lösung von Protein in ammoniakalischem Ammonsulfat das gesamte Enolase-Protein als kristallinisches Quecksilbersalz aus. Kein anderes Metall, auch nicht Cadmium, konnte hierbei das Quecksilber vertreten. Die Methode ist seitdem mit Erfolg auf andere Ferment-Proteine angewandt worden, ist also nicht spezifisch für Enolase-Protein. Bücher und Lüttgens fanden in dem Quecksilbersalz der Enolase 0,3 % Queck- silber, also in 66000 Gramm 1 Grammatom Quecksilber. Dies stimmt zu Mole- kulargewichtsbestimmungen mit der Streulichtmethode, bei denen Bücher für das Enolase-Protein 68000 fand. Das Quecksilbersalz der Enolase ist katalytisch unwirksam. Entfernt man aber das Quecksilber durch Dialyse gegen Kaliumcyanid oder gegen Cystein, so findet man die volle Wirksamkeit des Ausgangsmaterials wieder, falls es rein war; oder eine höhere Wirksamkeit, falls das Ausgangsmaterial noch unrein war. Bei der Isolierung des Enolase-Proteins war die Kristallisation als Quecksilbersalz der letzte Schritt; die Wirksamkeit des Proteins stieg dabei auf das doppelte. Später habe ich beobachtet, daß man das Quecksilbersalz des Enolase-Proteins auch direkt, ohne das Quecksilber vorher zu entfernen, im Enolase-Test verwen- den kann, wenn man der Testlösung eine kleine, etwas mehr als äquivalente Menge Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 65 Cystein zusetzt. Dann entzieht das Cystein dem Quecksilbersalz sofort das Queck- silber, und die Ferment-Wirkung setzt ohne nachweisbare Verzögerung ein. Es sei darauf hingewiesen, daß Cystein und das Quecksilbersalz des Cysteins bei der Wellenlänge des Enolase-Tests (240 m//) stark absorbieren; daß aber diese Ab- sorption wegen der sehr kleinen Cysteinmengen, die zur Zerlegung der Queck- silberverbindung notwendig sind, nicht stört. Schon bei unsern ersten Vorversuchen mit roher Enolase fanden wir, daß an der Enolasewirkung eine dialysierbare Substanz beteiligt ist. Tatsächlich ist die aktive Enolase ein dissociierendes Magnesium-Proteid, dessen Dissociationskonstante bei 20° und pH 7,4 den Wert hat: Mole Mg Protein K = cjjg ■ = 0,6 • 10 J Proteid Liter Unter den gleichen äußeren Bedingungen ist die molare Wirksamkeit der Eno- lase in der Richtung der Gärung, berechnet mit dem Molekulargewicht 68000 Wmoiar = 6800 Mole Substrat/Mole Ferment • Minuten. X. Fluoridhemmung der Enolase Seit Effront im Jahre 1890 entdeckte, daß Fluoride die Gärung hemmen, ist die Fluoridhemmung viel diskutiert worden, zuletzt von Meyerhof und Lohmann, die fanden, daß die Enolase besonders fluoridempfindlich ist und die daran die richtige Vermutung knüpften, die Fluoridhemmung der Gärung beruhe auf der Fluoridhemmung der Enolase. Niemand aber konnte den chemischen Mechanis- mus der Fluoridhemmung erklären, ehe der Aktivator der Enolase gefunden war. Gehen wir bei unsern Erklärungsversuchen von dem physiologischen Aktivator der Enolase, dem Magnesium aus, so liegt die Annahme nahe, daß Fluorid das freie Magnesiumsalz der Lösungen zu Magnesiumfluorid binde und dadurch die Dissociation des Ferments in inaktives Protein und Magnesiumsalz bewirke. Dann müßte um so mehr Fluorid zur Hemmung der Enolase notwendig sein, je größer die Konzentration des Magnesiums wäre. Wir fanden das Gegenteil. Zum Beispiel waren die Fluorid-Konzentrationen, die halbe Hemmung der Eno- lase bewirkten, bei pH 6,74 in m/20 Phosphat: MgS04 [Mole/ Liter] 1 x 10"3 2,7 • lO-3 27 ; 10-3 Halbwerts-Konzentration des Fluorids [Mole/Liter] 3,9 x 10"4 2,0 x 10"4 0,6 x 10-4 Es war also um so weniger Fluorid zur Hemmung der Enolase notwendig, je höher die Konzentration des Magnesiums war. Waren 27 Millimole Magnesium- sulfat im Liter Lösung, so hemmten 0,06 Millimole Fluorid die Enolase zur Hälfte, 5 Warburg, Zellphysiologie 66 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste während offenbar in diesem Fall die Konzentration des Magnesiumsulfats durch das Fluorid nicht vermindert werden konnte. Ein zweites merkwürdiges Ergebnis war es, daß wir gar keine Hemmung durch Fluorid fanden, wenn wir den Phosphatpuffer durch Bikarbonatpuffer ersetzten. Wurde aber Phosphat zu dem Bikarbonat hinzugefügt, so trat die Fluoridhemmung wieder auf. Zum Beispiel fanden wir bei pH 7,34 in m/20 Bikarbonat : Mole/Liter Mole /Liter Mole/Liter CMg cFluorid • cPhosphat 2,7 X 10"3 0 1,0 10-3 1 keine Hemmung 2,7 x lO-3 1,7 ■ lO-3 0 I Y keine Hemmung 2,7 1,7 1,0 10 3 lO"3 lO"3 71% Hemmung Aus derartigen Versuchen ergab sich, daß die Fluoridhemmung der Enolase durch eine Substanz bewirkt wird, die Phosphat, Magnesium und Fluorid ent- hält und zwar wahrscheinlich im Verhältnis 1:2:2; und daß dieses komplexe Magnesiumsalz das Magnesium von der Enolase verdrängt, etwa: Magnesiumfluorophosphat Magnesiumenolase ^ Magnesiumfluorophospho-Enolase Ma- gnesiumsalz Indessen muß ich erwähnen, daß ich eine Erscheinung beobachtet habe, die zu dieser Theorie nicht zu stimmen scheint. Bringt man Enolase-Protein in eine Testlösung, die Phosphat, Magnesium und Fluorid enthält, so dauert es etwa 1 Minute, bis die Fluoridhemmung voll entwickelt ist; und bringt man das ge- hemmte Ferment in eine fluorid freie Lösung zurück, so dauert es etwa 1 Minute bis die Fluoridhemmung wieder völlig verschwunden ist. Eine gegenseitige Ver- drängung von Salzen sollte nicht so lange Zeite beanspruchen. XI. Kristallisation der Muskel-Zymohexase5 Muskel-Zymohexase wurde mit Hilfe des Tests 1 isoliert und aus ammoniakali- schem Ammonsulfat kristallisiert. Das Molekulargewicht fand Bücher mit der Streulichtmethode etwa 150000. Bezogen auf diesen Wert, beträgt die molare Wirksamkeit des Ferments in der Richtung der Gärung: Wmoiar bei 20°: 2 000 Mole Hexosediphosphat / Mole Ferment :■; Minuten Wmciar bei 38°: 11000 Mole Hexosediphosphat / Mole Ferment X Minuten Dies ist die kleinste molare Wirksamkeit eines Gärungsferments, die wir bisher gefunden haben. Vielleicht hängt dies damit zusammen, daß die Zymohexase Kohlenstoffverbindungen trennt, während die bisher isolierten Gärungsfermente Phosphat übertragen oder Wasserstoff übertragen oder Wasser abspalten. Aus Gründen, die sich aus dem Folgenden ergeben werden, haben wir die Frage der Beteiligung von Schwermetallen an der Wirkung der Muskel-Zymohexase untersucht. Wir fanden: Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 67 1. Muskel-Zymohexase kann gegen die Komplexbildner Blausäure, Cystein und Pyrophosphat ohne Wirkungsverlust dialysiert werden. 2. Muskel-Zymohexase wird durch Zusatz von Komplexbildnern zur Test- lösung nicht gehemmt. 3. Muskel-Zymohexase, zweimal umkristallisiert, enthielt in 100 mg 2 y Kupfer, 2 y Zink und 1 y Eisen. Addieren wir die drei Metalle und rechnen die Metalle und das Ferment in Mikromole um, so ergibt sich, daß 0,67 Mikromole Ferment etwa 0,08 Mikromole Schwermetall, also keine stöchiometrischen Mengen Schwermetall enthalten. Die drei Ergebnisse ergänzen sich und scheinen zu beweisen, daß an der Wirkung der Muskel-Zymohexase Schwermetalle nicht beteiligt sind. XII. Das Problem der Wirkungsgruppe Es ist bisher ein Ergebnis unsrer Untersuchungen über Fermente gewesen, daß die Wirkung der Fermente auf chemischen Zwischenreaktionen beruht; und daß die Ferment-Proteine keine Teilnehmer dieser chemischen Zwischenreaktionen sind. Wenn zum Beispiel die Phenoloxydase Brenzkatechin zu Orthochinon oxydiert, so wäre es möglich gewesen, daß das Ferment-Protein das Brenzkatechin oxydierte und daß das reduzierte Ferment-Protein durch molekularen Sauerstoff reoxydiert würde. In Wirklichkeit jedoch oxydiert Kupfer, an Protein gebunden, das Brenz- katechin; und in Wirklichkeit wird Kupfer, an Protein gebunden, durch moleku- laren Sauerstoff reoxydiert. Das entsprechende gilt für die rein organisch auf- gebauten sauerstoffübertragenden Fermente, die gelben Fermente, sowie für die sehr große Zahl der wasserstoffübertragendsn Fermente, die Pyridin-Proteide. Deshalb wird man, wenn man ein Ferment isoliert hat, nicht ruhen, bis man den Nichtproteinteil gefunden hat : das „Koferment", wenn der Teil dissociierend ge- bunden ist oder die „prosthetische Gruppe", wenn er fester gebunden ist. Erst dann kann man hoffen, die Zwischenreaktionen, auf denen die Fermentwirkung be- ruht, zu entdecken und damit die Fermentwirkung chemisch zu verstehen. Die Muskel-Zymohexase ist das erste Ferment gewesen, dessen Nichtprotein- teil wir gesucht, aber nicht gefunden haben. Würden wir aber diesen Fall als Aus- nahme hinnehmen, so würden wir sofort eine zweite noch bedenklichere Annahme hinzufügen müssen: daß der Mechanismus der Zymohexasewirkung im Muskel und in Hefe verschieden ist. Denn einen Nichtproteinteil der Hefe-Zymohexase haben wir gefunden. Hefe-Zymohexase ist kein Protein, sondern ein dissociieren- des Schwermetallproteid. XIII. Hefe-Zymohexase5 Hefe-Zymohexase wurde nach einer 1942 veröffentlichten Vorschrift vorgereinigt. Zur weiteren Reinigung adsorbierten wir das Ferment bei pH 6,5 an Aluminium- hydroxyd, eluierten das Aluminiumhydroxyd mit viel Wasser, wobei das Ferment adsorbiert blieb und eluierten dann das Ferment mit m 50 Pyrophosphat bei pH 68 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 7,1. Es folgte Verdünnung des Eluats auf m/100 Pyrophosphat, Ansäuren mit Essigsäure bis pH 4,9, wobei ein unwirksamer Niederschlag fiel, und Fällen des Ferments mit 1/3 Volumen Alkohol. Der Ferment-Niederschlag wurde dann in wenig Wasser suspendiert, mit Natronlauge neutralisiert und in gefrorenem Zu- stand zu einem haltbaren Pulver getrocknet. Die so gewonnene Hefe-Zymohexase hatte, in Test 1 geprüft, etwa die gleiche Wirksamkeit, wie die kristallisierte Muskel-Zymohexase. Doch kristallisierte diese Hefe-Zymohexase nicht* und so können wir über ihren Reinheitsgrad keine An- gaben machen. Mißt man die Wirkung so gereinigter Hefe-Zymohexase im optischen Test 1 unter Zusatz von Cystein, so findet man starke Hemmung. Da auch andere Kom- plexbildner wie Dipyridyl, Phenanthrolin und Pyrophosphat hemmen, so muß die Hefe-Zymohexase eine dissociierende Schwermetallverbindung sein. Dies kann man beweisen, indem man zu dem durch Cystein gehemmten Fer- ment Schwermetallsalze zusetzt, wenig im Vergleich zu dem Cystein, aber genug, um das Ferment-Protein mit Metall zu sättigen. Dann findet man, daß 3 Metalle die Wirkung des Ferments wiederherstellen können : Zink-, Ferro- und Kobalto- Salze. Auf die Reaktivierung des Ferments durch Zink hat Sauerstoff keinen Einfluß. Die Reaktivierung durch Eisen jedoch ist vom Sauerstoff druck abhängig; sie ist am größten bei Abschluß von Sauerstoff und sehr gering bei Sättigung der Test- lösungen mit Sauerstoff von Atmosphärendruck. Die Erklärung ist, daß nur das zweiwertige Eisen reaktivieren kann. In einer Cysteinlösung, die wenig Eisen ent- hält, ist das gesamte Eisen bei Abschluß von Sauerstoff zweiwertig und bei Sätti- gung mit Sauerstoff von Atmosphärendruck ist fast das gesamte Eisen dreiwertig. Wenn nun von den beiden Oxydationsstufen des Eisens nur das zweiwertige Eisen die Zymohexase aktiviert, und wenn Eisen in Cysteinlösungen bei Abschluß und Zufuhr von Sauerstoff seine Valenz wechselt, so kann man hier wie in leben- den Zellen, aber hier durch einen chemisch klaren Mechanismus, Spaltung von Zucker entstehen lassen oder zum Verschwinden bringen, indem man Sauerstoff abschließt oder zuführt. Ist damit der Schlüssel zu der Pasteurreaktion gefunden, jener Reaktion, durch die in lebenden Zellen die Sauerstoffatmung die Gärung hemmt ? Zwar könnte es im Leben nicht der molekulare Sauerstoff sein, der die aktive Ferro-Zymohexase zu der inaktiven Ferri-Zymohexase oxydierte; aber es würde zu allem, was über die Pasteurreaktion bekannt ist, stimmen, wenn das Eisen des sauerstoffübertragenden Ferments durch die Reaktion Ferri-Oxygenase + Ferro-Zymohexase ^ Ferro-Oxygenase + Ferri-Zymohexase die Zymohexase inaktivierte. Wie die Pasteurreaktion wäre diese Reaktion in weiten Grenzen vom Druck des Sauerstoffs unabhängig, weil die Konzentration der Ferri-Oxygenase in weiten * Zusatz 1961. Die Hefezymohexase ist inzwischen kristallisiert worden. Siehe Arbeit 21 dieses Buchs. Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 69 Grenzen vom Sauerstoffdruck unabhängig ist. Wie die Pasteurreaktion würde diese Reaktion durch Kohlenoxyd und durch Blausäure gehemmt, weil die Konzen- tration der Ferri-Oxygenase durch Kohlenoxyd und Blausäure vermindert wird. Wie die Pasteurreaktion könnte diese Reaktion, ohne gleichzeitige Atmungs- hemmung, durch Carbylamin gehemmt werden, wenn Carbylamin durch An- lagerung an das Ferro-Eisen der Zymohexase die Ferro-Zymohexase vor der Oxydation schützte. Trotzdem nun auf die angedeutete Weise vieles, was bisher chemisch unver- ständlich war, erklärt werden könnte, so muß doch zunächst abgewartet werden, wie das Problem der Muskel-Zymohexase gelöst werden wird. Denn ebenso wie in Hefe gibt es im Muskel eine Pasteurreaktion und keine Erklärung kann befriedi- gen, die die Pasteurreaktion nicht einheitlich, unabhängig von der Zellart erklärt. Wahrscheinlich wird man hier am schnellsten durch eine Untersuchung der Hefe-Zymohexase zum Ziel kommen, also die negative Frage beiseite lassen, warum die Muskel-Zymohexase durch Schwermetalle nicht aktiviert wird und statt dessen die positivere Frage untersuchen, warum die Hefe-Zymohexase durch Schwer- metalle aktiviert wird. Da Zink zu den aktivierenden Metallen gehört, kann die Wirkung der Schwermetalle hier nicht wie in den sauerstoffübertragenden Fer- menten auf einem Valenzwechsel beruhen. Offenbar liegt hier ein anderer Me- chanismus biologischer Schwermetallwirkungen vor.* XIV. Kristallisation der Proteine der beiden dephosphorylierenden Fermente73 Das Protein des ersten dephosphorylierenden Ferments ist unter meiner Leitung von Th. Bücher mit Hilfe des Tests 4 aus Hefe isoliert und aus Ammonsulfat unter Zusatz von Pyrophosphat kristallisiert worden. Die Methode der Isolierung bestand im wesentlichen aus einer Fraktionierung der Zellproteine als Nukleo- proteide mit Säure; neu war dabei, daß unter Zusatz von Alkohol fraktioniert wurde. Das Protein zeichnet sich vor andern Ferment-Proteinen der Gärung durch seine große Wirksamkeit aus. Im optischen Test genügt eine Protein-Konzentra- tion von 0,01 y pro cm3. Rechnen wir mit einem Molekulargewicht von 100000, so beträgt die molare Wirksamkeit in der Richtung der Gärung bei 25° : Wmoiar = 320 000 [Mole Substrat / Mole Ferment Minuten]. Das Protein des zweiten dephosphorylierenden Ferments ist mit Hilfe des Tests 7 aus Hefe isoliert und aus Ammonsulfat kristallisiert worden. An Einzelheiten des Isolierungsverfahrens, das Negelein ausgearbeitet hat, kann ich mich nicht mehr erinnern. Die Proteine der beiden dephosphorylierenden Fermente sind streng spezifisch * Zusatz 1961. Inzwischen ist diese Schwermetallwirkung zweiter Art, wie wir sie nennen wollen, sehr häufig in Fermenten gefunden worden, ohne daß eine Er- klärung für den Mechanismus der Metallwirkungen gefunden worden wäre. 70 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste für ihre Teste, können sich also in ihren Testen nicht vertreten. Es ist weiterhin eine Folge der strengen Spezifizität, daß die beiden Teste nach Zusatz ihrer spezi- fischen Proteine reaktionslos bleiben, wenn man statt der stöchiometrischen Men- gen katalytische Mengen Adenosindiphosphat zusetzt und außerdem viel Hexose oder Hexosemonophosphat. Es geht daraus hervor, daß die Dephosphorylierung und die Phosphorylierung der Substrate an verschiedenen Proteinen vor sich geht; daß also die phosphatübertragenden Fermente, ebenso wie die wasserstoffüber- tragenden Fermente, aus je 2 Proteinen mit gemeinsamer prosthetischer Gruppe bestehen. Dies ist schon in Kapitel III hervorgehoben, aber dort nicht experi- mentell begründet worden. Im ganzen gibt es in gärenden Zellen 4 an der Phosphatübertragung beteiligte spezifische Proteine, von denen jedes mit Adenosinpolyphosphat und Magnesium- salz zu Proteinen zusammentritt, die ich in Analogie zu den Alloxazin- oder Pyri- din-Proteiden als „Adenosin-Proteide" bezeichnen möchte. Die 4 Adenosin-Proteide, die also thermodynamisch betrachtet nicht Fermente, sondern Halb-Fermente sind, kann man paarweise zu 4 phosphatübertragenden Fermenten folgender Funktionen zusammensetzen : 1. Ferment, das Phosphat von der 1 -Stellung der 1,3-Diphosphoglycerinsäure auf Hexose überträgt. 2. Ferment, das Phosphat von der 1 -Stellung der 1,3-Diphosphoglycerinsäure auf Hexosemonophosphat überträgt. 3. Ferment, das Phosphat von der Phosphobrenztraubensäure auf Hexose über- trägt. 4. Ferment, das Phosphat von der Phosphobrenztraubensäure auf Hexosemono- phosphat überträgt. XV. Kristallisation des Proteins des reduzierenden Gärungsferments aus Tumoren9 Wenn das Protoplasma der Zellen der Inbegriff ihrer Fermente ist, dann sollte man annehmen, daß die Fermente gleicher Funktion verschiedener Organe eines Tieres verschieden sind. Da die prosthetischen Gruppen gleich sind, so wird man die Verschiedenheiten in den Proteinkomponenten suchen müssen. Man wird also beispielsweise erwarten, daß die Proteine der reduzierenden Gärungsfermente von Muskeln und Leberzellen derselben Tierart verschieden sind. Wir haben die Untersuchung dieses wichtigen Problems in unsystematischer Weise mit einem Vergleich von Muskel- und Tumorfermenten begonnen. Das Versuchstier war die Ratte, der Tumorstamm war das Jensensarkom, die Fer- mente waren die reduzierenden Gärungsfermente, deren Proteine unter meiner Leitung von Kubowitz und Ott aus Muskeln und aus Tumoren isoliert und als Quecksilbersalze kristallisiert wurden. Wir haben keine Unterschiede der Kristallform, der elementaren Zusammen- setzung, des Ultraviolettspektrums und der Drehung der Polarisationsebene ge- Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 71 funden, die wir als außerhalb der Fehlergrenzen betrachten könnten. Bei der Größe des Proteinmoleküls mag dies nicht viel bedeuten. Wir haben identische Zerstörungskurven beim Erhitzen in neutraler wäßriger Lösung, beim Bestrahlen mit 303 und 334 mit und beim Abbau durch Dünn- darmsekret erhalten. Wir haben die gleichen Konstanten der Dissociation der Fermente in Protein und prosthetische Gruppe gefunden, nämlich K = 5 • 10"6 Mole/Liter bei neu- traler Reaktion und 20°. Für die bemerkenswerteste Übereinstimmung der beiden Fermente aber halte ich, daß ihre chemischen Wirksamkeiten numerisch gleich gefunden wurden. Die molaren Wirksamkeiten in Richtung der Gärung, berechnet mit einem Molekular- gewicht* von 100000, betrugen bei Variation der äußeren Bedingungen: Muskelferment W molar Tumorferment Wmolar 20° pH 8,15 39° pH 8,16 20° pH 7,36 39° pH 7,38 30 000 46 000 23 000 73 000 31 000 45 000 23 000 73 000 XVI. Gärungsfermente im Blut von Tumortieren13** Wenn bei der Entwicklung der Tumoren im Körper ein humoraler Faktor be- teiligt ist, so sollte sich das Serum von Tumortieren von dem Serum normaler Tiere unterscheiden. Wegen der Gärung der Tumoren haben wir an Gärungsfer- mente gedacht und haben mit den optischen Testen im Serum von Tumortieren Gärungsfermente gesucht. Zum Vergleich dienten normale Tiere und gravide Tiere. Gibt man 0,1 bis 0,2 cm3 Serum oder Plasma zu den 3 cm3 Testlösung, die wir für unsern Quarztrog brauchen, so kann man die meisten der 11 Fermente der Milchsäuregärung in Normalserum, in Gravidenserum und in Tumorserum von Ratten nachweisen. Zwei dieser Fermente waren in Serum von Tumorratten ver- mehrt: die Zymohexase und die Isomerase. Die Tumoren waren Jensensarkome oder Walker-Carcinome, die unter die Haut oder in das Abdomen geimpft worden waren. Waren die Tumoren groß, so betrug der Gehalt an Zymohexase und Isomerase das 10- bis 20fache des Normal- werts. An eine klinische Anwendung als „Krebsreaktion" ist wegen der erforderlichen Größe der Tumoren nicht zu denken. Theoretisch aber ist die Erscheinung interes- sant. Stammt die Zymohexase im Serum der Tumortiere, was am nächstliegenden wäre, aus zerfallenen Tumorzellen? Oder bewirken die Tumoren, daß normale * Bücher fand mit der Streulichtmethode für beide Proteine 90000. ** Zusatz 1961. Ausgehend von dieser Arbeit hat sich in den letzten Jahren eine klinische Enzymologie des Blutserums entwickelt. 72 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste Körperzellen Gärungsfermente an den Kreislauf angeben ? Und können Tumor- zellen solche Gärungsfermente in ihr Protoplasma einbauen ? Dann würde man das Wachstum der Tumoren im Körper und ihren parasitischen Charakter besser ver- stehen; und man würde auch verstehen, warum die Gewebekultur keine Auskunft über das Verhalten der Tumorzellen im Körper gibt.* Literatur 1 Engelhardt, W. A., The Yale J. of BiolTa. Med. 15 (1942), Nr. 1. 2 Biochem. Z. 286 (1936), 81. 3 Bioch. Z. 310 (1941), 384. 4 Biochem. Z. 303 (1939), 231. 5 Biochem. Z. 314 (1943), 149. 6 Biochem. Z. 314 (1943), 149. 7 Biochem. Z. 303 (1939), 40. 7a Biochimica et Biophysica 1 (19471, 292. 8 Biochem. Z. 310 (1941), 384. 9 Biochem. Z. 314 (1943), 94. 10 Biochem. Z. 159 (1925), 58. 11 Biochem. Z. 303 (1939), 132. 12 Harden, A., und Young, W. J., Proc. Chem. Soc. (1905), 189; Proc. Roy. Soc. B. 80 (1908), 299. 13 Biochem. Z. 314 (1943), 399. 21 * Zusatz 1961. Antwort in Arbeit 22 dieses Buchs. 3 Über den Quantenbedarf der Kohlensäureassimilation.* Von Otto Warburg Nach Robert Emerson, James Franck und Hans Gaffron1 wird die photo- chemische Reduktion der Kohlensäure in grünen Pflanzenzellen durch einen photochemischen „Ausstoß" von Kohlensäure eingeleitet. Belichtet man also vor- her verdunkelte grüne Zellen in Gegenwart von Kohlensäure, so soll in den ersten Belichtungsminuten keine Kohlensäure von den Zellen absorbiert, sondern um- gekehrt Kohlensäure aus den Zellen entwickelt werden. Da mich die Versuche nicht überzeugten und mir das Ergebnis unwahrscheinlich erschien, habe ich eine Methode ausgearbeitet, um den assimilatorischen Quotienten Kohlensäure absorbiert V = Sauerstoff entwickelt für Zeitintervalle von einigen Minuten zu bestimmen. Das Prinzip der manometrischen Methode ist in der Fig. 1 angedeutet. Chlorella, suspendiert in Knopscher Lösung und gesättigt mit 10 Vol. % CO2 in 0>, wurde hintereinander in demselben Gefäß in wenig und in viel Flüssigkeit belichtet, wo- bei die Intensität des Lichts konstant und die Absorption des Lichts vollständig Fig. 1. Manometergefäß von etwa 15 ccm Gesamtvolumen. Die Flüssigkeitsmenge beträgt 5 ccm oder 8 ccm, während die Zellmenge konstant bleibt. Belichtet wird mit rotem Licht des Bezirks 635 bis 675 m//. war. Waren die Flüssigkeitsvolumina verschieden, so waren auch die Druck- änderungen verschieden und aus dieser Verschiedenheit konnte der assimila- torische Quotient y — für Zeitintervalle von 3 bis 5 Minuten — berechnet werden. * Aus: Die Naturwissenschaften 33 (1946): 122. Zusatz 1961. Bei einem Besuch in Emersons Laboratorium in Urbana 'Illinois im Jahr 1948 war Emerson nicht imstande, trotz eines Aufenthaltes von mehreren Monaten, mir den Ausstoß der Kohlensäure durch ein Experiment zu zeigen. Der Ausstoß der Kohlensäure bei den früheren Experimenten Emersons war vorge- täuscht worden durch zu langsames Schütteln der beiden Gefäße bei der 2-Gefäß- Methode. Das erste Erfordernis dieser Methode, Konstanz der manometrischen Ausschläge bei Vermehrung der Schüttelgeschwindigkeit, war von Emerson nicht beachtet worden. 74 Über den Quantenbedarf der Kohlensäureassimilation Ich fand y = 0,95, sowohl in den ersten Belichtungsminuten nach längerer Ver- dunkelung, als auch bei fortgesetzter Belichtung. Es wurde also zu keiner Zeit Kohlensäure aus den Zellen photochemisch entwickelt; sondern es wurde, dem Sinn der Kohlensäureassimilation entsprechend, immer Kohlensäure absorbiert und etwa das gleiche Volumen Sauerstoff entwickelt. Wäre es wahr gewesen, daß die photochemische Reduktion der Kohlensäure mit einem Ausstoß von Kohlensäure anfängt, so wären die meisten neuzeitlichen Assimilationsmessungen falsch gewesen und es wäre vor allem der Energieumsatz bei der Kohlensäureassimilation falsch berechnet worden. So aber bleibt es dabei, daß von dem Chlorophyll der grünen Pflanzen 4 Lichtquanten (gleichgültig wel- cher Wellenlänge) absorbiert werden müssen, damit 1 Molekül Kohlensäure unter Entwicklung von Sauerstoff reduziert wird : CO-2 + H20 + 4 h • v = CH20 + 02. In der ausführlichen Arbeit wird außer der Methode der y-Bestimmung auch eine neue und wesentlich vereinfachte Methode zur Bestimmung des Energie- umsatzes beschrieben werden. Literatur 1 Emerson, R., und Lewis, Ch. M., Amer. Journ. of 2 Warburg, O., und Negelein, E., Z. f. physikalische Botany 26 (1939), 808. James Franck und Hans Gaf- Chem. 106 (1923), 191. fron, Advances in Enzymology 1 (1941), 199. 4 A Manometric Actinometer for the Visible Spectrum7' Otto Warburg and Victor Schocken The actinometer to be described in this paper is based upon the work of H. v. Tappeiner1, who discovered the sensitization of photooxidation processes by dyes; upon that of S. E. Sheppard"2, who discovered the role of sulfur Compounds, especially of allyl thiourea, in the photochemical process of photography ; and upon the manometric and bolometric method developed at Dahlem for the measurement of the quantum yield of photosynthesis3a* b. In 1926, Warburg and Gaffron4 determined the quantum yield of photooxidation of allyl thiourea when sensitized by Chlorophyll or porphyrin by these methods. The result was that 1 molecule of oxygen reacts, if 1 light-quantum is absorbed by the sensitizers, that means that the quantum yield waswere taken up. Summary A chemical actinometer has been described, by which quantum intensities in the greater part of the visible spectrum can be measured manometrically. References 1 Tappeiner, H. v., Ergeb. Physiol. 8 (1909), 698. 4 Gaffron, H., Chem. Ber. 60 (1.927), 755. 2 Sheppard, S. E., Phot. J. 65 (1925), 380. 5 Warburg, O., and Negelein, E., Chem. Ber. 63(1930), 3a Warburg, O., Biochem. Z. 100 (1919), 230. 1816. lemberg, R., Biochem. J. 29 (1935), 1322; 3b Warburg, O., and Negelein, E., Z. physik. Chem. Stier, E., Z. phvsiol. Chem. 275 (1942), 155. 102 (1922), 236; 106 (1923), 191. 5 The Quantum Efficiency of Photosynthesis* By Otto Warburg, Dean Burk, Victor Schocken and Sterling B. Hendricks Photosynthesis is a unique endothermic photochemical reaction in which chemical energy is gained from visible light energy by the combined action of several quanta. Nothing similar is known in the nonliving world. It was first reported a quarter of a Century ago1 that in photosynthesis the greater part of the absorbed visible light energy could be converted into chemical energy under optimum condi- tions. Indeed, no more than four quanta of red light seemed to be necessary to produce one molecule of oxygen gas, which is close to the thermodynamic require- ment of three quanta. It is easy to understand that this result, lacking any analogy, has sometimes been doubted by theoreticians, and it is a fact that certain investi- gators have raised methodological objections2. For this reason we have reinvesti- gated the question of the minimum quantum requirement of photosynthesis as measured by oxygen and carbon dioxide gas exchange. The present paper is a short summary of our findings by new and simplified methods. I. Cultivation of Cells A strain of Chlorella pyrenoidosa, isolated in New England and identified by Dr. Florence Meier of the Smithsonian Institution, and for many years in laboratory use, was cultivated in tall Drechsel gas washing bottles containing 200 ml of the following salt Solution: 5 g MgS04 ■ 7 H20, 2.5 g KNOs, 2.5 g KH2P04, 2 g NaCI, and 5 mg FeS04 • 7 H20, in 1 liter of filtered, unsterilized well water (pH 4.5—5). The cultures were maintained at a room temperature of 25 — 30° C, and were aerated with 5% C02 in air at a rate (-500 ml per minute) rapid enough to prevent cell settling, and were constantly illuminated with a 100-watt incandescent lamp at a distance of about 30 cm. Cells cultivated by this method gave more uniform material and more regulär manometric results than when cultivated by the older method Ci> p- 427) in which slowly aerated cells settled down in Erlenmeyer-shaped flasks and became partially anaerobic until reshaken up, and in which lowered light intensities were employed for the terminal cultivation phase. The cultures were used for the experiments in the present work after 2—10 days growth, when they contained 200—1000 u\ cells, depending upon the amount of initial inoculation. Usually 50—100 /d cells per 200 ml medium were employed as inoculum, grown as just indicated. Bacterial growth during either cell culturing or manometric experiments was found with a haemocytometer to be negligible, due to the low pH, the lack of added organic matter in the synthetic medium, and possible antibiotics produced by the Chlorella. The cells for experimental use were centrifuged in an International No. 2 Centri- * Aus Biochimica et Biophysica Acta 4 (1950): 335. The Quantum Efficiency of Photosynthesis 81 fuge at the lowest possible speed giving nearly complete settling in 10 minutes and were taken up, with or without further washing, in fresh nutrient medium at a concentration of 30 — 50 //l cells per ml. II. Monochromator A Steinheil glass 3-prism spectrograph operated with a focal lenght of 195 mm at F 3.5 for the collimator and a focal length of 710 mm for the telescope was used as a monochromator. The slit was illuminated with a 750-watt projection lamp. The image of the coiled filament at about 20° to its plane was projected onto the slit with an auxiliary lens. A 1000-watt voltage regulator was used to supply power to the lamp which operated at constant current. The width of the entrance slit was about 2 mm, corresponding to about 20 mi< in the red. A slit was placed in the focal plane of the telescope and was adjusted to have a width of about 30 m// covering the region 630 to 660 m/i. A lens was placed behind this slit to throw, in a weakly convergent beam, an image of the exit prism face on the bottom of the manometer vessel. The area of the beam at the vessel was about 3 cm2 and the energy flux was about 0.6 microeinsteins/min. This intensity was decreased when desired by placing in the light beam, just before the exit slit, blackened wire screens cali- brated by the National Bureau of Standards. III. Measurement of Light Energy The energy of the light beam was measured by the recently developed chemical actinometer3 whereby for each quantum of visible light absorbed one molecule of O2 is consumed. In the same or similar rectangular vessel as used for the yield determinations were placed 2 mg ethyl chlorophyllide, 200 mg thiourea, 7 ml Pyridine, and Oz gas. The actinometer vessel was shaken in the thermostat at 20° C in the same manner and in the same cross-section of the light beam as the vessels with the cell suspensions were shaken during the yield determination. The total intensity of light, absorbed by the actinometer, should not exceed 0.3 micro- einsteins per minute under our working conditions. Higher intensities, as used for the yield determinations, were diminished for this purpose by the calibrated screens. Several 10 minute periods were observed for every actinometer determination. When in t minutes the pressure change in the actinometer vessel is ho2 tnm, the total energy flux in the light beam in t minutes is °02 °2 or -~~- microeinsteins (micromole quanta), where the vessel constant ko2 is expressed in mm2. Then, when the oxygen developed by illuminating the green algae is n u\ and the oxygen absorbed in the actinometer for the same time and beam of light is n' ///, the quan- tum requirement per mol of 0> developed in photosynthesis is simply I/9? = n'jn. 6 Warburg, Zellphysiologie 82 The Quantum Efficiency of Photosynthesis IV. Comments on the 2-Vessel Manometric Method If the yield q> and the assimilatory quotient, y = ^ ' , are to be determined simultaneously, two vessels must be employed. If H be the pressure change in vessel I and H' that in vessel II, the xo2 and jcco-2 values can be calculated by well known equations (see 1 and section 8). The 2-vessel method, simple when the gas-exchanges in the dark are deter- mined, requires special attention when applied to illuminated cells. As will be shown later, the illumination of the cells is an illumination with intermittent light. This intermittency should be equal in the two vessels, and this is attainable if the liquid volumes are equal in both vessels. Furthermore, the respiration in most cell suspensions gradually changes with time, so that the pressure changes in light will also change with time, Thus the two vessels should be darkened and illuminated simultaneously so that the conditions of the aforementioned equations are fulfilled, namely 3 Xo2 = x o2 xco2 = x'co2 where the primed magnitudes refer to one vessel and the non-primed to the other. These conditions may be satisfactorily met by the method of alternately shifting the mirror under the two vessels at periods of, e.g., 10 minutes, as indicated in Fig. 1, and discussed in the next section. After two or more cycles, the pressure readings for each vessel for light and dark periods may be averaged and the light action calculated from the differences between the pressure changes in light and dark. A possible error involving noncomparability of time periods is thus eliminated. This error has been one of the main sources of difficulty in C///on?//a-photosynthesis experiments with the 2-vessel method. V. Procedure Simple Haldane-Barcroft constant-volume manometers with small capillaries (0.8 mm diameter) with rectangular vessels attached were shaken horizontally (not by are motion) at 140 — 180 (usually 150) cycles per minute at an amplitude of 2.0 cm in a water bath at 20°C. The two rectangular vessels of about 2.2 ;■; 3.8 cm inside width and length and 13 — 14 and 18 — 19 ml volume respectively, were filled with 200 — 400 u\ cells in 7 ml, thus the liquid volumes were identical and the gas spaces differed. The vessels (with capillary sidearm vents) were gassed on the bath, simultaneously with aid of a manifold, and with shaking. The horizontal (not are) shaking was so effective that physical after-effects of gas equilibration in the transition periods of dark to light and vice versa were not appreciable even when the illumination produced photosynthesis far above the compensation point and pressure changes of 5 — 10 mm per minute were involved. The manometers were usually read without stopping. The end of the manometer male Joint was not flat rough but coneave and polished, so that bubble formation in the cappillary did not oeeur; nor did foaming. As indicated in Fig. 1 a beam of red light (630 — 660 m/i) of about 3 — 4 cm2 area, The Quantum Efficiency of Photosynthesis 83 produced by means of the Steinheil monochromator, entered the side of the ther- mostat through a two walled window and was reflected by a mirror onto the bot- tom of a vessel, alternately in the one or the other by either shifting the mirror or the manometers, depending on the design of the experiment. The red light entering the vessel was completely absorbed. To accomplish this, the amount of cells must be sufficiently great. The amount depends upon the Chlorophyll content of the cells. It was found safe, to avoid loss of light, to have 300 /i\ of cells in each vessel. 100 Watt incandescent (White hght) Winao»/ ot thermoitct Rea light ot measurea intensity To manometer vented Stoppers- Q= Mirror No influence of the cell concentration on the yield was observed when light ab- sorption was complete and shaking adequate. By this method, both Oi and CO2 exchanges were obtained simultaneously and independently for any and every desired period of measurement, and every yield determination was connected with an experimental determination of the relationship CO2/O2, so that earlier uncer- tainties concerning this ratio (}') were eliminated. VI. Intermittency of Illumination The cross-section of the light beam entering the vessels was about 3 cm2, that is, 3/8 of the bottom area of the vessel. It can be calculated, if we disregard the scat- tering of light, that the major part of the red light (75%) is absorbed within a distance of about 1 mm from the bottom of the vessel. This means that the light absorbing volume is only about 1 20 of the 7 ml of the cell-suspension. Let now the intensity of the red light be so strong, that the oxygen consumption of the whole cell Suspension is compensated by the oxygen evolution (compensa- tion point for O2). Then the oxygen development in the absorbing volume of the cell Suspension may approach 20 times the point where the cells become saturated with light and the increment yield zero (with our cell conditions the Saturation intensity is about 30 — 40 times the compensation intensity). But we obtain maxi- mum or high yields when the vessels are shaken as described at not only compen- sating but even considerably higher intensities, when the latter are provided by white light. This proves that under our shaking conditions the cells alternate so 84 The Quantum Efficiency of Photosynthesis frequently between darkness and illumination that the concentrations of the parti- cipants of all dark reactions virtually retain their dark values — a consideration which shows the methodological importance of the kind and rate of shaking. VII. Yield Determinations above the Compensation Point A limiting feature of most earlier yield determinations was the low total light intensity, so low that only a fraction of the respiration was compensated for by the light action. Thus the yield determinations were in a sense determinations of inhi- bited or diminished respiration. We have changed this Situation by illuminating the vessels from above the thermostat by a 100-watt constant-voltage incandescent lamp (as diagrammed in Fig. 1), at such a distance that the pressure changes in the vessels become zero or positive ; yield determinations were then made with measured amounts of red light added in the usual manner from below the vessel. The intensity of the white light at the vessel surface was considerably smaller per unit area than that of the red light but covered a many fold greater area and hence provided much more total effective light than did the red beam. Owing to this relationship of inten- sives it was possible to eliminate repiration as an experimental quantity, and to Start the yield experiments at positive rather than negative pressures, and yet still obtain (as experience showed) virtually as good yields from the red light, whether the base line were darkness or the white light. Another limiting feature of the earlier yield experiments was the short duration of not only the periods of illumination (lOminutes) but also the total length of the experiment (commonly less than one hour). By the use of white light we have now succeeded in extending the duration of the manometric yield experiments up to at least 10 hours, if not indefinitely. The effects of this important advance are several. In general, the yields may now be determined under nearly the same conditions as obtain during the growth and cultivation of the cells, since the light intensity, temperature, medium, and gas phase during the growth and manometry are essen- tially the same, and furthermore we have found that the shaking does not change the cells under these conditions. VIII. Examples of Data Protocols 1, 2, and 3 provide examples of the data obtained. PROTOCOL No. 1 Experiment of V-26-49. 20r,C. 630—660 mu. 5% C02 in air. 260 //l of cells per vessel. Each vessel alternating 10' in dark and 10' red light; thus when vessel No. 5 was dark, vessel No. 3 was illuminatid, and vice versa. Vessel No. 5 Vessel No. 3 V = 13.913 ml V = 17.993 ml vf = 7.000 ml Vf = 7.000 ml k'o2 = 0.665 k'co2 = = i.235 ko2 = 1.046 kco2 = 1-634 80' dark— 91.5 mm 80' dark —26.5 mm 80' light + 1.5 mm 80' light -1 15.0 mm 80' H' + 93.0 mm 80' H + 41.5 mm The Quantum Efficiency of Photosynthesis H • kC02 -- H' ■ k'o2 85 (Equation 1) Action of light in 80' xo2 = kco2 ko2 k' CQ2 k' o2 {Equation 2) H • k<>, — H' • kco2 xco2 = ko2 k' + 151 /d 168 »1 o2 kc Actinometer : 8.83 //l O, per minute 1 80 • 8.83 Quantum efficiency for 02, 1 Quantum efficiency for CO,, 151 80 • 8.83 Assimilatory quotient, } CO,
56 Calculation of quantum efficiency for experiment II (White ± Red) In 25':H i 11.3 mm H' f 22.5 mm Applying equations (1) and (2), protocol (I) In 25' xo2 XCO-2 30.3 ,/d \ 27.2 /d | Quantum efficiency for O2, Quantum efficiency for CO-j V CQ2 Oo 25 0.90 5.4 30.3 25- 5.4 27 4.5 5.0 Experiment III, with the same cells, was performed between experiments I and II, the white light being, however, of somewhat lower intensity. Here only one vessel (No. 5) was used; but if we take as y the average value of experiments I and II, that is — 0.85, xo2 can be calculated according to equation (3), protocol (1). The readings in vessel (5) were: No. 5 5' white ! 5.0 mm 5 '(white 5' white ! 6.5 mm 5'(white 5' white 6.5 mm 5 '(white 5' white f 5.5 mm 5 '(white 5' white + 7.0 mm 5 '(white red) + red) + red) + red) + red) + 11.5 mm 9.5 mm 9.5 mm 13.0 mm 15.0 mm and with y 0.85 25' white + 30.5 mm 25'(white + red) + 58.5 mm 25':H' == 58.5 — 30.5 = + 28 mm 25' xo, = + 34 /d The quantum efficiency with the actinometer value of experiments I and II (5.4 /d O2 per minute) was 25 • 5.4 34 = 4.0 for O2 The total duration of these experiments was 7 hours from the time of initial equilibration until 1 the last yield determination that gave a value — 4.5 for oxygen, which was obtained at approxi- mately 4 times the compensation point. The final pH in the cell suspensions was 5.4. The Quantum Efficiency of Photosynthesis 87 PROTOCOL No. 3 Comparison of the yield in carbonate-bicarbonate mixtures and in culture medium Experiment of VI-1-49. 20° C. 630 — 660 m/t. Three vessels, in each 7 ml cell Suspension, containing 200 /d of cells. Cultures centrifuged, then washed once in, and taken up in, carbonate- bicarbonate mixture. Intensity 5.4 /d O? per minute. I. Vessel No. 7. V = 13.824 ml Vf = 7.00 ml ko2 = 0.657 Gas space air. Solution 85 parts M/10 NaHC03 tion point with white ligin. 15 parts M/10 K2CO3; pH 9.2. At compensa- 15' white light 0 15' white light | red light 11.5 mm 15' white light 0 15' white light — red light 11.5 mm 15' white light 0.5 mm Light action 30' 23 + 0.5 + 23.5 r 1 30 • 5.4 162 cP 15.4 15.4 = 10.5 15.4 /d II. Vessels Nos. 3 and 5, containing 7 ml culture medium, pH 4.9, with 200 //l of cells each. Cultures centrifuged, then washed once in, and taken up in, fresh culture medium. Gas Space 5% CO2 in air. Mirror shifted every 10' from one vessel to the other; actinometer 5.4 /d O2 per minute for red light. No. 3 No. 5 V = 17.993 ml V = 13.913 ml Vf = 7.000 ml Vf = 7.000 ml ko2 = 1.046 k'o2 = 0.665 kco2 1.634 k'co2 = 1-253 15' white light + 11.0 mm 15' white light + red light + 29.5 mm 15' white light red light + 17.0 mm 15' white light 15.5 mm 15' white light 10.5 mm 15' white light -f red light + 29.0 mm 15' white light red light 16.0 mm 15' white light 17.5 mm 30' H = I 11.5 mm 30' H' = + 25.5 mm xo2 XCO2 : = + 41.3 -43.0 mm \y = - 1.04 mm ) ' 1
500
ml/min) that no Sedimentation of the cells occurred. They were illuminated with a
100-w incandescent lamp that raised the temperature in the bottles to 25 — 30° C.
* Republished from Science 110 (1949): 225 by permission.
The Maximum Efnciency of Photosynthesis : A Rediscovery 93
After several days, when the cells had multiplied several fold, and the pH had risen
0.5 to 1 unit, the cultures were used for yield experiments. Such cells gave stable
respiration values and high yields without exception. This culture method, which
had been employed by one of us (D.B.) for many years in Washington, was found
to be an important improvement over the method of 1923 l followed by most later
investigators but which we have now discarded. In the earlier method, slowly
aerated cells settled down in Erlenmeyer flasks in Sediments that were inadequately
illuminated and inadequately supplied with carbon dioxide and oxygen until
reshaken up.
Manometry. Approximately 300 mm3 of cells, resuspended in 7 cm3 of a fresh
culture medium of pH 4.9, were put into rectangular vessels of 14 to 20 cm3
volume and saturated with 5 percent CO-2 in air. Two vessels were used to deter-
mine, as described in 19243, the oxygen as well as the carbon dioxide exchange
The gas volumes in the two vessels were different, but the volumes of the Solutions
and therefore the concentrations of the cells were equal. The vessels were shaken
at 20° C. by horizontal motion, with an amplitude of 2 cm. and a frequency of
150 per min. In spite of this rapid motion, which moved the vessels 600 cm. per
minute, no splashing or foaming occurred, even in experiments of more than 20 hr.
duration. It was a further improvement owing to this motion that physical tran-
sition effects were not observed upon change from dark to light and vice versa, that
is, the gas equilibration was virtually perfect for our purposes.
The well known requirement of the two-vessel method, that the metabolism in
the two vessels must be identical (jco2 = x'o* and xcoo = x'coo) was complied
with by eliminating a dangerous differential time factor as nearly as possible.The
light beam of measured intensity (630 to 660 m//) was shifted by a mirror alternately
from one vessel to the other at intervals of 10 — 60 min. or these vessels were shifted
alternately into and out of the fixed light beam. Thus in every case the one vessel
was illuminated when the other vessel was dark and vice versa, and when many
light and dark periods followed each other and the pressure changes of all dark
periods and of all light periods were summed, the metabolism in the two vessels
was virtually identical for the same periods of elapsed time. The total pressure
changes effected by light were usually of the order of magnitude of + 20 to + 50
mm. These figures were differences between two rates of oxygen consumption
(negative pressure changes) in the experiments with noncompensated respiration.
But when the respiration was compensated by white light (see following section)
the figures + 20 to -) 50 mm. were the directly observed positive pressure changes,
produced by the added red light. To measure such great pressure changes simple
Haldane-Barcroft blood-gas manometers could be used instead of the special
differential manometer heretofore employed.
Measurement of the quantum intensity. The bolometer used in 1923 was replaced by
the chemical actinometer described a few months ago(i. This resulted not only
in a simplification but in an improvement in accuracy. When the oxygen produced
by the red light been measured, the vessel containing the cells was replaced by a
similar vessel containing 2 mg. of ethyl chlorophyllide, 200 mg. of thiourea and
94 The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery
7 cm.3 of pyridine, with tank oxygen as the gas phase. The light absorption being
complete in the cell Suspension as well as in the ethylchlorophyllide Solution, the
quantum requirement per molecule oxygen was obtained by the very simple
equation : 1 h • v O2 consumed by the actinometer,
0 ~ O2 O2 produced by the cells
where the consumption and the production of the oxygen must be calculated for
equal time periods.
Complete absorption is the only method so far devised by which the absorption of
the light and the action of the light can be measured manometrically under the
same conditions. Thus far all manometric determinations of quantum requirements
using incomplete absorption are contradictory and uncertain. On the other hand,
the main objection against the method of complete absorption was the existence
of too great a respiration relative to the measured light action; this objection
is no longer valid because today respiration can be eliminated by compensating
with white light or components thereof (see the following section).
A New Principle
Let us consider a Chlorella Suspension, shaken in a beam of red light that is absorbed
completely, to be a machine that transforms light energy into chemical energy. The
efficiency of this machine will be known if we know the light energy entering the
vessel and the amount of oxygen developed in it, one mole of oxygen being equi-
valent to the production of about 112,000 cal. Notheory ofthe mechanism of this
energy transformation can alter the observed result of such an efficiency determi-
nation.
Yet there are possible objections to be answered. When at low light intensities
respiration still exceeds photosynthesis, then our machine does not produce a
net gain of chemical energy, and it might be considered that the light merely inhi-
bits the loss of chemical energy. Since respiration is a catalytic process. conceivably
its inhibition by light could be merely anticatalytic, requiring no expenditure of
energy. Hence the calculation of the efficiency might be safe thermodynamically
only when the light intensities are so high that oxygen is in fact given off from the
cell suspensions into the gas space.
To comply with this requirement we illuminated the cell suspensions with white
light (of nonmeasured intensity) over the greater part of the vessel surface, the
light intensity per unit area being relatively small, but the influx of light energy
through the total area ofthe vessel being sufficient to compensate or overcompen-
sate the respiration ofthe cell suspensions. As the compensating light intensity we
define here that light intensity which effects the result no oxygen enters or leaves
the cell Suspension. It is very likely that in this State the oxygen exchange of all
cells in the Suspension is zero, owing to the rapid motion ofthe cells. It is obvious
that our compensating light intensity varies with the amount of cells in the vessel
and is not to be confused with the compensating light intensity for very thin cell
suspensions.
The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery 95
When the steady State in the white light was reached, a beam of red light of
measured intensity was sent through the bottom of the vessel into the cell Suspen-
sion, the cross section of the beam being 3 cm.2 and the total energy flux about
0.25 microeinsteins/min. It was completely absorbed in the cell Suspension. The
increase of positive pressure efTected by the red light and the intensity of the red
light were the two magnitudes from which the efficiency of the energy transforma-
tion of the added red light was calculated. The efficiency so found with red light
proved to be as high, at and several fold above the compensation point with white
light, as the efficiency at zero or low white light intensities below the compensation
point (3 to 5 quanta per Oz molecule developed; see Examples 1 — 5).
This result raised the whole level of certainty in this field of investigation, and
is probably owing in large part to the rapid motion of a great amount of cells.
The time of illumination with red light of relatively high intensity must be so short
for every cell that no Blackman or other dark reaction limits the action of the light;
in other words the product of light intensity and time (i X t) must be tco small to
alter the concentrations of dark reactions. The observed efficiency is, of course, a
fact that is independent of all theories about what happens in the cell suspensions,
chemically or physically.
Another factor that might limit the certainty of efficiency determinations is time
of illumination. The shorter the time periods, the greater is the danger that the
energy of some dark reaction contributes to the oxygen production. The longer the
time periods, the more certain are we that we have reached the thermodynamically
desirable State in which the concentrations of all cell constituents are kept constant.
From 10 min. in 1923 * and 15 min. in 19485 we have now extended the time
periods to more than 20 hr. of continuous illumination with white light, producing
contmuous positive pressure, and have varied the periods of the efficiency deter-
minations with added red light from 5 to 60 min. This great improvement was
possible because the horizontal motion of the rectangular vessels did not damage
the photosynthetic capacity of the cells and because the white light, when it over-
compensated respiration, stabilized the chemical conditions in the cells. In fact,
the efficiency of the energy transformation has now been measured under the
conditions of growth, so that very likcly the experiments can be extended to any
length of time.
Nonaction of Light on Respiration
If the manometric efficiency of the red light is the same when the respiration of the
cell suspensions is noncompensated, compensated, or several fold overcompensated
by added unmeasured white light, then obviously every theory should be rejected
that assumes that light acts on the process of respiration anticatalytically or stoichio-
metrically. This conclusion has now been confirmed independently by the follow-
ing type of experimentation :
A rectangular vessel was set up to contain NaOH and glass beads in two side
arms, 300 mm.3 of cells in 7 ml. of culture medium (pH 4.5—5) in the main com-
partment, and air in the gas phase. The vessel was shaken at 20° C. slowly or ra-
96
The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery
pidly, and in the dark or in the light. By changing the rate of shaking the steady-
state pressures of CO2 in liquid and gas phases were changed, but in the dark this
had no effect on the observed rate of respiration. In the light, the rate of oxygen
consumption decreased in the slowly shaken vessel ; but in the rapidly shaken vessel,
where the steady-state pressure of CO2 was lower, no action of light on the rate of
oxygen consumption was observed when the intensity of the light entering the vessel
was about 0.25 microeinsteins/min., an intensity that with adequately high CO2
pressures gave high photosynthetic efficiencies (3 to 5 quanta per molecule of O2
developed). The shaking effect was reversible, the action of the light alternately
appearing or disappearing with decreasing or increasing shaking rate.
The experiments may be extended to higher light intensities, but the higher the
light intensity the more effective must be the removal of the carbon dioxide, for
which the light and the alkali compete. The CO2 pressure required to yield maxi-
mum respiration is clearly below that needed for effective photosynthesis where
CO2, functions as subtrate and not merely catalytically.
Such experiments prove that the light did not interfere with the process of
respiration, either anticatalytically or stoichiometrically by reduction of inter-
mediates.* Light, when it compensated respiration, did so by producing oxygen,
and because the gas exchange of photosynthesis happens to be the reverse of the
gas exchange of respiration. Thus a question, old as the science of photosynthesis,
has been answered by the most simple of experiments.
Examples
1. Manometric pressure changes effected by red light when respiration was not compensated
by white light. Two-vessel method, culture medium pH 5, gas phase 5% CO> in air. 20° C
Vessel I Vessel II
v == 13.913, vF = 7.00 v' = 17.993, v'F = 7.00
Actinometer 5.4 mm.3 CWmin
Vessel I
10 min dark — 26 mm
10 min dark — 23 mm
10 min dark — 23 mm
10 min dark -23 mm
Vessel II
10 min dark — 12 mm
10 min dark — 10 mm
10 min dark — 11 mm
10 min dark —11 mm
40 min dark
— 95 mm
40 min dark
— 44 mm
10 min light
10 min light
10 min light
10 min light
-17 mm
-15 mm
— 14 mm
— 15 mm
10 min light
10 min light
10 min light
10 min light
— 7 mm
— 7 mm
— 7 mm
— 7 mm
40 min light
— 61 mm
40 min light
-28 mm
Light action
34 mm
Light action
; 16 mm
xo2 in 40 min — 51.6 mm.3
*co2 m 40 min — 53.7 mm.3
1 hv 40 ■ 5.4
~0 ~
O.,
51.6
CQ2
4.2
1.04
* Zusatz 1961. Aber vergleiche Arbeit 11 dieses Buchs.
The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery
97
2. Manometric pressure changes effected by red light at 20nC, when respiration was over-
compensated by white light. pH 5.0. gas phase 5% CO-j in air. Actinometer for red light 5.4
mm3. 0> min. TT
Vessel I Vessel II
v = 13.913, vf = 7.00 v' = 17.993, v'¥ = 7.00
Vessel I
5 min white
18.5 mm
5 min white -
red
-22 mm
5 min white
18.0 mm
5 min white
red
- 22.5 mm
5 min white
16.5 mm
5 min white
red
- 22 mm
5 min white
f 17.5 mm
5 min white
red
20.5 mm
5 min white
r 17.0 mm
5 min white
red
- 23.0 mm
25 min white
87.5 mm. 25 min white - red = -j 110 mm.
Action of red light - 22.5 mm in 25 min.
Vessel II
5 min white
-j-
14 mm
5 min white
red
15 mm
5 min white
-\-
14 mm
5 min white
red
16.5 mm
5 min white
+
12.5 mm
5 min white
red
16.5 mm
5 min white
-f-
14.0 mm
5 min white
red
14.0 mm
5 min white
—
11.5 mm
5 min white
red
15.0 mm
5 min white
-f-
12.0 mm
5 min white
red
14.5 mm
30 min white
78 mm 30 min white - red =
91.5 mm
Action of red light - 13.5 mm in 30 min.
xo» in 25 min 30.3 mm3 | CO2
XCO2 m 25 min — 27.2 mm3 | ' O2
1_ hv_ 25 ■ 5.4
0 " Oo 30.3
= 4.5
0.9
For the same culture, when the respiration was not compensated by white light, we obtained
1 hv 60- 5.4
3> == oT = 70.4
4.6
and
CO2
02
0.8
3. Manometric vessels continuously illuminated for 27 hr. by white light of approximately
compensating intensity. — — , for the added red light, at the beginning and end of the expe-
riment.
In hours 1 to 4 respiration compensated,
In hours 20 to 22, respiration compensated,
~0
1
= 4.5 (;- = - 1.0)
= 4.5 (-/ = - 1.0)
In hours 27 to 28, respiration not compensated, — = 3.5 (y
1.27)
4. Comparison of same culture in M/10 carbonate buffer (pH 9) and in culture medium (pH 5).
* It may be gathered from this example that the efficiency in the unnatural carbonate buffer is
only a fraction of the efficiency in culture medium. Many investigators believed that the efficiencies
in both solutions were equal, and this was one of the reasons why the quantum requirement of 4
was denied by them and the figures 10 to 12 accepted.
7 Warburg, Zellphysiologie
98
The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery
Red light, 630 — 660 m //. I ~ 0.25 microeinsteins/min 20° C.
1 hv
Quantum requirement — = for the added red light.
1
In carbonate buffer, respiration compensated by white light, — = = 10.5
In culture medium, respiration compensated by white light, — = 3.9 (y = - 1.04)
In carbonate buffer, respiration not compensad — = 9.8
In culture medium, respiration not compensated
0
3.6 (y = 1.18)
In carbonate buffer, respiration not compensated — =11.3
5. Results by 2-vessel method for a series of experiments that were carried out from May 26 to
June 16 of this year, at 20° C, in culture medium at pH 5, with an intensity of red light not exceeding
0.25 microeinsteins/min. No experiment is omitted.
1
0
hv
O,
3.2
4.6
4.5
3.9
3.6
4.2
2.8
2.8
2.5
4.5
4.7
3.5
4.2
3.0
CO-2
o2
- 1.08
- 0.80
-0.90*
- 1.04
- 1.18
-0.97
— 1.16
-1.23
- 1.25
1.00**
-0.93**
- 1.27
- 1.00
- 1.33
Average 3.7
1.08
It may gathered from Example 5 that the quantum requirement for carbon
dioxide consumed can be equal to or somewhat greater or smaller than the require-
ment for oxygen produced. For we have
1 1 hv 02 j™_
" co2 '
0
O, CO.,
a magnitude which here for the first time, to our knowledge, has been determined
in nutrient medium at low pH (about 5), and has been found to approximate
hv_
~ CS
CO
m o m o m in
r\ r\ *\ #"\ *\ *\
T- 1 T-H tH CS T—< T-H
lO LTJ O O
*\ ^ r\ f
i— I i— I CS i— I
m u) m m
i— l i— l CS i— l
O O O
r, f\ r*
I- 1 r-< CS
u u u u
^5 ^ ^ rg
uPdiPoPüP
.PT3.PT3.PT3.PT3
3 _L - —
(2)
Bei nicht zu hohen Lichtintensitäten aber ist e
0.15
1
OJZ
009
0.06
0.03
X
-
1
1
1
1
0.5 Iß 1.5
20
2.5 3.0 3,5 HO V
COfDmck (°/o einer Atmosphäre) — i
5.0
Abb. 1. Quantenausbeute tp == O2/ÄV als Funk-
tion des CO-2-Drucks. Messungen mit der
2-Gefäßmethode in saurem Medium. Mes-
sungen mit der 1 -Gefäßmethode in alkalischer
Bicarbonat-Carbonat-Lösung bei 20° C.
Weitere Steigerung des Energiegewinns im Kreisprozeß der Photosynthese 167
Will man das Maximum der Energieausbeute erhalten, so darf die absorbierte
Lichtintensität nicht zu hoch sein. Sie war bei unseren Versuchen im Blau und
Rot etwa 3 mm3 Quanten pro Minute und im Grün etwa 4 mm3 Quanten pro
Minute. Mehrfach wurde geprüft, daß bei Halbierung der Lichtintensität die
Energieausbeute konstant blieb. Die genannten Lichtintensitäten waren, in Anbe-
tracht der guten Ausbeuten, immerhin so hoch, daß pro Stunde etwa das 3fache
des Zellvolumens an Sauerstoff entwickelt wurde, oder, wenn die Kompensation
der Zellatmung mitgerechnet wird, das 4fache Volumen.
Der Quantenbedarf, den wir fanden, war 3 oder darunter. Als Beispiel sei ein
7stündiger Versuch mit der Wellenlänge 644 m// mitgeteilt, bei dem die Zellen
5 Stunden mit dem roten Licht intermittierend belichtet wurden (Protokoll 1).
Wir fanden:
In der 1. und 2. Stunde y = — 1,22 l/tp = 2,84
In der 3. und 4. Stunde y = — 1,23 l/g> = 2,92
In der 5. Stunde y = — 1,22 1/y = 2,98
Mittel 2,91
Dieser Quantenbedarf entspricht einer Energieausbeute von
112000 100 = 88%.
2,91 • 44000
Bedenken wir, daß der Quantenbedarf bei der Photosynthese unabhängig von
der Wellenlänge ist5, so können wir den gleichen Quantenbedarf bei der Wellen-
länge 675 m// annehmen, der Wirkungsgrenze im Rot, und würden hier eine Ener-
gieausbeute von n2000
2,91 • 42000
100 = 92%
erhalten. Da 42000 • 2,68 == 112000 ist, so liegt der theoretische Quantenbedarf
um 2,7.
II. Einfluß des C02-Drucks auf die Energieausbeute
in saurem Medium
Wir bestimmten die Energieausbeute bei C02-Drucken von 0,3% bis 50% einer
Atm. bei 20" in Gemischen von Kohlensäure mit Luft, mit der 2-Gefäßmethode.
Die Zellen waren dabei in dest. Wasser suspendiert. pH war 4 bis 5, die Versuchs-
wellenlänge war die rote Cd-Linie 644 m//. Wir fanden das Maximum der Aus-
beute bei 5%, nur */s des Maximums bei 0,3% und nur einen geringen Bruchteil
des Maximums bei 50% (Protokolle 2 und 3 und Abb. 1), z. B.:
CO-Druck COo ,. hv 02
Atm.-% V--ÖT V(P""~^ ^""Tv
0,33 —1,10 7,30 0,137
0,66 —1,10 5,60 0,179
0,74 —1,13 4,76 0,210
1,75 —1,16 3,60 0,278
5,0 —1,14 2,92 0,342
26,0 —1,16 4,17 0,240
168 Weitere Steigerung des Energiegewinns im Kreisprozeß der Photosynthese
In einer zweiten Versuchsreihe wurde jedes Gasgemisch nur in einem Gefäß
geprüft und zur Berechnung der Ausbeute der Mittelwert von y benutzt, der in
der ersten Versuchsreihe gefunden worden war (Protokoll 3). Die Anordnung
hatte den Vorzug, daß — mit dem geteilten Lichtstrahl — alle 6 Gasgemische an
einem Tag und an ein und derselben Zellsuspension geprüft werden konnten. Das
Ergebnis war nahezu dasselbe wie bei der ersten Versuchsreihe, nämlich (bei 20°) :
C02-Druck
1/ hv
O
nebeneinander in einem sauren Medium, das den CO-2-Druck nicht konstant hält,
und in einem alkalischen Medium, das den CC^-Druck konstant hält, messen, so
würde man im zweiten Fall den 3,0fachen manometrischen Ausschlag H erhalten
müssen. Tatsächlich ist dies sehr nahe der Fall, wenn man — bei gleichen COj-
Drucken — die Photosynthese in Wasser und in dem 95 5-Gemisch Q-^-mol.)
vergleicht.
Wenn nun die Resistenz des 95 5-Gemischs Q-J$-mol.) ausreicht, so reicht die
Resistenz der beiden andern angeführten 1/.5-mo/. Gemische erst recht aus, da die
beiden andern Gemische im gleichen Volumen die 2fache und die 5fache Menge
Carbonat enthalten.
Bei der Herstellung der Gemische ist zu beachten, daß Bicarbonatlösungen im-
mer Carbonat und Carbonatlösungen immer Bicarbonat enthalten, daß also die
Zahlen 95 5 usw. nur das ungefähre Verhältnis der Komponenten angeben. Genau
definiert dagegen sind die Gemische, wenn man y\^-mol. Salzlösungen im Thermo-
Belichtung
Nr. 46
mm beobachtet
Nr. 47
mm beobachtet
CQq
157
i
7
hv
-A644 / =
/.644 I-
-/644 / =
-/.644 /
-/644 I
/644 I
-/.644 /
-/.644 /
- /.644 I
W.644 /
30'
■ •' . _ ig — — ' ■) .
■ ' . — < ili|= •).__
C/j Zl i|J O y Zi £l
■'._ i JJ = <)._ —
— 30
5,2 /a=3,33
5,2 7a=3,33
5,2 /a=3,33
— 30'
5,2 /a=3,41
5,2 4=3,41
— 30'
weiß
30'i
30'i
30'i
30'i
weiß
30'i
30'i
30'i
30'i
weiß
30'i
30'i
weiß
-1,0
3,5
4,0
3,5
4,0
-1,0
4,0
3,5
3,5
3,5
-1,0
4,0
3,5
-1,0
120'
H'
120'
H'
19
18,5
60'
H' + 9,5
-1,0
-3,0
-3,0
-3,0
-3,0
-1,0
3,0
-3,0
-3,0
-2,5
-1,0
-3,0
-3,0
-1,0
120'
H
120'
H
60'
H
8,0
7,5
4,0
— 1,22
k'(hl = 3,6
— 1,23
k'o2 = 3.7
— 1,22
k'o, = 3,6
60 ■ 3,22
3,6- 19
2,84
60 • 3,33
3,7 • 18,5
2,92
30 ■ 3,41
3,6 ■ 9,5
2,98
Tab. 1 (zu Protokoll 1)
170
Weitere Steigerung des Energiegewinnes im Kreisprozeß der Photosynthese
staten mit analysierten Gasgemischen bis zur Sättigung durchströmt (wobei man
am besten die Zellen schon vorher zugibt). Denn nach Gl. [2] ist durch den Salz-
gehalt und den CO-2-Druck das Verhältnis Bicarbonat/Carbonat festgelegt.
COi-Druck
Atm.-%
Anfang 0,42
Ende 0,23
Mittel 0^33
Anfang 0,90
Ende 0,42
Mittel 0,66
Anfang 0,90
Ende 0,58
Mittel 0,74
Anfang 2,00
Ende 1,50
Mittel L/75
5,0
26
mm3 Quanten
Min.
eingestrahlt
5,25
5,30
5,25
5,25
5,30
5,25
mm' Quanten
Min.
absorbiert
3,42
3,50
3,36
3,46
3,65
3,30
Intermitt.
Zeit
Min.
H'
mm
H
mm
l/9> =
hv_
Oo
60'
240'
120'
90'
60'
120'
5,0
y- i,i
23
v 1 1
14,5
1,13
14,0
— 1,16
\ 12,5
— 1,14
-15,0
•— 1,16
+ 2,5
Ro»= 2,82
+ 11,5
&'o2 = 2,82
+ 7,0
£'oo = 2,93
6,5
&'o2 = 3,12
+ 6,0
£'o,= 3,02
7,0
&'o2=3,16
7,3
5,6
4,76
3,6
2,92
4,17
cp =
hv
0,137
0,179
0,21
0,278
0,342
0,24
Tab. 2 (zu Protokoll 2)
C02-Druck
Atm.-%
mm3 Quanten
Min.
mm3 Quanten
Min.
Intermitt. -
zeit
H'
l\q> -
hv
rf=77
eingestrahlt
absorbiert
Min.
mm
Ö2
Anfang 0,562
Ende 0,214
5,03
3,14
60'
4,0
8,0
0,125
Mittel 0,39
Anfang 1,91
Ende 1,51
5,03
3,14
60'
+ 9,0
3,54
0,282
Mittel 1,71
5,3
5,03
3,10
60'
+ 11,0
2,85
0,352
10,9
5,03
3,10
60'
8,0
3,90
0,256
26,2
5,03
3,20
60'
3,5
9,28
0,108
50
5,03
3,20
60'
1,5
21,7
0,046
Tab. 3 (zu Protokoll 3)
22 mm3 Zellen in vF = 7 cm3; 2
30' weiß
30' i
30' i
30' i
30' weiß
30' weiß-
30' i
30' i
30' i
30 'weiß
30' weiß-
30 i
30' i
30' weiß
30' weiß
30' i
30' i
30' weiß
30' weiß
30' i
30' i
30' weiß
2,0
8,0
7,5
7,5
2,0
2,0
4,0
4,0
4,0
2,0
1,0
10,0
10,0
1,0
2,0
17,5
17,0
1,5
1,5
17,0
16,5
1,5
90'
)H =
17
90'
H =
18
60'
H =
- 22
60'
H =
31
60'
H =
30,5
7
1
7
\_
2-Druck war das Mittel von Anfangs- und Enddruck einzusetzen. Wir bil-
deten das Mittel für das kleine Gefäß. Man beachte, daß der CO„-Druck in dem größeren Gefäß
weniger abnimmt, was einen Fehler in y bedingt, der aber in den Versuchen der Tabelle unwe-
sentlich ist. Der Fehler liegt in der Richtung, daß er die Ausbeute (f verschlechtert.
Die folgende Versuchsreihe wurde an aufeinanderfolgenden Tagen mit Zellen 48stündiger
Kulturen, also nicht mit Zellen der gleichen Suspension ausgeführt, während natürlich für jedes
Gefäßpaar der 2-Gefäßmethode immer die gleiche Suspension benutzt wurde, „i" in Tab. 2 be-
deutet intermittierend in 1-Minuten-Perioden.
Protokoll 3 (Tab. 3): Einfluß des CO-z-Drucks auf die Energieausbeute in saurem Medium
Der Versuch unterscheidet sich von dem Versuch des Protokolls 2 nur dadurch, daß der Einfluß
der verschiedenen COi-Drucke auf ein und dieselbe Zellsuspension, an einem Tage, gemessen
wurde. Die Zeit reichte dann nicht für die 2-Gefäßmethode aus, sondern es wurde für jedes Gas-
174
Weitere Steigerung des Energiegewinns im Kreisprozeß der Photosynthese
gemisch nur ein Gefäß verwendet, und die Ausbeute mit dem Mittelwert von y, der in dem Versuch
des Protokolls 1 gefunden war, berechnet. Nahezu dieselben Ausbeuten wie in dem Versuch des
Protokolls 2 wurden für gleiche COo-Drucke erhalten.
Protokoll 4: Rete>itionsbestimmung für das Bicarbonat-Carbonat-Gemisch 1j^-mol. 95/5
2 Manometergefäße mit doppelter Birne. 20° C
Gefäß Nr. 42
v = 21,94 cm3
&CO2 = 2,01 mm2
7 cm3 1/5-mol. 95/5-Gemisch
1,91 Vol.-",, C02-Luft
a) 0,2 cm3»-H2S04
b) 0,2 cm3H/50-NaHCO4
+ 3,0 mm
= 6,03 mm3
Gefäß Nr. 40
v = 22,87 cm3
Avo-2 = 2,10 mm2
Hauptraum 7 cm3 Wasser
Gasraum 1,91 Vol.-0,, C02-Luft
Birnen a) 0,2 cm3»-H2S04
b)0,2 cm3»/50-NaHCO3
Nach Einkippen der ELSO4 in das NaHCC>3
Endwert + 40,5 mm
= 85 mm3
Also retiniert
85 — 6,0 = 79 mm3
Retiniert pro mm
79 26,4 mm3 CQ2.
3 mm
Protokoll 5 {Tab. 4): Einfluß des CO-i-Drucks auf die Energieausbeute in alkalischem Medium
Die Zellen wurden zweimal in dest. Wasser gewaschen und dann in die verschiedenen Bicarbonat-
Carbonat-Gemische gebracht. 21 bis 22 mm3 Zellen pro Gefäß, Absorption des Meßlichts 61 bis
65% der einfallenden Intensität. Atmung durch weißes Licht nahezu kompensiert. Meßlicht
644 m//, das intermittierend in 1 -Minute-Perioden zu dem weißen Licht hinzugefügt wurde
(1' weiß, 1' weiß } rot usw.) 20° C.
Gefäß Nr. 46: v = ■■ 16,59; vF = 7,00 cm3; kö, = 0,915 mm2.
Gefäß Nr. 47: 0= 16,56; vv = 7,00 cm3; kÖ2 = 0,911 mm2.
In den Versuchen 1, 2 und 5 wurde in den Gasraum Luft eingefüllt und der sich einstellende
C02-Druck nach Gleichung (2) Abschnitt III berechnet. In den "Versuchen 3 und 4 wurden in den
Gasraum analysierte Gasgemische eingeleitet und die Flüssigkeiten damit gesättigt.
Literatur
1 Warburg, O., und Geleick, H., Z. Naturforschg. 6b
(1951), 134.
2 Warburg, O., Pflügers Arch. ges. Physiol. Menschen
Tiere 154 (1913), 599; 158 (1914), 19, 189.
3 Warburg, O., Schwermetalle, 2. Aufl., Berlin 1948,
S. 170.
4 "That in a perfect nature photosynthesis is perfect too".
Warburg, C. O., und Burk, D., Arch. Biochem. 25
(1950), 410.
5 Warburg, O., und Negelein, E., Z. physik. Chem. 106
(1923), 191.
6 Warburg, O., Biochem. Z. 100 (1919), 230.
7 Warburg, O., Burk, D., und Schade, A., Extensions
of Photosynthetic Experimentation. Symposion Vol. V,
Soc. for Experimental Biology 1951; Burk, D., und
Warburg, O., Z. Naturforschg. 6b (1951), 12; War-
burg O., und Geleick1, H.
8 Die Entwicklung der 2-Gefäß-Methode zu der heutigen
Form findet man beschrieben in Warburg O. und
Burk, D. Arch. Biochem. 25 (1950), 410, sowie bei
Burk D. und Warburg7 O. und Warburg O. und
Geleick1 H.
13 Cytohämin aus Herzmuskel*
Von Otto Warburg und Hans-Siegfried Gewitz
Cytohämin, dessen Isolierung Warburg und Negelein1 versucht haben, zeigt in
wäßrigem Pyridin die Hämochromogenreaktion 587 gegenüber 557 des Bluthämins.
Wir haben eine Methode ausgearbeitet, um Cytohämin in größeren Mengen aus
Pferdeherzen zu gewinnen und haben es aus salzsaurem Aceton kristallisiert
(Abb. 1). Für die Chlorferri Verbindungen des Cytohämins und des Bluthämins
fanden wir-: C H N Fe Cl o
Cytohämin °0 64,47 6,79 6,50 6,42 4,20 11,62
Bluthämin% 62,63 4,94 8,59 8,56 5,43 9,81
Abb. 1. Cytohämin aus Herzmuskel des Pferdes.
Cytohämin enthält also mehr Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff als Blut-
hämin, aber weniger Eisen und Stickstoff. Seiner Zusammensetzung nach steht
es zwischen Bluthämin und den Käminen, die man sich entstanden denken kann
aus Chlorophyll b durch Ersatz des Magnesiums durch Eisen und Oxydation der
überzähligen Wasserstoffatome. Wie das Eisensalz des Phäophytins, ist Cytohämin
in Äther und in Tetrachlorkohlenstoff löslich.
Wie Bluthämin, enthält Cytohämin zwei Carboxylgruppen, die bei pH 7,5
Kohlensäure aus Bikarbonat austreiben (Protokoll 1).
Anders als Bluthämin enthält Cytohämin nur eine Vinylgruppe, die durch
Hydrierung mit Platin und Wasserstoff in alkalischer Lösung nachgeweisen wer-
den kann (Protokoll 2).
Wie das Eisensalz des Phäophytins verbraucht das Cytohämin bei der Hy-
drierung mit Platin und Wasserstoff in Eisessig 61/2 Mol. Ho, während Bluthämin
Aus Hoppe-Seyler's Ztschr. f. physiolog. Chem. 288 (1951): 1.
176
Cytohämin aus Herzmuskel
nur 51/-' Mol. H2 verbraucht. Subtrahiert man den für die Reduktion des Eisens und
für die Hydrierung der Vinylgruppen verbrauchten H2 von dem insgesamt ver-
brauchten H-2, so bleibt für Cytohämin und Phäophytin-Eisen ein H-2-Verbrauch
von 5 Mol., für Bluthämin ein Verbrauch von nur 3 Mol. übrig (Protokoll 3).
Wie Phäohämin und Spirographishämin, so verwandelt sich auch Cytohämin
unter den verschiedensten Bedingungen in ein kurzwelliges Hämin. Die Um-
lagerung des Phäohämins und des Spirographis-Hämins ist 1931 entdeckt wor-
den3; Hans Fischer4 versuchte sie durch Anlagerungen an eine Formylgruppe zu
erklären. Cytohämin zeigt diese Umwandlung sogar, wenn man die wäßrige
Pyridinlösung mit Hydrosulfit reduziert. Keine Umwandlung fanden wir, wenn
wir das Eisen (in wäßriger Pyridinlösung) mit Platin und Wasserstoff reduzierten,
wobei jedoch darauf zu achten ist, daß bei längerer Einwirkung von Platin und
Wasserstoff nicht nur das Eisen der Hämine reduziert wird (vgl. oben).
Schließlich sei noch hervorgehoben, daß Cytohämin kein Phytolester ist, woran
früher vermutungsweise gedacht worden war1.
Protokolle
1. Analysen
3,54, 3,69, 3,92 mg Sbst. : 8,31, 8,73, 9,28 mg CO2, 2,15, 2,24, 2,38 mg H20. — 4,69, 4,91, 4,48 mg
Sbst.: 0,268, 0,282, 0,255 ccm N (23°, 746,5 mm, 23", 746,5 mm, 22", 746,6 mm). — 4,55, 5,22 mg
Sbst. gaben 0,77, 0,89 mg AgCl. — 0,66, 1,08 mg Sbst. zeigten kolorimetrisch mit o-Phenanthrolin
0,0425, 0,069 mg Fe an.
c
64,06
64,56
64,60
Mittelwert
64,47%
H
6,80
6,79
6,79
Mittelwert
6,79%
N
6,53
6,51
6,48
Mittelwert
6,50%
Cl
4,19
4,22
Mittelwert
4,20%
Fe
6,45
6,38
Mittelwert
6,42%
Kein P, kein S, kein Methoxyl. Oi durch Differenz: 11,62%.
Manometrische Bestimmung der Carboxylgruppen bei 20°
I
II
III
Hauptraum
kein Hämin
0,68 mg Chlorferri-
cytohämin gelöst in
0,74 mg Chlorferri-
bluthämin gelöst in
n
0,1 ccm —--NaOH
= 0,78 Mikromole
0,1 ccm ~— -NaOH
10
= 1,14 Mikromole
0,1 ccm~— NaOH
(Mol.-Gew = 873)
(Mol.-Gew. = 651,8)
Birne
Gasraum
Nach Einkippen
der H2S04
1,9 ccm H20
0,2ccm»/10-HoSO4
1% COo in Luft
256 cmm CO 2
1,9 ccm H20
0,2ccm«/10-H>SO4
1% COoinLuft
218 cmm CO2
I — II == 38 cmm CO -
= 1,7 Mikro-
mole CO2,
1,9 ccm H20
0,2ccm»/10-H2SO4
1% C02inLuft
208 cmm CO2
I— III = 48 cmm C03
2,14 Mikro-
mole CO2
Carboxyl 1,7
Hämin 0,78
= 2,18
Carboxyl 2,14
Hämin 1,14
= 1,88
Cytohämin aus Herzmuskel
177
2. Hydrierung in Borat bei 20°
Hauptraum:
10 mg Platinschwarz
10 mg Platinschwarz
2 ccm ml 5
-Boratpuffer
pH 11,04
2 ccm w/5-Boratpuffer pn 11,04
Birne :
1,35 mg Chlorferri-Bluthämin,
1,23 mg Chlorferri-cyto-
gelöst in
0,05 ccm >;/10-NaOH
hämin, gelöst in 0,05 ccm
= 2,07 Mikromole
«/10-NaOH
(Mol.-Gew. 651,8)
= 1,41 Mikromole
0,15 ccm
H20
(Mol.-Gew. 873)
0,15 ccm H20
Gasraum :
H2
H2
nach Min.
cmm H2 aufgenommen cmm H2 aufgenommen
50
59,0
26,4
120
99,5
40,0
200
112,0
46,5
240
113,5
49,5
280
115,0
51,0
Endwert 115,0 cmm = Endwert 51,0 cmm
2,48 Mole H-2 pro 1,62 Mole H2 pro
Mol Hämin
Mol Hämin
wobei 1/2 Mol IFasserstoff für die Reduktion des Ferri-Eisens verbraucht wird.
3. Hydrierung in Eisessig bei 20°
Hauptraum:
20 mg
Platinschwarz
20 mg Platinschwarz
20 mg Platinschwarz
2 ccm
Eisessig
2 ccm Eisessig
2 ccm Eisessig
Birne :
1,25 mg Protopor-
1,12 mg Chlorferri-
1,22 mg Chlorferri-
phyrin, gelöst in
verbindung von
cytohämin, gelöst
0,2 ccm Eisessig
Phäophytin a ; b,
in 0,2 ccm Eisessig
gelöst in 0,2 ccm
Eisessig
= 2,22 Mikromole
1,16 Mikromole
= 1,4 Mikromole
(Mol-,
.Gew. = 562)
(Mol.-Gew. == 965)
(Mol.-Gew. == 873)
Gasraum:
H2
H2
H2
cmm H2
cmm H2
cmm H2
nach Min.
aufgenommen aufgenommen
aufgenommen
40
121,0
123,5
136,0
120
167,2
145,9
164,2
240
179,3
160,0
181,5
360
217,5
166,5
190,5
720
257,0
174,9
202,0
1080
262,5
176,3
208,0
Endwert 262,5
cmm Endwert 176,3 cmm
Endwert 208,0 cmm
= 5,27 Mole H
2 pro = 6,79 Mole H2 pro
= 6,65 Mole H2 pro
Mol Protoporphyrin Mol Phäophytin
Mol Cytohämin
a + b-Hämin
Literatur
1 Warburg, Otto, Schwermetalle als Wirkungsgruppen
von Fermenten. Verlag Saenger, 2. Aufl., Berlin 1948.
E. Negelein, Biochem. Z. 266, 412 (1933).
2 Die Analysen hat A. Lehmann ausgeführt.
3 Warburg, O., und Christian, W., Biochem. Z. 235
(1931), 240; O. Warburg und E. Negelein, Biochem.
Z. 244 (1931), 9.
4 Fischer, Hans, und Seemann, C. v., diese Z. 242 (1936\
133.
12 Warburg, Zellphysiologie
14 Cyto-Deutero-Porphyrin*
Von Otto Warburg und Hans-Siegfried Gewitz
Kristallisiertes Cytohämin1 wurde auf Rat von Professor Karl Zeile mit Resorcin
zur Deuteroverbindung abgebaut. Die Kohlenwasserstoffkette, die den niedrigen
Eisengehalt des Cytohämins bedingt (6,4% gegen 8,6% des Bluthämins), wurde
dabei entfernt und es entstand in guter Ausbeute das schön kristallisierende Cyto-
Deutero-Porphyrin (Abb. 1). Elementare Zusammensetzung, Absorptionsbanden
#
Abb. 1. Cyto-Deutero-Porphyrin.
und Salzsäurezahl von Cyto-Deutero- und Proto-Deuteroporphyrin stimmen sehr
nahe überein. Indessen zeigt ein Vergleich der Schmelzpunkte der Methylester,
daß die beiden Porphyrine nicht identisch sind. Mit Methanol-Salzsäure entsteht
aus Cyto-Deutero-Porphyrin mit einer Ausbeute von 79% ein Dimethylester
(Abb. 2), der bei 189° schmilzt, während der entsprechende Proto-Deuteroester2
bei 219° schmilzt.
* Aus Hoppe-Seyler's Ztschr. f. physiolog. Chem. 292 (1953): 174.
Cyto-Deutero-Porphyrin 179
Von andern Abbauversuchen erwähnen wir den Abbau des Cytohämins mit
Chromsäure nach der Methode von Küster. Wir erhielten keine Imidfraktion,
aber mehr als 1 Mol. Hämatinsäure.
Auf Grund der bisher vorliegenden Tatsachen vermuten wir, daß die für das
Cytohämin charakteristische Kohlenwasserstoffkette sich in Ring I oder II be-
Abb. 2. Dimethylester des Cyto-Deutero-Porphyrins.
findet. Für Cyto-Deutero-Porphyrin möchten wir die folgende Formel zur Dis-
kussion stellen:*
CH3 H H C2H5
I
1
1
11
1 iv
1
|
III
[3
Propion-
Propion-
C
säure
säure
CH3 Propion- Propion- CH3
säure säure
Herrn Arnold Lehmann danken wir für die Ausführung der Elementar-Analysen.
1. Cyto-Deutero-Porphyrin
100 mg der kristallisierten Chlorferriverbindung des Cytohämins wurden mit 1 g Resorcin (aus Benzol
umkristallisiert) 15 Min. bei etwa 190° im Paraffinbad erhitzt. Die noch flüssige Schmelze wurde
mit 1 / Wasser 24 Stdn. auf dem Wasserbad erwärmt. Die ausgefallenen Flocken, die das gesuchte
Porphyrin enthielten, wurden auf dem Filter mit heißem Wasser gewaschen, bis das Waschwasser
keine gelbgrüne Fluoreszenz mehr zeigte, wozu etwa 2 / Wasser nötig waren. Die gewaschenen
Flocken wurden mit 20 ccm >z/10-NaOH vom Filter gelöst, mit ;;/10-Essigsäure wieder ausgefällt,
mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute an diesem Rohprodukt 102 mg.
Das Rohprodukt ein Gemisch von Hämin und Porphyrin wurde in 30 ccm Eisessig suspen-
diert. Unter Durchleitung von CO2 auf dem siedenden Wasserbad wurden 5 ccm einer frisch be-
* Diese Formel berücksichtigt noch nicht die später gefundene Tatsache des Tribrom-Derivai
Beitrag 15. Richtige Formel vergl. Einleitung.
180 Cyto-Deutero-Porphyrin
reiteten Ferroacetat-Eisessig-Lösung sowie 2 ccm konz. Salzsäure zugegeben. Nach etwa 7 Min.
war die Substanz gelöst und alles Eisen abgespalten. Die unter Kohlensäuredurchleitung gekühlte
Lösung wurde in 1 / Wasser gegossen; das Porphyrin wurde durch Abstumpfen der Säure ausgefällt
die ausgefallenen Flocken wurden auf einem Faltenfilter gesammelt und mit verd. Essigsäure und
Wasser gewaschen.
Der Niederschlag wurde mit 40 ccm »/50-NaOH vom Filter gelöst und mit 5 ccm «/5-Essig-
säure wieder ausgefällt, abzentrifugiert und mit Wasser neutral gewaschen. Dann wurde zweimal
mit je 10 ccm 0,1-proz. Salzsäure extrahiert, um Verunreinigungen zu entfernen, und weiterhin
mit 1,5-proz. Salzsäure, wobei das Porphyrin in Lösung ging. Die Lösung des extrahierten Por-
phyrins betrug 200 ccm; sie wurde mit Wasser auf 5 / verdünnt und mit peroxydfreiem Äther
im Neumannschen Apparat extrahiert. In der Vorlage kristallisierte das Porphyrin aus dem Äther
aus. Es wurde mit Äther gewaschen und getrocknet. Zum Umkristallisieren wurde in wenig
Pyridin gelöst, filtriert, das Pyridin durch Luft durchblasen auf dem Wasserbad bei 60" auf 0,1 ccm
eingeengt und mit 2 ccm Äther versetzt, worauf das Porphyrin auskristallisierte. Ausbeute an
diesem umkristallisierten Produkt 22,5 mg (nach obiger Formel etwa 40% d. Th.).
\
Abb. 3. Hämin des Cyto-Deutero-Porphyrins.
Zur Analyse wurde 3 Stdn. im Hochvakuum bei 60° getrocknet. 3,23 mg Sbst., 8,26 mg CO?,
1,69 mg H20. — 2,82 mg Sbst. 0,285 ccm N (22", 737 mm Hg).
Proto-Deutero-Porphyrin (Mol. -Gew. 510,56). Ber. C 70,56, H 5,93, N 10,98.
Gef. C 69,80, H 5,86, N 11,34.
Das Absorptionsspektrum des Cyto-Deutero-Porphyrins in Pyridin-Äther ist von dem Spektrum
des Proto-Deutero-Porphyrins kaum zu unterscheiden. Vielleicht sind die Banden der Cytoverbin-
dung etwas kurzwelliger.
Die Salzsäurezahl der Cytoverbindung ist 0,4 bis 0,5 und stimmt mit der Protoverbindung über-
ein.
Auch im Verhalten der beiden Porphyrine zu andern Lösungsmitteln haben wir keine Unter-
schiede gefunden.
2. Dimethylester des Cyto-Deutero-Porphyrvis
17 mg Cyto-Deutero-Porphyrin wurden in 7 ccm Methanol suspendiert und bei 0° mit trocknem HCl
gesättigt. Nach 3stdg. Stehenlassen bei Raumtemperatur wurde die Lösung unter vermindertem
Druck bei 35" zur Trockne verdampft. Der Rückstand wurde in 10 ccm Chloroform gelöst und mit
Cyto-Deutero-Porphyrin 181
wasserfreiem Natriumcarbonat geschüttelt, bis das vierbandige Porphyrinspektrum erschien. Die
filtrierte Lösung wurde auf 0,2 ccm eingeengt und mit 2 ccm Äther versetzt, wobei der Ester aus-
kristallisierte. Ausb. 13,5 mg. Zur Methoxylbestimmung und Schmelzpunktbestimmung wurde der
Ester mehrfach aus Chloroform-Äther umkristallisiert.
Methoxyl: 2,36, 2,13 mg Sbst., 3 Stdn. im Hochvakuum über P2O5 getrocknet, verbr. 2,49.
2,27 ccm K/50-Thiosulfat. Für Proto-Deutero-Porphyrin-Dimethylester ber. CH3O 11,52, gef.
10,91, 11,02.
3. Hämin des Cyto-Deutero-Porphyrins
1 mg kristall. Cyto-Deutero-Porphyrin wurde in 0,1 ccm Eisessig-Kochsalz suspendiert. Unter
Durchleiten von Kohlensäure wurden 0,3 ccm einer frischbereiteten Ferroacetat-Eisessig-Kochsalz-
lösung zugesetzt und 15 Min. auf dem Wasserbad erwärmt. Verdampfter Eisessig wurde ersetzt.
Dann wurde der CO-2-Strom unterbrochen und langsam abgekühlt. Nach 2stdg. Stehenlassen
bei 5° war das Chlorhämin auskristallisiert (Abb. 3). Es wurde auf der Zentrifuge mit Essigsäure
und dann mit Wasser gewaschen.
In 30-vol.-proz. Pyridin-Wasser gelöst und mit Hydrosulfit versetzt erschien eine Hämo-
chromogenbande bei 545 m//, das ist die Lage der entsprechenden Bande3 des Proto-Deutero-
hämins. Vielleicht ist die Bande der Cytoverbindung ein wenig kurzwelliger als die Bande der
Protoverbindung.
Zusammenfassung
Der Abbau des Cytohämins zur Cyto-Deutero-Verbindung wird beschrieben.
Literatur
1 Warburg, O., und Gewitz, H.-S., diese Z. 288(1951), 1.
2 Fischer, H., Pyrrolbuch, II, 1, S. 416.
3 1. c. 2, S. 415.
15 Über Gewinnung und Abbau des Cytohämins*
Von Otto Warburg, Hans-Siegfried Gewitz und Wolfgang Völker
Wir beschreiben im Folgenden die Gewinnung und Kristallisation des Cytohämins1 aus Pferde-
herzen; seine Hydrierung mit Platin und Wasserstoff; seinen Abbau bei der Resorcinschmelze2
zu Cyto-deutero-porphyrin sowie den Abbau des Cyto-deutero-porphyrins mit Chromsäure,
wobei Hämatinsäure und Methylmaleinimid entstehen.
Nach Spektrum und Elementaranalyse war Cyto-deutero-porphyrin von Proto-deutero-
porphyrin nicht zu unterscheiden. Aus den Schmelzpunkten der Dimethylester jedoch ging hervor,
daß die beiden Porphyrine verschieden sind.
Dieses Ergebnis ist inzwischen dadurch bestätigt worden, daß das Cyto-deutero-porphyrin
bei der Bromierung 3 Atome Brom aufnimmt, während Proto-deutero-porphyrin nur 2 Atome
Brom aufnimmt. Cyto-deutero-porphyrin scheint also 3 freie p'-Stellungen zu enthalten, was
K. Zeile auf Grund unsrer Analysen (private Mitteilung) bereits 1953 vermutet hatte. Herr
Zeile hat diese Arbeit ferner dadurch unterstützt, daß er 2 Pyrromethene für uns herstellte,
nämlich 4.5.5'-Trimethyl-pyrromethen und 4.5.5'-Trimethyl-4'-äthyl-pyrromethen, die zur Ge-
winnung von zwei neuen Deutero-porphyrinen dienten.
Tabellen über die Schmelzpunkte einiger Deutero-porphyrin-dimethylester und ihrer Brom-
derivate findet man am Schluß dieser Arbeit. Die Tabellen enthalten die Schmelzpunkte von
4 neuen Deutero-porphyrinen, deren Synthesen in einer anderen Arbeit von Gewitz und Völker
beschrieben werden.
I. Gewinnung des Cytohämins
16 Pferdeherzen wurden von Fett und Begleitstoffen befreit, durch einen Fleisch-
wolf gedreht und mit viel kaltem Wasser gewaschen, bis das Waschwasser fast
farblos war. Der gewaschene Fleischbrei wurde zentrifugiert, um die Hauptmenge
Wasser zu entfernen. Gewicht etwa 35 kg.
Rohprodukt . Aus je zwei kg wurden mit 6 / Aceton, dem vorher 48 ccm konz. Salzsäure vom spez.
Gewicht 1,19 zugesetzt wurden, durch 20 Min. langes Schütteln auf der Maschine die Hämine,
Bluthämin und Cytohämin, entzogen. Vom fast farblos gewordenen Fleisch wurde abzentrifugiert.
Die rotbraune Lösung der Hämine wurde nach Verdünnen mit 1/io Volumen Wasser mit 4-».
NH3 bis pH 7 neutralisiert. Der ausgefallene Niederschlag, der die Hämine enthielt, wurde ab-
zentrifugiert und mehrmals mit 80proz. Aceton gewaschen und dann wiederholt mit salzsaurem
Aceton (40 ccm 2-n. Salzsäure auf 1 / Aceton) verrieben, bis nur noch wenig Hämin in Lösung ging.
Das Volumen des Acetonextraktes, der die Hämine enthielt, betrug 5 — 7 Liter.
Die Lösung wurde mit 1/8 Volumen Wasser verdünnt und mit 2-». NH:j neutralisiert. Dem
ausgefallenen Niederschlag, der die Hämine enthielt, wurden nach Zentrifugieren und Waschen
mit 80proz. Aceton nochmals mit schwächer salzsaurem Aceton (40 ccm 1-». HCl auf 1 / Aceton)
die Hämine entzogen. Die jetzt dunkelbraune Lösung der Hämine (Volumen etwa 2 /) wurde unter
mäßigem Turbinieren auf 0° gekühlt und vorsichtig mit 1 — 1,2 / kaltem Wasser versetzt. Die dabei
ausfallenden weißen bis hellbraunen Verunreinigungen wurden abzentrifugiert. Aus der Lösung
wurde das Hämingemisch mit einigen ccm gesättigter Natriumacetatlösung gefällt. Es wurde ab-
zentrifugiert, mit Wasser, dann mit 80proz. Aceton gewaschen und getrocknet.
Ausbeute: ca. 1,5 g Rohprodukt.
Der Eisengehalt dieses Präparates betrug im Durchschnitt 5 Prozent.
Hämochromogenspektrum
Eine Probe wurde in 30-vol.-proz. Pyridin- Wasser gelöst und mit Hydrosulfit re-
duziert. Es erschien eine stärkere Bande (Protohämin) bei 557 mit und eine
* Aus Zeitschrift für Naturforschung 10 b (1955): 541
Über Gewinnung und Abbau des Cytohämins 183
schwächere Bande (Cytohämin) bei 587 m//. 4 Ansätze dieser Art ergaben etwa
6—8 g Rohprodukt.
Trennung der Hämine. 6 g Rohprodukt wurden fein gepulvert und 8-mal mit je 15 ccm Eisessig ver-
rieben. Der unlösliche Rückstand, der viel Bluthämin, aber nur wenig Cytohämin enthielt, wurde
mit Petroläther gewaschen und getrocknet. Präparat I. 3,5 g, in dem das Verhältnis von Cyto-
hämin zu Bluthämin etwa 1 : 5 betrug.
Die Eisessigextrakte, die im wesentlichen das Cytohämin enthielten, wurden vereinigt in 700 ccm
Petroläther eingegossen. Der ausgefallene flockige Niederschlag, der das Cytohämin enthielt,
wurde abzentrifugiert, mit Petroläther gewaschen und über Natriumhydroxyd getrocknet. Präparat
II. 870 mg. Enthielt vornehmlich Cytohämin neben wenig Bluthämin.
Um aus Präparat I das restliche Cytohämin zu gewinnen, wurde es in 8 ccm Pyridin und 23 ccm
Chloroform gelöst und diese Lösung in ein eben nicht mehr siedendes Gemisch von 180 ccm Eis-
essig, dem vorher 2,7 ccm gesättigte Kochsalzlösung und 2,1 ccm konz. Salzsäure zugesetzt
wurden, eingegossen. Nach 16stdg. Stehen bei Raumtemperatur wurde der Niederschlag, der das
Bluthämin enthielt, abzentrifugiert und verworfen. Die Mutterlauge, die das Cytohämin enthielt,
wurde im Vakuum auf 30 ccm eingedampft und in 300 ccm Wasser gegossen. Der ausgefallene
Niederschlag wurde mehrmals mit Eisessig ausgezogen und die Lösung mit Petroläther gefällt, ge-
waschen und getrocknet. Präparat III. 500 mg. Enthielt vorwiegend Cytohämin neben wenig Blut-
hämin.
Das Hämochromogenspektrum von Präparat II und III zeigte neben der Cyto-
hämochromogenbande bei 587 mu nur einen schwachen Schatten der Bluthämo-
chromogenbande bei 557 mu.
Präparat II und III wurden vereinigt und 15— 20mal mit je 20 ccm Äther- Salzsäure (0,1 ccm
25proz. Salzsäure auf 100 ccm frisch destillierten Äther) verrieben. Die vereinigten Lösungen
wurden auf die Hälfte eingeengt und in viel Petroläther gegossen. Das ausgefallene Cytohämin
wurde abzentrifugiert, mit Petroläther gut gewaschen und über Natriumhydroxyd getrocknet. Aus-
beute: 1070 mg.
Dieses Präparat wurde in 10 ccm salzsaurem Aceton (0.2 ccm 1-n. Salzsäure auf 50 ccm Aceton)
gelöst, auf 0° gekühlt und langsam mit 15 ccm kalter n/10-Salzsäure versetzt. Das ausgefallene
Cytohämin-chlorhydrat wurde abzentrifugiert. Die Mutterlauge enthielt noch restliches kurzwelliges
Hämin. Dieser Schritt wurde 2-mal wiederholt. Zum Schluß wurde mit Wasser gut gewaschen und
im Vakuumexsikkator getrocknet. Wir erhielten 850 mg Cytohämin-chlorhydrat mit einem Eisen-
gehalt von 6,2 bis 6,4 Prozent.
Kristallisation
70 mg Cytohämin-chlorhydrat wurden mit 3 ccm salzsaurem Aceton (0,2 ccm
25proz. Salzsäure auf 50 ccm Aceton) verrieben. Von wenig Ungelöstem wurde
abzentrifugiert. Die Lösung wurde unter Durchblasen von Stickstoff auf 1 ccm
eingeengt. Nach 1 Stunde bei 0° begann die Kristallisation. Am nächsten Tag wurde
abzentrifugiert. Die Kristalle wurden mit 50proz. Aceton, dann mit Wasser ge-
waschen und getrocknet.
Zur Analyse wurde 2 Stunden bei 60° im Hochvakuum getrocknet.
Die 1951 erhaltenen Werte entsprachen der Zusammensetzung:
Cytohämin C 64,47; H 6,79; N 6,50; Fe 6,42; Cl 4,20.
Bluthämin C 62,63 ; H 4,94 ; N 8,59 ; Fe 8,56 ; Cl 5,43.
Absorptionsspektrum des Cytohämins
cm
Hauptbande /- 430 m//, ß = 2,9 ■ 10« -^,
cm2
Langwelligste Nebenbande /. 587 m/>, ß = 0,64 • 108 -^^.
184 Über Gewinnung und Abbau des Cytohämins
II. Hydrierung des Cytohämins
Zur Hydrierung wurden 1,23 mg Cytohämin-chlorhydrat, in 0,05 ccm n/10-Natronlauge gelöst,
in den Hauptraum eines Kegelgefäßes gegeben, der 10 mg Platinschwarz und 2 ccm m/5-Borat-
puffer pH 11 enthielt. Das Cytohämin nahm in 280 Min. bei 20" 51 cmm H2 auf; das sind 1,62 Mole
Ho, von denen xjz Mol H2 für die Reduktion des Eisens und etwa 1 Mol H-2 für die Reduktion
einer Doppelbindung verbraucht wurden.
Wurde dieses hydrierte Cytohämin der Resorcinschmelze unterworfen, so konnte,
anders als bei der Resorcinschmelze des nicht hydrierten Cytohämins, kein kristalli-
siertes Reaktionsprodukt isoliert werden. Wahrscheinlich bleibt bei der Resorcin-
schmelze des hydrierten Hämins die lange Kohlenstoffkette mit dem Pyrrolkern
verbunden und verhindert dadurch die Kristallisation eines Deuterokörpers.
III. Deutero-porphyrin aus Cytohämin
Die Deuteroreaktion des nicht hydrierten Cytohämins, die wir 1953 beschrieben
haben, konnte vereinfacht werden und gelang jetzt in besserer Ausbeute nach
folgender Methode:
100 mg Cytohämin-chlorhydrat wurden mit 500 mg Resorcin gemischt und 10 Min. bei 187—
190° geschmolzen. Die erkaltete Schmelze wurde in 20 ccm n/20-Natronlauge gelöst und mit
Wasser auf 40 ccm verdünnt. Mit 40 ccm n 10-Salzsäure wurde das Cyto-deutero-hämin gefällt.
Dieses Umfallen wurde 3mal wiederholt, wobei grün fluoreszierende Verunreinigungen entfernt
wurden. Dann wurde mit Wasser salzfrei gewaschen. Der noch feuchte Niederschlag wurde in
30 ccm Eisessig gelöst. Unter Durchleiten von Kohlensäure wurden 5 ccm einer frisch bereiteten
Eisen(II)-acetat-Eisessiglösung (0,32 g Ferrum reductum wurden in CO-2-Atmosphäre in 17 ccm
Eisessig durch Kochen unter Rückfluß gelöst) und dann auf dem siedenden Wasserbad 2 ccm konz.
Salzsäure hinzugefügt. Nach kurzem Erwärmen war alles Eisen abgespalten, und die Lösung zeigte
die dunkelrote Porphyrinfarbe.
Die Lösung wurde in 250 ccm Wasser, welches 5 ccm konz. Salzsäure enthielt, eingegossen.
Das Cyto-deutero-porphyrin blieb in Lösung. Die ausgefallenen Verunreinigungen wurden durch
Filtrieren abgetrennt. Das Cyto-deutero-porphyrin wurde mit Natriumacetat ausgeflockt und der
Niederschlag mit \-n. Salzsäure extrahiert. Ungelöstes wurde verworfen.
Aus der Lösung wurde das Cyto-deutero-porphyrin mit Natriumacetat aus-
gefällt. Es wurde abzentrifugiert, mit Wasser neutral gewaschen und getrocknet.
37 mg Cyto-deutero-porphyrin == 64,5% der Theorie. Die 1953 erhaltenen
Analysenwerte entsprachen der Zusammensetzung :
C 69,80; H5,86; N 11,34.
Cyto-deutero-porphyrin-dimethylester. 37 mg freies Porphyrin wurden in 12 ccm 1% HCl-haltigem
Methanol gelöst und bei 0° mit trockenem Salzsäuregas gesättigt. Nach lstdg. Stehen bei Raum-
temperatur wurde die Lösung bei 30° im Vakuum zur Trockene gebracht. Der Rückstand wurde
in 10 ccm Chloroform und 0,5 ccm Methanol gelöst, mit wasserfreiem Natriumcarbonat neutral
geschüttelt und nach Filtrieren im Vakuum zur Trockene gebracht.
Chromatographische Reinigung. Der trockene Rückstand des Cyto-deutero-porphyrin-dimethyl-
esters wurde in 1 ccm Chloroform (für chromatographische Zwecke benötigtes Chloroform wurde
3mal mit je 2 Volumen Wasser gewaschen und über CaClsr— Na^SC^ getrocknet), dem 0,4 ccm
Benzol und 4 Tropfen Methanol zugesetzt wurden, in der Wärme gelöst. Die Lösung wurde auf
eine Al.03-Säule Grad II3, 12 1,5 cm, gebracht. Dann wurde die Säule mit einem Gemisch
aus gleichen Teilen Chloroform und Benzol gewaschen, wobei der Cyto-deutero-porphyrin-ester
als einheitliche Zone durch die Säule wanderte und gefärbte Verunreinigungen zurückblieben. Das
Eluat wurde im Vakuum getrocknet. Die chromatographische Reinigung wurde in gleicher Weise
wiederholt, jedoch wurde der Ester dieses Mal ohne Zusatz von Methanol, in Chloroform: Benzol =
1:1, gelöst. Nach Eindampfen des Eluates wurde der Rückstand 2— 3mal aus Chloroform-
Methanol umkristallisiert.
Über Gewinnung und Abbau des Cytohämins 185
Ausbeute: 20 mg Cyto-deutero-porphyrin-dimethylester vom Schmp. 188°.
Die 1953 durchgeführte Methoxylbestimmung ergab 10,96° ,, CH30.
IV. Chromsäureabbau des Cyto-deutero-porphyrins4
216 mg Cyto-deutero-porphyrin wurden in 12,5 ccm 50vol. proz. Schwefelsäure gelöst. Die klare
Lösung wurde unter Rühren mit 12,5 g Eis versetzt und auf — 10° gekühlt. Innerhalb von 35 Min.
wurden 510 mg CrOs, in 5 ccm Wasser gelöst, entsprechend 18 Atomen Sauerstoff, zugetropft.
Es wurde noch 1;2 Stunde in Eiskühlung und 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, die grüne
Lösung mit Wasser auf 180 ccm verdünnt und im Apparat 5 Stunden mit Äther extrahiert. Zur
Trennung in basische und saure Fraktion wurde der Ätherextrakt 2mal mit je 5 ccm 5proz.
Natriumbicarbonatlösung und 2mal mit je 5 ccm Wasser ausgeschüttelt.
Im Äther verblieb das Imid.
Die so abgetrennte Hämatinsäure-Fraktion wurde mit Wasser auf 80 ccm verdünnt, mit 1->i.
Schwefelsäure auf pH 2,5 angesäuert und im Apparat mit Äther extrahiert.
Der Ätherextrakt wurde eingeengt und der Rückstand im Vakuum über Natriumhydroxyd ge-
trocknet.
Ausbeute: 103 mg Rohhämatinsäure. Das sind 33",, mehr, als die Theorie für
einen Kern verlangt.
Durch Sublimation im Ölpumpenvakuum bei 85 bis 95° wurde Oxalsäure ent-
fernt. Der Rückstand wurde in 2 ccm Äther gelöst, und die Ätherlösung wurde
tropfenweise mit Petroläther 50 — 70° versetzt. Von zunächst ausfallenden gelben
Schmieren wurde abgegossen. Auf Zusatz von mehr Petroläther und nach Kühlen
im Eisbad kristallisierte die Hämatinsäure aus. Sie wurde abzentrifugiert und mit
Petroläther gewaschen.
Zum Umkristallisieren wurden die Kristalle in 1,5 ccm Essigsäure-äthylester
gelöst und die Lösung vorsichtig mit 15 — 20 ccm Petroläther 50 — 70° versetzt.
Nach kurzem Stehen in der Kälte kristallisierte die Hämatinsäure in langen Nadeln,
die teilweise zu Nadelbüscheln vereinigt waren, aus. Schmp. 113°.
Ausbeute: 52 mg krist. Hämatinsäure. Das sind 67° ,, der Theorie für einen Kern.
Der Mischschmelzpunkt mit Hämatinsäure aus Proto-deutero-porphyrin,
welche den Schmp. 110° hatte, zeigte keine Depression.
Zur Analyse wurde die Hämatinsäure aus Cyto-deutero-porphyrin bei Zimmer-
temperatur im Hochvakuum getrocknet.
3,44 mg Sbst., 6,51 mg C02, 1,52 mg H20. — 2,96 mg Sbst., 0,198 ccm N (23°,
761,5 mm Hg.). C8H904N (183,15) Ber. C 52,46; H 4,95; N 7,65.
Gef. C 51,46; H 4,94; N 7,73.
Die im Äther verbliebene Imidfraktion erhielten wir durch Einengen des Äthers
und Trocknen des Rückstandes im Vakuum über Natriumhydroxyd.
Ausbeute: 43,1 mg rohes Methylmaleinimid. Das sind 92° „ der Theorie für 1
Kern.
Das Rohimid wurde durch 2malige Sublimation im Vakuum von 4 mm Hg
und 78° gereinigt.
Ausbeute: 37 mg. Das sind 80° (, der Theorie für einen Kern.
Aus Wasser umkristallisiert, betrug der Schmp. 106°. Der Mischschmp. mit
Methylmaleinimid aus Proto-deutero-porphyrin ergab keine Depression. Zur
Analyse wurde das Imid aus Cyto-deutero-porphyrin im Hochvakuum getrocknet.
186
Über Gewinnung und Abbau des Cytohämins
Tabelle 1. P = -- Propionsäure-methylester
Nur die /i-Substituenten
sind hier eingezeichnet
Schmelzpunkte
Mischschmelzpunkt
mit Cyto-deutero-
porphyrin-ester
Cyto-deutero-porphyrin-dimethylester
CH3 H H C2H5
188"
231"
216"
218"
188"
204"
285"
280"
300"
—
175"
CH3
CH3
P
H
P
H
CH3
H
1
173"
CH3
CH3
P
H
P
CH:!
CH3
H
170"
CH3
CH3
P
H
p
CH3
CH3
H
158°
P
CH3
CH3
H
P
H
CH3
CH3
163°
P
CH3
CH3
H
P
CH3
CH3
P
—
P
CH3
CH3
H
H
H
CH3
CHg
—
CH3
CH3
P
P
P
H
CHg
CHg
1
1
—
CH3
H
P
CH3
4,41 mg Sbst., 8,75 mg C02, 1,70 mg H20. — 2,95 mg Sbst., 0,319 ccm N
(230, 762 mm Hg).
C5H5CXN (111,09) Ber. C 54,06; H 4,54; N 12,61.
Gef. C 54,14; H 4,31; N 12,50.
Zum Vergleich wurden 250 mg Proto-deutero-porphyrin in der eben beschrie-
benen Weise oxydiert. Es wurden erhalten :
Saure Fraktion:
118 mg Rohhämatinsäure. Das sind 32",, mehr, als die Theorie für einen Kern er-
fordert. 58 mg kristallisierte Hämatinsäure vom Schmelzpunkt 110°. Das sind
65° 0 der Theorie für einen Kern.
Basische Fraktion:
47 mg rohes Methylmaleinimid. Das sind 87° ,, der Theorie für einen Kern. 40 mg
sublimiertes Maleinimid vom Schmp. 1 08°. Das sind 74° , , derTheorie für einen Kern.
Über Gewinnung und Abbau des Cytohämins
Tabelle 2. P = -- Propionsäure-methylester
187
Ausgangs-Porphyrin-ester
(nur /^-Substituenten eingezeichnet)
Cyto-deutero-porphyrin-dimethylester
CHa
CH3
CH3
CH3
CH3
CHa
H
CH3 P
CH3 H
P
H
P
H
P CH3
CH3 H
P CH3
CH3 H
P CH3
CH3 H
H
C-H5
P
CH3
H
H
■
P
CH3
CH3
H
P
CH3
CH3
H
P
CH3
H
CH3
.
P
CH3
CH3
P
H
CH3
H
CH3
CH3
Brom-porphyrinester
Zahl der auf-
aufgenom-
menen Br-
Atome
Schmelz-
punkte
Häminester
Schmelz-
punkte
298°
unscharf
270(
274°
251(
238°
303°
301°
218°
254°
253°
250°
265°
209°
296°
279"
V.Vergleich der Schmelzpunkte des Cyto-deutero-porphyrin-dimethyl-
esters mit den Schmelzpunkten anderer Deutero-dimethylester
Da Cyto-deutero-porphyrin durch Spektrum und Chromsäureabbau nahe Über-
einstimmung mit dem Proto-deutero-porphyrin zeigte, verglichen wir zunächst
die Schmelzpunkte der reinen Proto- und Cyto-dimethylester. Der Cyto-ester
schmilzt bei 188°, der Proto-ester bei 218°, beim Mischen ergab sich Depression
auf 170°, so daß eine Identität beider Porphyrine ausgeschlossen erscheint. Noch
größer war der Unterschied in den Schmelzpunkten gegenüber 3 Deutero-pro-
phyrin-dimethylestern, die Hans Fischer dargestellt hat und für die er die Schmp.
280°, 285° und 300° angegeben hat. Von 4 neuen Porphyrinen, die wir zum Ver-
gleich herstellten*, hatten die Dimethylester die Schmelzpunkte 231°, 216°, 188°
und 204°. Unter diesen war also ein Ester, dessen Schmelzpunkt 188° mit dem
Cyto-ester übereinstimmte, doch ergab sich auch hier beim Mischen eine Depres-
sion von 188° auf 158°, so daß also auch hier eine Identität ausscheidet. In Tab. 1
folgt eine Liste der Schmelzpunkte der Dimethylester.
188 Über Gewinnung und Abbau des Cytohämins
VI. Vergleich der Schmelzpunkte der Hämindimethylester und der bro-
mierten Porphyrinester
Um die Vergleichsmöglichkeiten zu erweitern, haben wir von den 4 neu syntheti-
sierten Porphyrindimethylestern die Hämin-dimethylester und die Brom-por-
phyrin-dimethylester dargestellt*. Tab. 2 enthält eine Zusammenstellung der ge-
fundenen Schmelzpunkte der neuen Substanzen sowie der bereits von Hans Fischer
synthetisierten Substanzen.
Wie aus Tab. 1, so geht auch aus Tab. 2 hervor, daß das Cyto-deutero-porphyrin
mit keinem der zum Vergleich herangezogenen Porphyrine identisch ist. Insbe-
sondere sei darauf hingewiesen, daß Cyto-deutero-porphyrinester 3 Atome Brom
aufnimmt, während Proto-deutero-porphyrin- ester nur 2 Atome Brom aufnimmt.
Literatur
1 Warburg, O., und Gewitz, H.-S., Hoppe-Seyler's Z. 120" getrocknet und zum Erkalten in einen Exsikkator
physiol. Chem. 288 (1951), 1. gestellt. Zum Gebrauch wurde es gesiebt; 3600 Ma-
2 Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 292 (1953), 174. sehen pro cm2.
3 Nach R. E. H. Nicholas, Biochem. J. 48 (1951), 309, 4 Methode von W. Küster, Liebigs Ann. Chem. 315
wurde standardisiertes ALOa der Firma E. Merck in (1900), 182 sowie Abderhaldens Handbuch der biol.
Wasser suspendiert und abgesaugt. Dann wurde es bei Arbeitsmethoden Abt. I, Teil 8, S. 251, 1922.
* Vgl. eine folgende Arbeit von Gewitz und Völker.
16 Über die Synthese einiger Deuteroporphyrine*
Von Hans-Siegfried Gewitz und Wolfgang Völker
Da die Schmelzpunkte aller bekannten Deutero-porphyrin-dimethyl-ester sich als
wesentlich verschieden von dem Schmelzpunkt des Cyto-deutero-porphyrin-
dimethylesters1 erwiesen, haben wir auf Vorschlag von Herrn Warburg zu Ver-
gleichszwecken vier neue Deutero-porphyrine synthetisiert. Von den dazu benötig-
ten sechs Pyrromethenen verdanken wir zwei Herrn Prof. K. Zeile, drei wurden
nach Vorschriften von Hans Fischer erhalten und eines wurde von uns dargestellt.
Die Synthesen erfolgten durch Bernsteinsäureschmelze der entsprechenden Pyrro-
methene. Wir beschreiben im folgenden die Synthese der neuen Deutero-por-
phyrine, ihrer Methylester, ihrer Häminester und ihrer Bromderivate.
1.3.5. 7- Tetramethyl-porphin-6. 8- di Propionsäure
A
H3C
Pr"
H
CH3
H3C-
Pr
H
CH3
Pr = -CH2 ■ CH2 • COjH
(ebenso in den folgenden Formeln)
Zur Synthese dienten die Pyrromethene I und II, die bereits Hans Fischer2' 3
beschrieben hat :
H3CX /Br H3CV /Br H3C\ /Pr H3CX yPr
Br
CH
+
HBr
H
CH3
Br
HBr
CH
H
II
CH3
1.4.5. 7-Tetramethyl-porphin-6.8-dipropionsäure
B
H3C
Pr
H
CH3
H,
Pr1
>CH3
CH3
Die Synthese erfolgte aus den Pyrromethenen III und II3.
H3C\ /Br Brx /CH3 H3CX /Pr H3C
/
Pr
III
Br
/\
CH
+
HBr
H
CH3
Br^7
/
HBr
CH
^lSK ^CH3
H
II
1.5.8-Trimethyl-porphin-6.7-dipropionsäure
H3C^
H3C~
.H
Pr
Hr
Pr^
-H
CH3
Zur Synthese dienten die Pyrromethene IV** und V4.
H3C-
IV
HBr
H H
CH
/
H
H
CH3
H3C-
Br
,Pr Pr-
CH
/
CH3
HBr
\xt/\
H
Br
* Aus Hoppe-Seyler's Zschr. f. physiolog. Chem. 302 (1955): 119.
**Diese Pyrromethene stellte uns freundlicherweise Herr Prof. K. Zeile zur Verfügung.
190 Über die Synthese einiger Deuteroporphyrine
1.5.8- Trimethyl-4-äthyl-porphin-6. 7-dipropionsäure
D H3C H H C2H5
CH3 Pr Pr ' CH3
Die Synthese erfolgte aus den Pyrromethenen VI und V.
HsC^ X-H H^ /CaHg H.-jC^ ^Pr Pr^ /CH3
VI X ) CH IL 1 J= CH
HBr H HBr H
Beschreibung der Versuche
A.
Pyrromethen I, 3.5.4.' -Tribrom-4. 3.' 5.' -trimethyl-pyrromethen-hydrobromid'2 wurde
durch Einwirkung von Bromeisessig auf 2.4-Dimethylpyrrol dargestellt.
Pyrromethen II, 5-Brom-4.3. '5. '-trimethyl-3.4. '-dipropionsänre-pyrromethen-hydrc-
bromid3, wurde durch Einwirkung von Bromeisessig auf Kryptopyrrolcarbon-
säure dargestellt.
1.3.5.7-Tetramethyl-porphin-6.8-dipropionsäure (A): Ein Gemisch von 0,8 g
Pyrromethen I mit 0,8 g Pyrromethen II und 4,8 g Bernsteinsäure wurde in Por-
tionen zu 1,5 g in ein auf 210° vorgewärmtes Bad gestellt und 7 Min. bei 225° ver-
schmolzen. Die starke Bromwasserstoffentwicklung war dann fast beendet. Die
Schmelze wurde mit heißem natriumacetathaltigem Wasser gewaschen. Des ent-
standene Porphyringemisch wurde mit Eisessig und konz. Salzsäure aus dem Rück-
stand extrahiert. Durch Verdünnen mit Wasser und Abschwächen der Salzsäure
mit Natriumacetat wurde das Farbstoffgemisch in 3 1 Äther getrieben. Der Äther
wurde mehrmals mit Wasser gewaschen. Der Äther enthielt neben dem gesuchten
Porphyrin noch Koproporphyrin I, entstanden durch Selbstkondensation des
Pyrromethens II, sowie Tetramethylporphin und einige Bromporphyrine, die
durch Selbstkondensation des Pyrromethens I entstanden waren. Zur Abtrennung
des Koproporphyrins I wurde der Äther mehrmals mit zusammen 4 / 0,15proz.
Salzsäure extrahiert. Dann wurde das gesuchte Porphyrin mit 1 / lproz. Salzsäure
ausgeschüttelt. Aus der salzsauren Lösung wurde das Porphyrin durch Abstump-
fen mit Natriumacetat in frischen Äther getrieben. Es wurde zunächst mit 0,15
proz. Salzsäure zweimal gewaschen, um noch vorhandenes Koproporphyrin I zu
entfernen. Dann wurde mit 100 ccm «-Salzsäure das gesuchte Porphyrin dem Äther
entzogen und aus der salzsauren Lösung mit festem Natriumacetat gefällt. Es
wurde abzentrifugiert und mit Wasser gewaschen. Zur Abtrennung von Tetra-
methylporphin wurde der Niederschlag mit w/10 Natronlauge verrieben. Vom
Ungelösten wurde abzentrifugiert. Das gesuchte Porphyrin wurde aus der Lösung
mit wenig Eisessig gefällt. Der Niederschlag wurde mit Wasser gewaschen und im
Vakuumexsiccator getrocknet. Ausb.: 48 mg, 5,9",, d. Th., Salzsäurezahl 0,5.
Dimethylester von A: Zur Darstellung des Dimethylesters wurde A in 1% Salz-
säure enthaltendem Methanol (48 mg Porphyrin in 16 ccm Lösung) gelöst. Die
Über die Synthese einiger Deuteroporphyrine 191
Lösung wurde bei 0° mit trockenem Chlorwasserstoff gesättigt. Nach 1 stündigem
Stehenlassen bei Zimmertemperatur wurde die Lösung im Vak. bei 30° zur Trok-
kene eingeengt. Der Rückstand wurde in 12 ccm Chloroform gelöst, die Lösung
mit wasserfreiem Natriumcarbonat neutral geschüttelt und nach Filtrieren auf ein
kleines Volumen eingedampft. Auf Zusatz von heißem Methanol kristallisierte der
Ester aus. 40 mg.
Chromatographische Reinigung des Dimethylesters: 40 mg Dimethylester wurden in
1,5 ccm Chloroform (Chloroform wurde für chromatographische Zwecke mehr-
mals mit Wasser gewaschen und über Calciumchlorid getrocknet) gelöst und mit
1,5 ccm Benzol verdünnt. Diese Lösung wurde auf eine Al-iCVGrad II*-Säule,
15x2 cm, gebracht. Die Säule wurde mit einer Mischung aus gleichen Teilen
Chloroform und Benzol gewaschen. Im oberen Teil der Säule wurden Kopro-
porphyrin-I-Ester sowie einige unbekannte Porphyrinester zurückgehalten,
während der gesuchte Porphyrin-dimethylester als 1—2 cm breite, einheitliche
Zone durch die Säule wanderte. Das Eluat wurde im Vak. getrocknet. Der Rück-
stand wurde in der gleichen Weise nochmals chromatographisch gereinigt. Das
Eluat wurde zur Trockene eingeengt. Der trockene Rückstand wurde in 2 ccm
Chloroform gelöst. Zur Kristallisation wurde die Lösung mit 3 ccm heißem
Methanol versetzt und sofort gekühlt. Die ausgefallenen Kristalle, abzentrifugiert
und mit Methanol gewaschen, schmelzen nach zweimaligem Umkristallisieren aus
Chloroform-Methanol bei 188°. Zur Analyse wurde imHochvak. bei 60" getrocknet.
3,77 mg Sbst., 9,83 mg C02, 2,06 mg FLO. — 4,30 mg Sbst., 0,401 ccm N
(28°, 756, 4 Torr). — 3,60 mg Sbst., 3,92 ccm «/50-Natriumthiosulfat.
C30H34O4N4 (538,62). Ber. C 71,35 H 6,36 N 10,40 CH30 11,52
Gef. C 71,15 H 6,12 N 10,52 CH:30 11,26
Eisensalz des Porphyrin-dimethylester s: 5 mg des Dimethylesters wurden in 0,5 ccm
Eisessig-Kochsalz gelöst. In Kohlensäure-Atmosphäre wurde mit 0,5 ccm frisch
bereiteter Eisen(II)-acetat-Eisessig-Kochsalzlösung (0,33 g Ferrum reductum und
0,33 g Natriumchlorid wurden im Kohlendioxydstrom in 25 ccm Eisessig durch
Kochen unter Rückfluß gelöst) versetzt und 15 Min. auf dem siedenden Wasser-
bad erwärmt. Bereits in der Wärme kristallisierte der Häminester in rautenförmi-
gen Kristallen aus. Er wurde mit Eisessig, dann mit Äther gewaschen. Nach dem
Umkristallisieren aus heißem Eisessig schmolzen die Kristalle bei 265°. — Zur
Eisenbestimmung wurde im Vak. getrocknet.
0,76 mg Sbst., 0,0695 mg Fe.
C32H32O4N4 • FeCl (627,92). Ber. Fe 8,91 Gef. Fe 9,15
Bromderivat des Porphyrin-dimethylester s: 35 mg des Dimethylesters wurden in
7 ccm Eisessig in der Wärme gelöst. Nach Abkühlen wurde die Lösung mit 0,42
ccm einer 25proz. £nwz-Eisessiglösung bromiert. Nach mehrstündigem Stehen-
lassen wurde das ausgefallene Perbromid in 2 ccm Aceton gelöst. Die Lösung
* Al203-Grad II wurde nach einer Vorschrift von R. E. H. Nicholas, Biochem. J. 48, 309
(1951), aus AI0O3 standardisiert der Firma E. Merck durch Aufschlämmen in Wasser und Trock-
nen bei 120" erhalten.
192 Über die Synthese einiger Deuteroporphyrine
wurde nach 3 Stunden mit 15 ccm Chloroform vermischt. Die Chloroformlösung,
die das Bromderivat enthielt, wurde zur Entfernung von Aceton und Bromaceton
dreimal mit Wasser gewaschen. Dann wurde die Lösung durch trockene Filter
filtriert, auf ein kleines Volumen eingedampft, mit 1 ccm Benzol vermischt und
auf eine Al^Oß-Grad II-Säule gebracht. Die Säule wurde mit Chloroform : Benzol
= 1:1 gewaschen. Die Hauptmenge wanderte als einheitliche Zone durch die
Säule. Das Eluat wurde getrocknet, und der Rückstand wurde zweimal aus viel
Chloroform mit wenig Methanol in der Wärme umkristallisiert. Lange Nadeln
vom Schmp. 251°. Ausb. 36 mg (79% d. Tri.).
Zur Analyse wurde im Hochvak. bei 60° getrocknet.
3,86 mg Sbst., 7,81 mg C02, 1,66 mg H20. — 4,29 mg Sbst., 0,304 ccm N (28",
752.2 Torr). — 4,47 mg Sbst., 1,025 mg Br. — 1,98 mg Sbst., 1,53 ccm w/50 Na-
triumthiosulfat.
C32H3o04N4Br2 (696,44). Ber. C 55,18 H 4,63 N 8,05 Br 22,95 CH3O 8,91
Gef. C 55,21 H 4,81 N 7,95 Br 22,92 CH3O 7,99
B.
3-Brom-4.4.' 5'-trimethyl-5-carboxy-pyrromethen-hydrobromid: 1 g 3-Brom-4-me-
thyl-5-carboxy-pyrrol-aldehyd-(2) wurden mit 0,4 g 2-3-Dimethyl-pyrrol gut ver-
rieben. Dann wurden auf einmal 0,5 ccm Eisessig zugegeben und kräftig verrührt,
wobei alles zu einer festen Masse erstarrte. Unter Kühlung wurde mit 1 ccm
48proz. Bromwasserstoffsäure versetzt. Nach kurzem Stehen wurde der ausge-
fallene Kristallbrei abgesaugt und mit wenig Eisessig und Äther gewaschen. Ausb.
1,5 g 5-Carboxy-pyrromethen.
Pyrromethen III, 3.5.3' -Tribrom-4.4.' 5' -trimethyl-pyrromethen-hydrobromid: 1,5 g
des 5-Carboxy-pyrromethens wurden mit 4 ccm Ameisensäure verrieben und nach
Zutropfen von 0,5 ccm Brom, 2 Min. auf 90 — 95° erwärmt. Schon in der Wärme
begann die Kristallisation. Es wurde abgesaugt und mit Eisessig und Äther ge-
waschen. Dieses Präparat wurde nochmals in 16 ccm Ameisensäure durch Er-
wärmen gelöst und bei 80° mit 0,3 ccm Brom versetzt. Nach Abkühlen kristallisierte
das Pyrromethen III in roten Prismen aus, die mit Eisessig und Äther gewaschen
und getrocknet wurden. Ausb. 1,8 g (90" 0 d. Th.). Zur Analyse wurde im Hoch-
vak. bei 60° getrocknet.
3,94 mg Sbst., 4,15 mg C02, 0,94 mg H20. — 4,44 mg Sbst., 0,218 ccm N (28°,
752.3 Torr.) — 3,14 mg Sbst., 1,982 mg Br.
Ci-2HioN2Br4 (503,89). Ber. C 28,60 H 2,40 N 5,56 Br 63,44
Gef. C 28,74 H 2,67 N 5,51 Br 63,11
1.4.5.7-Tetramethyl-porphin-6.8-dipropionsäure (B): Ein Gemisch von 1,65 g
Pyrromethen III und 1,5 g Pyrromethen II mit 9,5 g Bernsteinsäure wurde auf 7
Reagenzgläser verteilt und 10 Min. bei 215 bis 225° geschmolzen. Die erkaltete
Schmelze wurde mit heißem natriumacetathaltigem Wasser ausgekocht und der
schwarze Rückstand mit 80 ccm Eisessig und 80 ccm konz. Salzsäure extrahiert.
Die salzsaure Lösung, die das Porphyringemisch enthielt, wurde in der für die
Synthese von A angegebenen Weise über Äther/ Salzsäure aufgearbeitet. Die so
Über die Synthese einiger Deuteroporphyrine 193
erhaltene salzsaure Lösung des gesuchten Porphyrins wurde mit Natriumacetat
versetzt. Das ausgeflockte Porphyrin wurde abzentrifugiert, mit Wasser gut ge-
waschen und getrocknet. Ausb. 33 mg (2,12% d. Th.). Salzsäurezahl 0,5.
Dimethylester von B: 85 mg Porphyrin B wurden in 30 ccm 1% Chlorwasserstoff
enthaltendem Methanol gelöst, die Lösung in der Kälte mit trockenem Chlorwas-
serstoff gesättigt und wie bei der Darstellung des Esters von A weiterverarbeitet.
Die neutrale Chloroformlösung wurde zur Trockene eingeengt. Der Rückstand
wurde in 2 ccm Chloroform gelöst und zur Kristallisation mit 2 Vol.-Tln. Metha-
nol versetzt. Die Kristalle wurden abzentrifugiert und mit Methanol gewaschen.
Chromatographische Reinigung des Dimethylester s: Die noch unreinen Kristalle
wurden in 1,5 ccm Chloroform gelöst und mit 1,5 ccm Benzol versetzt. Die Lösung
ließen wir über eine Al203-Grad Il-Säule laufen. Gewaschen wurde mit Chloro-
form: Benzol = 1:1. Es wurden mehrere schwache Zonen abgetrennt. Das Eluat,
das den gesuchten Dimethylester enthielt, wurde im Vak. getrocknet. Der ge-
trocknete Rückstand wurde aus Chloroform-Methanol zweimal umkristallisiert.
Der Dimethylester kristallisierte in langen Nadeln vom Schmp. 203°. Ausb.:
48 mg. Zur Analyse wurde im Hochvak. konstant getrocknet.
3,44 mg Sbst., 9,02 mg C02, 2,02 mg FLO. — 3,46 mg Sbst., 0,323 ccm N
(29°, 756,4 Torr). — 2,53 mg Sbst., 2,76 ccm n/50-Natriumthiosulfat.
C32H34O4N4 (538,62). Ber. C 71,35 H 6.36 N 10,40 CH3O 11,52
Gef. C 71,55 H 6,57 N 10,50 CH3O 11,33
Eisensalz des Porphyrin-dimethylesters: 5 mg des Porphyrinesters wurden zur
Eiseneinführung mit 0,5 ccm Eisen(II)-acetat-Eisessiglösung 15 Min. auf dem
Wasserbad erwärmt. Nach mehrstündigem Stehenlassen wurden die Kristalle
abzentrifugiert, gewaschen und aus heißem Eisessig umkristallisiert. Vier- und
sechsseitige Platten vom Schmp. 209°. Zur Eisenbestimmung wurde im Vak. ge-
trocknet. 1,10 mg Sbst., 0,100 mg Fe.
C32H32O4N4 • FeCl (627,92). Ber. Fe 8,91 Gef. Fe 9,09
Bromderivat des Porphyrin-dimethylesters: 25 mg des Porphyrindimethylesters wur-
den in 10 ccm Eisessig in der Wärme gelöst und nach Abkühlen mit 0,3 ccm
25proz. Brom-Eisessiglösung versetzt. Die ausgefallene Perbromverbindung wurde
mit 1,3 ccm Aceton zersetzt. Die Lösung wurde mit 15 ccm Chloroform vermischt
und mehrmals mit Wasser gewaschen. Die Chloroformlösung, die das Bromderivat
enthielt, wurde getrocknet, auf 2 ccm eingeengt und mit 3 ccm heißem Methanol
versetzt. Der auskristallisierte Bromporphyrinester wurde mit Methanol gewa-
schen und nach chromatographischer Reinigung über Al203-Grad II noch zwei-
mal aus Chloroform-Methanol umkristallisiert. Nadeln vom Schmp. 238°. Ausb. :
23 mg (71 "() d. Th.). Zur Analyse wurde im Hochvak. bei 60° getrocknet.
4,11 mg Sbst.; 8,28 mg C02, 1,78 mg FLO. — 3,92 mg Sbst., 0,286 ccm N
(290, 752,1 Torr). — 3,54 mg Sbst., 0,816 mg Br. — 2,60 mg Sbst., 2,05 ccm w/50-
Natriumthiosulfat.
C3oH3204NiBr2 (696,44). Ber. C 55,18 H 4,63 N 8,05 Br 22,95 CH3O 8,91
Gef. C 54,98 H 4,85 N 8,16 Br 23,06 CH3O 8,15
13 Warburg, Zellphysiologie
194 Über die Synthese einiger Deuteroporphyrine
c.
1.5.8-Trimethyl-porphin-6.7-dipropionsäure C: Die Mischung von 1,44 g Pyrro-
methen IV4 mit 3,0 g Pyrromethen V5 und 13 g Bernsteinsäure wurde in Portionen
zu etwa 1,5 g 45 Min. bei 185° geschmolzen, die erkaltete Schmelze fein gepulvert
und mit heißem natriumacetathaltigem Wasser gewaschen. Der schwarze Rück-
stand, der das Porphyrin enthielt, wurde in 70 ccm Eisessig und 70 ccm konz. Salz-
säure gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser auf 10% Salzsäurekonzentration ver-
dünnt, von ausgefallenen Verunreinigungen wurde abzentrifugiert ; das gesuchte
Porphyrin flockte aus der Lösung durch Zusatz von Natriumacetat aus. Der Nie-
derschlag wurde abzentrifugiert und mit Wasser gewaschen. Mit 5proz. Salzsäure
wurde daraus das jetzt schon ziemlich reine Porphyrin extrahiert. Durch Verdün-
nen mit Wasser unter Zusatz von Natriumacetat wurde das Porphyrin in 3 / Äther
getrieben. Aus der Ätherlösung wurden zunächst mit 1,5 / 0,lproz. Salzsäure
schwächer basische Verunreinigungen abgetrennt. Das gesuchte Porphyrin ließ
sich dann glatt mit lproz. Salzsäure extrahieren. Es wurde aus der salzsauren
Lösung noch mal in frischen Äther getrieben und aus der Ätherlösung mit wenig
«-Salzsäure ausgeschüttelt. Schließlich wurde das Porphyrin aus der salzsauren
Lösung mit Natriumacetat amorph gefällt, mit Wasser salzfrei gewaschen und ge-
trocknet. Ausb. 48,5 mg (1,8" „ d. Th.). Aus Äther wurde das Porphyrin in kleinen
Kristallen erhalten, die bis 300° nicht schmolzen. Salzsäurezahl 0,5.
Dimethylester von C: In die Lösung des Porphyrins in 1% Salzsäure enthaltendem
Methanol (3 mg in 1 ccm Lösungsmittel) wurde in der Kälte bis zur Sättigung
trockener Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach kurzem Stehenlassen bei Raumtempe-
ratur wurde die Lösung im Vak. zur Trockene eingeengt, der trockene Rückstand
in Chloroform aufgenommen und mit wasserfreiem Natriumcarbonat neutral ge-
schüttelt. Die Lösung wurde nach Filtrieren auf ein kleines Volumen eingeengt;
nach Zusatz von 2 Vol-Tln. heißem Methanol kristallisierte der Dimethylester aus.
Die chromatographische Reinigung des Esters erfolgte über eine Al'Os-Grad II-
Säule. Das Eluat des gesuchten Dimethylesters wurde eingedampft, der Rückstand
dreimal aus Chloroform-Methanol umkristallisiert. Der Ester kristallisierte in
schräg abgeschnittenen Blättchen vom Schmp. 217°. Zur Analyse wurde im Hoch-
vak. bei 60° getrocknet.
4,29 mg Sbst., 11,18 mg C02, 2,41 mg H20. — 3,71 mg Sbst., 0,349 ccm N
(28°, 754,4 Torr). — 2,55 mg Sbst., 2,77 ccm ;?/50-Natriumthiosulfat.
C31H30O4N4 (524,60). Ber. C 70,97 H 6,15 N 10,68 CH3O 11,83
Gef. C 71,12 H 6,29 N 10,59 CH3O 11,23
Eisensalz des Porphyrin-dimethylesters: Der Hämindimethylester wurde, wie bei
dem entspr. Derivat von A beschrieben, dargestellt. Er kristallisierte aus heißem
Eisessig in ellipsoidförmigen Kristallen vom Schmp. 253°. Zur Eisenbestimmung
wurde im Vak. getrocknet. 0,92 mg Sbst., 0,0855 mg Fe.
C31H30O4N4 • FeCl (613,90). Ber. Fe 9,10 Gef. Fe 9,29
Bromderivat des Porphyrin-dimethylesters: 25 mg C wurden in 9 ccm heißem Eis-
essig gelöst und nach Abkühlen mit 2 ccm lOproz. und 0,2 ccm 25proz. Brom-
Über die Synthese einiger Deuteroporphyrine 195
Eisessiglösung versetzt. Nach 3stdg. Stehenlassen bei Raumtemperatur, wobei
nur wenig Perbromid ausgefallen war, wurde mit 10 ccm Aceton versetzt und 3
Stdn. reagieren gelassen. Die mischfarbene rot-grüne Lösung wurde im Vak. ein-
geengt. Der trockene Rückstand wurde in 5 ccm Pyridin gelöst. Aus der Lösung
wurde das Bromporphyrin durch Verdünnen mit Wasser unter Zusatz von wenig
Eisessig in Äther getrieben. Das Pyridin wurde mit 4proz. Salzsäure ausgewaschen.
Dann wurde der Äther zur Entfernung von unvollständig bromiertem Porphyrin
mehrmals mit 8proz. Salzsäure ausgeschüttelt. Nun wurde das Tribromporphyrin
dem Äther mit 18proz. Salzsäure entzogen; es wurde aus der salzsauren Lösung
wieder in Äther getrieben und die Fraktionierung mit Salzsäure wiederholt. Aus
der so erhaltenen salzsauren Lösung wurde das Tribromporphyrin durch Abstump-
fen mit Natriumacetat in frischen Äther getrieben. Der Äther wurde neutral ge-
waschen und mit Calciumchlorid getrocknet. Beim Einengen der Ätherlösung
kristallisierte das Bromporphyrin in gekrümmten Nadeln aus. Salzsäurezahl 13.
Die Darstellung des Tribromporphyrin-dimethylesters erfolgte aus dem Tribrom-
porphyrin durch Veresterung mit Methanol-Salzsäure in der Kälte. Der Ester
kristallisierte aus Chloroform-Methanol in derben Spießen, die nach wiederhol-
tem Umkristallisieren die Form von Nadeln annahmen; Schmp. 270°. Zur Analyse
wurde im Hochvak. bei 60° getrocknet.
3,72 mg Sbst., 6,75 mg C02, 1,29 mg FLO. — 2,06 mg Sbst., 0,138 ccm N
(280, 754^ Torr)# _ i352 mg sbst., 0,473 mg Br.
C3iH29N404Br3 (761, 32). Ber. C 48,90 H 3,84 N 7,36 Br 31,49
Gef. C 49,52 H 3,88 N 7,54 Br 31,11
D.
1.5.8-Trimethyl-4-äthyl-porphin-6.7-dipropionsänre D: Das Gemisch von 1,6 g
Pyrromethen Vlx mit 3 g Pyrromethen V5 und 13,8 g Bernsteinsäure wurde in Por-
tionen zu je 1,5 g 45 Min. bei 190° geschmolzen. Die reichliche Bromwasserstoff-
entwicklung war dann fast beendet. Die weitere Aufarbeitung der Schmelze sowie
die Äther-Salzsäure-Fraktionierung, erfolgte wie bei der Synthese von C beschrie-
ben wurde. Ausb. 72 mg (2,5° ,', d. Th.). Das Porphyrin kristallisierte aus Äther in
gebogenen Nadeln, die bis 300° nicht schmolzen. Salzsäurezahl 0,65.
Dimethylester von D: 72 mg D wurden mit 24 ccm salzsaurem Methanol in der
Kälte verestert. Der Ester, über Al.>0:3-Grad II gereinigt, schmolz nach zweimali-
gem Umkristallisieren aus Chloroform-Methanol bei 231°. Zur Analyse wurde im
Hochvak. bei 60° getrocknet.
3,34 mg Sbst., 8,80 mg CO_>, 2,01 mg FLO. — 4,16 mg Sbst., 0,377 ccm N
(290, 754,3 Torr). — 2,64 mg Sbst., 2,82 ccm w/50-Natriumthiosulfat.
C33H3604N4 (552,65). Ber. C 71,71 H 6,56 N 10,13 CH:iO 11,23
Gef. C 71,90 H 6,73 N 10,17 CH3O 11,05
Eisensalz des Porphyrin-dimethylesters: 5 mg Porphyrin-ester wurden in 0,5 ccm
Eisessig-Kochsalz gelöst und mit 0,5 ccm Eisen(II)-acetat-Eisessig-Kochsalz-
lösung 15 Min. auf dem Wasserbad erwärmt. Nach dem Abkühlen wurden die
Kristalle abzentrifugiert, mit Eisessig und Äther gewaschen und aus heißem Eis-
196 Über die Synthese einiger Deuteroporphyrine
essig umkristallisiert. Viereckige Platten vom Schmp. 254°. Zur Eisenbestimmung
wurde im Hochvak. getrocknet.
1,18 mg Sbst., 0,102 mg Fe.
C33H34O4N4 • FeCl (641,95). Ber. Fe 8,70 Gef. Fe 8,64
Bromderivat des Porphyrin-dimethylesters: 25 mg Porphyrin-dimethylester wurden
in 8 ccm Eisessig gelöst und mit 0,3 ccm einer 25proz. ßrom-Eisessiglösung ver-
setzt. Die weitere Aufarbeitung geschah in der für das entspr. Derivat von A
angegebenen Weise. Der Bromporphyrinester wurde chromatographisch gereinigt
und kristallisierte aus Chloroform-Methanol in kleinen Stäbchen. Der Schmelz-
punkt war sehr unscharf und konnte auch durch öfteres Umkristallisieren nichtver-
bessert werden. Zur Analyse wurde bei 60° im Hochvak. getrocknet.
3,63 mg Sbst., 7,46 mg CO>, 1,66 mg H20. — 4,08 mg Sbst., 0,287 ccm N
(28°, 754,5 Torr). — 3,59 mg Sbst., 0,799 mg Br. — 2,44 mg Sbst., 2,01 ccm «/50-
Natriumthiosulfat.
C33H3404N4Bro (710,46). Ber. C 55,79 H 4,82 N 7,89 Br 22,50 CH3O 8,74
Gef. C 56,08 H 5,12 N 7,92 Br 22,27 CH3O 8,52
Herrn Arnold Lehmann danken wir für die Ausführung der Analysen.
Zusammenfassung
Vier neue Deuteroporphyrine, ihre Dimethylester, Hämin-Dimethylester und
Bromderivate werden dargestellt.
Summary
The preparation is described of four new deuteroporphyrins, their dimethyl
esters, the dimethyl ester of haemin and bromo-derivatives.
Literatur
1 Warburg, O., und Gewitz, H. S., diese Z. 288 (1951), 3 Fischer, H.. und Andersag, H., Liebigs Ann. Chem.
1; 292 (1953), 174. 450 (1926), 212.
2 Fischer, H., und Scheyer, H., Liebigs Ann. Chem. 434 4 Liebigs Ann. Chem. 458 (1927), 135.
(1923), 248.
17 Versuche mit Ascites-Tumorzellen*
Von Otto Warburg und Ernst Hiepler
Messung der Zymohexase in Ascites-Serum unter aeroben und anaeroben Bedingungen. —
Messung der Atmung und Gärung der Ascites-Zellen in Ascites-Serum. — Vergleich der Stoff-
wechsel-Kapazität der Ascites-Zellen mit ihrem tatsächlichen Stoffwechsel im Tierkörper.
Zellen des Ehrlichschen Mäuse-Ascites-Tumors sind zuerst von Lettre für bio-
chemische Versuche benutzt und empfohlen worden1. Dr. Georg Klein2 (Karo-
linisches Institut, Stockholm) verdanken wir unsere Impfzellen. Wir impfen
0,2 cm3 des etwa 6tägigen Ascites und entnehmen den Ascites nach einigen Tagen
unter Zusatz von 0,1 mg Heparin pro cm3. Zur Volum- und Gewichtsbestimmung
der Zellen zentrifugieren wir aliquote Teile vor jedem Versuch im Hämatokriten
bis zur Volumkonstanz und wägen die Zellen, nach Abgießen des Serums, ohne sie
vorher zu waschen. Die Trockensubstanz enthält also immer ein wenig Serum,
wodurch die <2~Werte etwas kleiner erscheinen, als sie tatsächlich sind.
1. Zymohexase
wurde mit der optischen Methode3 in Ascites-Serum gemessen, und zwar bei
38°. „W" ist im folgenden der natürliche Logarithmus der Lichtschwächung für
die Wellenlänge 345 m/i, für d = 1 cm, pro Stunde, umgerechnet auf unverdünntes
Serum.
Jedes frische Ascites-Serum, das wir prüften, enthielt Zymohexase. W war von
der Größenordnung 100. Wurde aus dem Tier entnommener Ascites bei 38° in
Kästchen so bewegt, daß die Zellen nicht sedimentierten, so blieb die Zymohexase
im Ascites-Serum stundenlang konstant, wenn die Bedingungen aerob waren.
Abb. 1. Wechsel von aeroben zu anaeroben
Bedingungen und umgekehrt. Ohne Zusatz
von Glucose. 38°. 1 cm3 Ascites enthielt
325 mm3 Zellen == 57 mg Trockensubstanz.
Beide Kurven wurden für aliquote Teile des-
selben Ascites erhalten. Der CO^-Gehalt im
Gasraum war anaerob und aerob 5 Vol.%.
Ordinate: W Zymohexase in Ascites-Serum,
Abszisse: Zeit in Stunden.
WO
800
700
600
500
100
300
ZOO
WO
coz-oz
-
V
M
-
corjh^
-S&%
^coTöT^
/&
/&
- coz-oz
/^
* Aus Zeitschrift für Naturforschung 7b (1952): 193.
198 Versuche mit Ascites-Tumorzellen
Anaerob jedoch nahm die Zymohexase erheblich zu. Abb. 1 ist die graphische Dar-
stellung eines Versuchs, bei dem in Intervallen von je 1 Stunde abwechselnd
aerobe oder anaerobe Bedingungen erzeugt wurden.
Zweifellos rührt die Zymohexase in dem frischen Ascites-Serum von den
anaeroben Bedingungen her, unter denen sich die Zellen im lebenden Tier im
wesentlichen befinden; und wahrscheinlich ist die früher gefundene Zymohexase3
im Blutserum von tumortragenden Ratten ein Zeichen dafür, daß sich Teile der
soliden Tumoren im lebenden Tier unter anaeroben Bedingungen befinden.
Bei Gegenwart von Glucose wird unter anaeroben Bedingungen weniger Zymo-
hexase von den Ascites-Zellen abgegeben als bei Abwesenheit von Glucose. Da
aber, wegen der Größe der Gärung, unter anaeroben Bedingungen auch Zucker-
mangel herrscht, so ändert dies an unseren Schlußfolgerungen nichts.
2. Atmung und Gärung
der Ascites-Zellen wurden in Ascites-Serum mit dem für Blutserum4 beschrie-
benen Methoden in Kästchen von 3 — 5 cm3 Inhalt gemessen. Dabei mußte der
Ascites, damit die manometrischen Ausschläge nicht zu groß wurden, mit Ascites-
Serum auf das 50- bis 200fache verdünnt werden. Der zum Versuch verwendete
Ascites durfte nur 1,5—3 mm3 Zellen pro cm3 enthalten, während unverdünnter
Ascites 100—400 mm3 Zellen pro cm3 enthält. Je 1 cm3 verdünnter Ascites wurde
in ein Kästchen eingefüllt.
Ascites-Serum enthält — wegen der großen Zelldichte und der großen Gärung
— im allgemeinen keinen Zucker, dafür aber viel Milchsäure, nämlich 1 — 2 mg
pro cm3. Bewegt man den verdünnten Ascites, ohne Zusatz von Zucker, in den
Kästchen bei 38° in 5% CCVLuft, so veratmen die Zellen fast ausschließlich
Milchsäure, wie man durch Sauerstoff-, Bicarbonat- und Milchsäurebestimmun-
gen feststellen kann. CO2/O2 beträgt dabei nur 0,67, weil ljz der entstehenden At-
mungskohlensäure durch das freiwerdende Na gebunden wird, wobei also der
Bicarbonatgehalt des Serums zunimmt. Qo2 beträgt — 5 bis — 10.
Bei Zusatz von Zucker (2mg pro cm3) findet man die folgenden Stoffwechsel-
größen, die 3—6 Stunden nahezu konstant bleiben können (mm3 pro mg Trocken-
gewicht und Stunde) :
= + 45 bis 55
o°2 =
+ 35 bis 45
ßo,=
= — 5 bis —
15.
Ist die Atmung klein, so wirkt sie oft mit dem normalen Meyerhof-Quotienten 2
auf die Gärung. Ist die Atmung groß, so wirkt sie gar nicht oder nur wenig auf die
Gärung. Immer ist das Ergebnis, wie bei den Schnitten solider Tumoren, daß eine
große aerobe Glykolyse übrig bleibt.*
* Zusatz 1961. Diese Angabe stimmt mit unsern späteren Erfahrungen nicht
überein. In sehr vielen Versuchen der letzten Jahre haben wir gefunden, daß der
Meyerhof-Quotient der Ascites-Krebszellen in Serum größer als 2 ist, also größer
als in embryonalen Zellen und im allgemeinen zwischen 3 und 5 liegt. — Auch der
Versuche mit Ascites-Tumorzellen 199
Der einzige Unterschied gegenüber den Versuchen mit Tumorschnitten ist die
Größe von Om, die anaerob für Jensen-Sarkome = 36 — 38 gefunden wurde,
während wir hier 45 — 55 finden. Wir schließen daraus, daß die Schnitte unserer
Jensen-Sarkome im Mittel 37/so X 100 = 74% Krebszellen enthielten, während
26",, Bindegewebe war, aus histologischen Gründen eine durchaus wahrscheinliche
Zusammensetzung.
Gegen die Berechnung der Gärung der Tumoren aus den Versuchen mit Schnit-
ten des Jensen-Sarkoms wurde eingewendet5, aus den Schnitten werde während der
manometrischen Messungen so viel Substanz in die umgebende Flüssigkeit aus-
geschüttelt, daß das Schnitt-Endgewicht nur halb so groß sei wie das Schnitt-
Anfangsgewicht; daß also bei der Berechnung der O:\i-Werte aus dem Endgewicht
die Gärung viel zu groß gefunden werde; in Wirklichkeit sei Q^ nicht 37, son-
dem nur 18. Offenbar ist das Umgekehrte richtig. <2M2 reiner Krebszellen be-
trägt nicht 18, sondern im Mittel 50.
3. Stoffwechsel der Ascites-Zellen im Körper*
Wenn 1 cm3 Ascites im Mittel 250 mm3 Zellen enthält und wenn eine Maus 5 cm3
Ascites enthält, so enthält ihr gesamter Ascites
5 • 250 • 0,175 = 220 mg Trockensubstanz,
die pro Stunde 220 50 = 11000 mm3 Milchsäure entwickeln oder 44 mg Glu-
cose zu Milchsäure vergären können, während der gesamte Blutzucker einer Maus
von der Größenordnung 4 mg ist.
Man sieht aus dieser Rechnung, daß die gefundenen Stoffwechselgrößen im
Körper nicht verwirklicht werden können und daß die Ascitesflüssigkeit im Körper,
wie man es auch tatsächlich findet, nur sehr wenig gärfähigen Zucker enthalten
kann. Man kann sich davon überzeugen, indem man von frisch entnommenem
Ascites einen Teil sofort auf 0° abkühlt und zentrifugiert, einen anderen Teil bei
38° stehen läßt. Bestimmt man dann nach einiger Zeit das Bicarbonat in dem Serum
der beiden Proben, so findet man, daß das Bicarbonat bei 38° nicht abgenommen
hat; während es sofort abnimmt, wenn man zu Ascites Zucker zusetzt.
Offenbar hängt der Verbrauch der Krebszellen an Zucker und, wie wir hinzu-
hier angegebene Grenzwert — 15 für die Atmung der Ascites-Krebszellen stimmt
nicht mit unsern späteren Versuchen überein. Wir fanden später — 5 bis — 8 für die
Atmung der Ascites-Krebszellen. Andrerseits ist die anaerobe Gärung meistens
höher, als hier angegeben, nämlich 70.
* Zusatz 1961. A. Kemp und B. Mendel (Nature 180 [1957], 131) haben diese
Frage 1957 beantwortet. Den Krebszellen wird der zur maximalen Gärung not-
wendige Zucker dadurch zur Verfügung gestellt, daß die durch Gärung entstan-
dene Milchsäure in der Leber immer wieder zu Glykogen resynthetisiert und von
der Leber als Zucker in den Kreislauf gegeben wird. Die Oxydationsenergie der
Leber liefert also die Gärungsenergie für die Krebszellen.
200 Versuche mit Ascites-Tumorzellen
fügen wollen, ihr Verbrauch an Sauerstoff, nicht von der Stoffwechsel- Kapazität
der Krebszellen ab, sondern von den relativ kleinen Mengen an Zucker und Sauer-
stoff, die durch Diffusion oder Konvektion in den Ascites gelangen. Daß die
Ascites-Zellen trotzdem im Körper am Leben bleiben, ist erstaunlich und gibt zu
der Frage Anlaß, mit wie wenig Energie Krebszellen im Körper auskommen können.
Literatur
1 Lettre, H., Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 268 3 Warburg, O., Wasserstoffübertragende Fermente, Can-
(1941), 59; Z. Krebsforschg. 57 (1950), 1; Naturwiss. tor- Verlag, Freiburg (Baden).
38 (1951), 490. 4 Warburg, O., Stoffwechsel der Tumoren. Verlag Sprin-
2 Klein, Georg, The Production of Ascites Tumors, ger, Berlin 1926.
Uppsala 1951; Cancer 3 (1950), 1052. 5 J. National Cancer Institute 2 (1941), 201.
18 Weiterentwicklung der Methoden zur Messung
der Photosynthese*
Von Otto Warburg, Günther Krippahl, Wolfgang Buchholz
und Walter Schröder
Die durch die Addition der Atmung bedingte Unsicherheit bei Messungen der Photosynthese ist
dadurch beseitigt worden, daß durch physikalische und biologische Maßnahmen die Atmung zu
einem zu vernachlässigenden Korrektionsglied heruntergedrückt wurde. Die Messung des Quanten-
bedarfs der Photosynthese ist dadurch einfacher und sicherer geworden.
Wenn in der Photosynthese Sauerstoff entsteht und in der Atmung Sauerstoff ver-
braucht wird, so ist der im Licht von der Zelle abgegebene, tatsächlich gewonnene
Sauerstoff: Gewinn = Photosynthese Atmung, [1]
eine Gleichung, die immer richtig ist, wie sich auch die Atmung im Licht ver-
halten mag, ob sie abnehmen, zunehmen oder konstant bleiben mag. Immer wird
von der Zelle nur der um die jeweilige Atmung verminderte Sauerstoff abgegeben.
Bestimmt man aber die Atmung im Dunkeln und berechnet die Photosynthese
mit Hilfe der Gleichung:
Gewinn = Photosynthese — Dunkelatmung,
so führt man eine im Dunkeln gemessene Atmung in die Heil-Gleichung [1] ein
und macht dabei die unsichere Annahme :
Hellatmung = Dunkelatmung.
Mit dieser Unsicherheit sind alle bisherigen Bestimmungen der Photosynthese
behaftet.
Offenbar könnte man hier Abhilfe schaffen, wenn man so stark belichten würde,
daß die Atmung klein gegen die Photosynthese würde. Dann würde [1 ] übergehen in :
Gewinn = Photosynthese, [2]
womit die Bestimmung der Photosynthese einfacher und sicherer geworden wäre :
Einfacher, weil man die Belichtung nicht mehr zwecks Atmungsmessung unter-
brechen müßte; und sicherer, weil die Photosynthese ohne jede Rechnung aus
einer experimentell genau bestimmbaren Größe erhalten würde.
Einige Zahlen mögen das Gesagte erläutern. Chlorella werde mit wachsenden
Intensitäten einer beliebigen Wellenlänge belichtet, der Quantenbedarf der Photo-
synthese sei bei allen Intensitäten 1/V/' = 3. Belichtet man zunächst so schwach,
daß die Atmung gerade kompensiert, daß also der Kompensationsgrad gleich 1 ist,
so ist der Gewinn Null und der Quantenbedarf des Gewinns 1/v unendlich groß.
Bei dem beliebigen Kompensationsgrad q ist der Quantenbedarf des Gewinns :
J— V-h" Kl
* Auszüge aus Zeitschrift für Naturforschung 8b (1953): 675. Nur solche Teile dieser Arbeit
sind hier abgedruckt, die methodische Fortschritte bedeuten.
202 Weiterentwicklung der Methoden zur Messung der Photosynthese
Berechnen wir mit Hilfe von [3] den Quantenbedarf des Gewinns für verschie-
dene Werte von o, während der Quantenbedarf der Photosynthese konstant gleich
3 bleiben soll, so erhalten wir :
Kompensationsgrad Quantenbedarf
der Atmung des Gewinns
M
1 1
f f' Q — 1
1 oo
3 4,5
5 3,8
10 3,3
40 3,07
d. h. bei lOfacher Kompensation der Atmung wäre Gl. [2] bereits zu 90% und bei
40facher Kompensation zu 98" n erfüllt.
Nun bleibt allerdings in Wirklichkeit der Quantenbedarf der Photosynthese bei
steigenden Lichtintensitäten nicht konstant, sondern er nimmt langsam zu. Aber
durch geeignete biologische und physikalische Maßnahmen kann man es erreichen,
daß der Quantenbedarf mit der Intensität so langsam zunimmt, daß man bei
40facher Kompensation der Atmung noch gute Ausbeuten erhält.
Zu unseren biologischen Maßnahmen gehörte die Züchtung von Zellen sehr
hoher photosynthetischer Kapazität. Solche Zellen entwickelten pro Stunde bis
zu ihrem 60fachen Volumen an Sauerstoff, während sie im Dunkeln in der glei-
chen Zeit im Mittel nur etwa das Ifache Zellvolumen an Sauerstoff verbrauchten.
Linearität der Lichtwirkungen bis zu höheren Lichtintensitäten wurde erreicht
durch Verwendung sehr dünner Zellsuspensionen und durch fast vollständige Aus-
leuchtung dieser dünnen Suspensionen in den Manometergefäßen, so daß die
Lichtintensität, zum mindesten im Grün, bei den Messungen fast homogen war.
Langandauernde, durch keine Atmungsmessung unterbrochene, kontinuierliche
Belichtung aber wurde durch das Prinzip der Methode ermöglicht: Durch die
Nichtberücksichtigung der Atmung.
In den Abb. 1 und 2 sind zwei Versuche graphisch dargestellt. In dem Versuch
der Abb. 1, bei dem mit der Wellenlänge 546 m/i 41/2 Stunden ununterbrochen be-
lichtet wurde und die Atmung 41fach kompensiert war, betrug der Quanten-
bedarf des Gewinns 1/g? = 4,3. In dem Versuch der Abb. 2, bei dem mit der
Wellenlänge 644 m/t 7 Stunden ununterbrochen belichtet wurde und die Atmung
7fach kompensiert war, betrug der Quantenbedarf des Gewinns l/ = = 1 für die Wellenlängen 436, 480, 546, 578 und
644 m/i bis zu eingestrahlten Quantenintensitäten von 15 mm3 pro Minute, wäh-
rend bei Verwendung des kleinen Aktinometers (vF == 7) nur 1,5 mm3 Quanten
eingestrahlt werden durften, wenn man q> - = 1 erhalten wollte. Durch die Ver-
größerung der Abmessungen des Instruments ist also die erlaubte Intensitäts-
grenze auf das lOfache gesteigert worden.
Als Instrument zur Messung der Durchlässigkeit von Zellsuspensionen wird
das Aktinometer von der ULBRiCHTschen Kugel verdrängt werden, weil die Kugel
schneller arbeitet, während das Aktinometer seine Bedeutung bei der Messung
von Quantenintensitäten behalten wird. Denn anders als das Bolometer mißt das
Aktinometer die Zahl der Quanten. Nicht mit dem Bolometer, aber mit dem
Aktinometer kann man die Quantenintensität von polychromatischem Licht mes-
sen, ohne die spektrale Zusammensetzung des Lichts zu kennen. Und ferner : Das
Aktinometer mißt J J dt, das Bolometer aber nur J.
6. Argon
Da Sauerstoff und Stickstoff, wenn sie unter Druck in Stahlflaschen aufbewahrt
werden, Spuren von Stickoxyden bilden können, die giftig sind, so haben wir, wie
bereits früher bei Stoffwechselversuchen mit tierischen Zellen, nunmehr auch bei
den Versuchen mit Chlorella den Stickstoff durch Argon ersetzt, und zwar sowohl
bei der Züchtung als auch bei den manometrischen Messungen.
Weiterentwicklung der Methoden zur Messung der Photosynthese 207
7. Züchtung und Eigenschaften der Zellen
Zur Zucht der Chlorella pyrenoidosa, deren Stamm wir Professor Härder, Göttin-
gen, verdanken, verwenden wir nicht mehr Brunnenwasser, sondern aus Quarz
dest. Wasser, dem wir alle von Arnon1 empfohlenen Mikroelemente zusetzen. Die
Lichtquelle war immer das Tageslicht, dem als kontinuierliche Lichtquelle eine
200-Watt-Metallfadenlampe oder eine 160-Watt-Xenon-Hochdrucklampe hinzu-
gefügt wurde. Die Saat war 30 — 60 mm3 pro 250 cm3 Kolben, die Ernte nach
1—2 Tagen 200—600 mm3 Zellen. War die Ernte nicht größer als 200 mm3 Zellen,
so konnte die Kultursuspension direkt zur Messung der Photosynthese benutzt
werden. War die Ernte größer, so mußten die Zellen in neue Kulturlösung über-
tragen werden. pH bei Beginn der Kultur war immer etwa 4,2 und stieg bis zur
Ernte auf 5 — 5,5.
Die so gezüchteten Zellen unterscheiden sich in mancher Hinsicht von unsern
früheren Zellen, z.B.:
1. Die neuen Zellen haben eine höhere photochemische Kapazität.
2. Die neuen Zellen sind osmotisch empfindlicher. Werden sie aus ihrer Kultur-
lösung in dest. Wasser übertragen, so koagulieren sie.
3. Die Rückreaktion der neuen Zellen, wenn sie in Kulturlösung suspendiert
und mit 10° 0 CO-2 gesättigt sind, hat eine Halbwertszeit von nur einigen Sekunden
(vgl. Abschn. 13).
4. Die neuen Zellen verhalten sich gegen Änderungen des CO-2-Drucks — in
sauren wie in alkalischen Medien — anders als die alten Zellen, worüber eine
Arbeit folgt.
Es ist hervorzuheben, daß die aufgezählten Verschiedenheiten nicht von Ver-
schiedenheiten der verwendeten Chlorella-Stämme herrühren. Der einzig erkenn-
bare morphologische Unterschied war, daß über Zentrifugaten der alten Zellen
breite weiße Säume (über den grünen Zellen) gesehen wurden, die aus Sporen-
hüllen bestanden; während über Zentrifugaten der neuen Zellen keine weißen
Säume oder nur sehr dünne Säume gesehen wurden.
Literatur
1 Arnon, D. J., Amer. J. Bot. 25 (1938), 322.
19 Über die Wirkungsgruppen der oxydierenden
und reduzierenden Fermente*
Von Otto Warburg, Berlin-Dahlem
Vortrag, gehalten bei der Hauptversammlung der Max-Planck-Gesellschaft in Berlin-Dahlem
am 21. Mai 1953.
Seit Lavoisier im Jahre 1780 die Zellatmung entdeckte, hat man sich fragen müs-
sen, wie es kommt, daß die biologischen Brennstoffe im Leben mit Sauerstoff rea-
gieren, während sie im Reagenzglas mit Sauerstoff nicht reagieren. Die Antwort
lautet: So wenig wie im Reagenzglas, so wenig reagieren die Brennstoffe im Leben
mit Sauerstoff; sondern der Sauerstoff reagiert im Leben mit komplexem Ferro-
Eisen, das er zu Ferri-Eisen oxydiert. Ist dies geschehen, so wird das Ferri-Eisen
von der Zelle zurückreduziert, und neuer Sauerstoff kann mit dem Ferro-Eisen
reagieren. Der so wirkende Katalysator der Atmung, den man das sauerstoff-
übertragende Eisen genannt hat, ist durch eine ungewöhnliche Methode entdeckt
worden, deren Prinzip ich durch einen Versuch erläutern will.
Versuch I
Das Spektrum einer Xenon-Hochdrucklampe der Osram-Studiengesellschaft wird
auf eine Perlwand projiziert. In den Strahlengang bringt man zwei Tröge, die
beide eine Lösung von reduziertem Bluthämin in 15% Pyridin-Wasser enthalten.
Beide Lösungen unterscheiden sich dadurch, daß die obere mit Stickstoff, die
untere mit Kohlenoxyd gesättigt ist. Oben, in Stickstoff, sieht man die Banden des
freien, nicht mit Kohlenoxyd verbundenen Eisens, die im grün liegen. Unten, in
Kohlenoxyd, sollte man die Banden des mit Kohlenoxyd verbundenen Eisens
sehen, die im gelb liegen. Doch ist das nicht der Fall, da das starke Licht der Pro-
jektionslampe die Kohlenoxydverbindung, sowie sie sich bildet, immer wieder
spaltet. Zunächst also sieht man keinen Unterschied in der Lage der Banden in
den beiden Trögen.
Schwächt man jedoch das Licht der Projektionslampe, bevor es in die Tröge ein-
tritt, mit einem Rauchglas, so sieht man, wie in dem unteren Trog die Banden von
grün nach gelb wandern; während sie von gelb nach grün zurückkehren, wenn man
das Rauchglas wieder fortnimmt. Sehr schön sieht man die Erscheinungen, wenn
man durch einen rotierenden Sektor das Licht abwechselnd stärker und schwächer
werden läßt. Dann bleiben die Banden in dem oberen Trog, wo kein Kohlenoxyd
ist, ruhig, während sie sich in dem unteren Trog, wo das Kohlenoxyd ist, hin- und
herbewegen. So also kann man sehen, wie das Kohlenoxyd im Dunkeln (oder in
schwachem Licht) mit Eisen reagiert und wie es im Licht von dem Eisen wieder
abgespalten wird.
Anwendung. Wir fanden, daß Kohlenoxyd im Dunkeln die Zellatmung hemmt und
daß Licht die Kohlenoxydhemmung der Atmung wieder zum Verschwinden
* Aus Die Naturwissenschaften 40 (1953): 493.
Über die Wirkungsgruppen der oxydierenden und reduzierenden Fermente 209
bringt, mit anderen Worten : Wir fanden, daß Kohlenoxyd im Dunkeln mit einem
Katalysator der Atmung reagiert und daß es im Licht von diesem Katalysator wie-
der abgespalten wird. Diese Analogie war so groß, daß man sagen kann, Kohlen-
oxyd und Licht haben das sauerstoffübertragende Eisen entdeckt, damals eine un-
sichtbare Substanz, die aus den Zellen zu isolieren aussichtslos erschien.
Isolierung des sauerstoffübertragenden Eisens. Obwohl mit Kohlenoxyd und Licht
viele Eigenschaften des sauerstoffübertragenden Eisens gefunden wurden, so hatte
die Methode doch ihre Begrenzungen, und so haben wir im Laufe der Jahre immer
wieder versucht, das sauerstoffübertragende Eisen zu isolieren. In einer Arbeit mit
Negelein wurde der Anfang gemacht; aber erst in einer Arbeit mit Hans-Sieg-
fried Gewitz ist es in der letzten Zeit gelungen, das sauerstoffübertragende Eisen
in solchen Mengen zu isolieren und zu kristallisieren, daß man heute diese wichtige
Substanz mit den Methoden der Chemie untersuchen kann. Dabei hat das isolierte
Eisen bestätigt, was Kohlenoxyd und Licht vorausgesagt hatten: daß das sauer-
stoffübertragende Eisen eine Häminverbindung ist ; daß die Kohlenoxydbande des
sauerstoffübertragenden Eisens um 590 m// liegt; daß das sauerstoffübertragende
Eisen wesentlich verschieden von Bluthämin ist.
Versuch II
Auf der Perlwand wird ein Trog abgebildet, der eine Lösung des sauerstoffüber-
tragenden Hämins in 3°0 Pyridin enthält. Das Eisen des Hämins ist hier 3wertig,
die Farbe der Lösung ist gelbgrün. Reduzieren wir nunmehr das Eisen, so sieht
man, wie beim Valenzwechsel des Eisens die Farbe der Lösung von gelbgrün in
tiefes Rot umschlägt. Leiten wir dann Sauerstoff durch die rote Lösung, so wird
das 2wertige Eisen wieder zu 3wertigem Eisen oxydiert, und die Lösung wird wie-
der gelbgrün.
Dies ist insofern kein Modellversuch, als es der Valenzwechsel desselben Hä-
mins ist, der sich fortgesetzt in allen unsern Zellen abspielt. Es ist der Vorgang,
durch den im wesentlichen der Sauerstoff in der organischen Welt übertragen wird.
Versuch III
Wiederum wird das Spektrum der Xenon-Hochdrucklampe projiziert. In den
Strahlengang werden zwei Tröge gebracht, von denen der obere Trog eine Lösung
von Bluthämin enthält, der untere Trog eine Lösung des sauerstoffübertragenden
Hämins. In beiden Trögen ist das Eisen zunächst 3wertig. Reduzieren wir das
Eisen in beiden Trögen zur Ferro-Form, so entwickeln sich in beiden Trögen die
Ferrobanden. Sie sind sehr erheblich gegeneinander verschoben. Die Banden des
Bluthämins liegen im grün, die Banden des sauerstoffübertragenden Hämins aber
im gelb.
In entsprechender Weise vergleichen wir das Spektrum des sauerstoffübertragen-
den Hämins mit einem Hämin, das wir aus Chlorophyll b, nach Abspaltung des
Magnesiums durch Eisen, gewonnen haben. Hierbei zeigt sich, daß die Ferroban-
den der beiden Hämine nicht wesentlich gegeneinander verschoben sind. Spektral
14 Warburg, Zellphysiologie
210 Über die Wirkungsgruppen der oxydierenden und reduzierenden Fermente
steht also das sauerstoffübertragende Hämin dem Hämin aus Chlorophyll b näher
als dem Bluthämin.
Chemische Konstitution. Der durch die Absorptionsbanden gefundene Unter-
schied zwischen sauerstoffübertragendem Hämin und Bluthämin kommt in
den Elementaranalysen sehr deutlich zum Ausdruck. Bluthämin enthält 8,5%
Stickstoff, sauerstoffübertragendes Hämin enthält nur 6,5% Stickstoff. Blut-
hämin enthält 34 Atome Kohlenstoff, sauerstoffübertragendes Hämin enthält
etwa 48 Atome Kohlenstoff. In der Tat enthält das sauerstoffübertragende
X
t
i
\
/
/ - y
\
I
*
Fig. 1. Dimethylester des Deuteroporphyrins Fig. 2. Dimethylester des Deuterohämins aus
aus sauerstoffübertragendem Hämin. sauerstoffübertragendem Hämin.
Hämin eine Kette von Kohlenstoffatomen, die bisher noch in keinem Hämin
gefunden worden ist und von der die besonderen physikalischen Eigenschaften
des sauerstoffübertragenden Hämins, z. B. seine Löslichkeit in Äther, her-
rühren. In den Pyrrolringen 1 oder 2 befindet sich ferner eine Formylgruppe,
die sonst für das Chlorophyll b charakteristisch ist ; während die Pyrrolringe 3 und
4, die die beiden Propionsäuren tragen, identisch sind mit den entsprechenden
Pyrrolringen des Bluthämins. Das sauerstoffübertragende Hämin ist also in der
einen Hälfte Bluthämin, in der anderen Hälfte steht es dem Chlorophyll nahe und
enthält außerdem eine Kohlenwasserstoff kette, die in keinem der beiden anderen
Hämine vorkommt. Einige besonders schön kristallisierende Derivate des sauer-
stoffübertragenden Hämins sind in den Fig. 1 und 2 abgebildet.
Im Leben ist das sauerstoffübertragende Hämin, wie mit Kohlenoxyd und Licht
gefunden wurde, an Eiweiß gebunden. Diese Bindung des Hämins an Eiweiß be-
einflußt sowohl die Energie als auch die Geschwindigkeit des Valenzwechsels.
Mit der Wirkungsgruppe — dem Eisen- und dem Wirkungsmechanismus — , dem
Valenzwechsel — , ist also die Katalyse noch nicht vollständig erklärt. Aber im
Über die Wirkungsgruppen der oxydierenden und reduzierenden Fermente 211
Vergleich zu dem Zustand, in dem man weder Wirkungsgruppe noch Wirkungs-
mechanismus kannte, ist der Fortschritt fast unendlich groß.
Nikotinsäureamid. Eine andere Wirkungsgruppe, die wir bei der Untersuchung
der Zellatmung gefunden haben, ist das Nikotinsäureamid. Es ist eine einfache
Pyridinverbindung, die durch partielle Hydrierung und Dehydrierung ihres
Pyridinrings in der Atmung Wasserstoff überträgt (Fig. 3).
CH CH
CH,r ^CCONH., CH,f NCCONH,
+ 2H= " + W
CHI .CH cm Jch,
R R
Fig. 3. Wasserstoff- (Elektronen-) Aufnahme durch Nikotinsäureamid.
Versuch IV
Auch die Funktion des Nikotinsäureamids kann man durch ein Experiment zei-
gen. Zwar ist das Nikotinsäureamid eine farblose Substanz, die auch im Ultra-
violett keine charakteristischen Banden hat. Aber wenn das Nikotinsäureamid
Wasserstoff aufnimmt, so entsteht im nahen Ultraviolett eine charakteristische
Bande und mit der Bande eine bläulich-weiße Fluoreszenz. Man kann also die
Wasserstoffaufnahme des Nikotinsäureamids zeigen, wenn man es vordem Schwarz-
glas einer Analysen-Quarzlampe reagieren läßt. Zum Beispiel befindet sich in der
einen Flasche eine Nikotinsäureamid-Verbindung, in der andern ein Reduktions-
mittel. Jede der beiden Lösungen ist vor dem Schwarzglas dunkel. Gießen wir
aber die beiden Lösungen zusammen, so entsteht das partiell hydrierte Nikotin-
säureamid, und mit ihm erscheint die bläulich-weiße Fluoreszenz.
Diese Fluoreszenz entsteht immer, wenn Nikotinsäureamid und die Brennstoffe
der Zelle unter geeigneten Bedingungen zusammentreffen. Dann entzieht das
Nikotinsäureamid den Brennstoffen Elektronen und verbrennt sie, schrittweise, zu
Kohlensäure und Wasser.
Nikotinsäureamid ist auch der Wasserstoffüberträger der Gärungen. Bei den
Gärungen entzieht das Nikotinsäureamid dem einen Teil des Zuckers Wasser-
stoff und überträgt diesen Wasserstoff auf den anderen Teil des Zuckers. Wenn
z. B. bei der alkoholischen Gärung der Zucker zum Teil zu Kohlensäure oxydiert,
zum Teil zu Alkohol reduziert wird, so ist dies das Werk des Nikotinsäureamids.
Die Gleichung der Alkoholbildung lautet:
Dihydro-Nikotinsäureamid + Acetaldehyd = Nikotinsäureamid + Alkohol.
Diese Reaktion ist es, durch die der Alkohol in der lebenden Natur entsteht.
Auch bei der Photosynthese scheint das Nikotinsäureamid eine Rolle zu spielen.
Es wird neuerdings von Severo Ochoa angenommen, daß in grünen belichteten
Pflanzenzellen Nikotinsäureamid den Wasserstoff des Wassers aufnimmt und mit
diesem Wasserstoff die Kohlensäure reduziert,* während der Sauerstoff des Wassers
in die Luft entwickelt wird.
* Zusatz 1961. Dies stimmt heute nicht mehr.
212 Über die Wirkungsgruppen der oxydierenden und reduzierenden Fermente
Die Wasserstoffübertragung durch Nikotinsäureamid wurde 1934 in Dahlem
entdeckt. Seitdem hat diese Substanz ihren Siegeszug durch die Biochemie ange-
treten, der noch heute mit unverminderter Stärke anhält. In der Bilanz ist der
Sauerstoff das Oxydans der organischen Welt; aber dem Mechanismus nach ist es
das Nikotinsäureamid. In der Bilanz sind die Gärungen Dismutationen der Sub-
strate; aber dem Mechanismus nach sind sie Wasserstoffverschiebungen durch
Nikotinsäureamid. In der Bilanz ist die Photosynthese eine Spaltung von Kohlen-
säure in Kohlenhydrat und Sauerstoff; aber dem Mechanismus nach ist sie viel-
leicht eine Wasserstoffübertragung durch Nikotinsäureamid.
Alloxazin. Eine dritte Wirkungsgruppe, die wir bei der Untersuchung der Zell-
atmung gefunden haben, ist das gelbe Alloxazin, ein einfacher stickstoffhaltiger
Ring, dessen Funktion es ist, den Wasserstoff, den das Nikotinsäureamid den
Brennstoffen entzogen hat, an das Eisen weiterzugeben. Alloxazin und seine in der
Natur vorkommenden Derivate sind von Richard Kuhn in berühmten Arbeiten
synthetisiert worden.
Versuch V.
Alloxazin fluoresziert bei Bestrahlung mit blauem Licht gelbgrün, während das
reduzierte Alloxazin farblos ist und auch im nahen Ultraviolett nicht fluoresziert.
Läßt man also das gelbe Alloxyzin in blauem Licht oder vor dem Schwarzglas der
Analysen-Quarzlampe zwei Atome Wasserstoff aufnehmen, so verschwindet die
Fluoreszenz. Leitet man Sauerstoff durch die Lösung, so kehrt die Fluoreszenz zu-
rück.
Kette der Wirkungsgruppen. Weitere Wirkungsgruppen der Atmung sind die drei
Hämine, die MacMunn im Jahre 1885 entdeckte und die er Histohämatine genannt
hat. Es sind drei Eisenverbindungen, deren Ferroformen nicht mit Sauerstoff rea-
gieren und deren Wirkungsweise deshalb lange Zeit unverständlich blieb. Heute
wissen wir, daß die Histohämatine mit den anderen Wirkungsgruppen der At-
mung in einer Kette zusammenwirken und daß ihr Platz zwischen Alloxazin und
sauerstoffübertragendem Eisen ist. Damit ist die Zahl unserer Wirkungsgruppen
auf sechs gestiegen, und wahrscheinlich sind damit alle Wirkungsgruppen der
biologischen Verbrennung erkannt.
Der vollständige Mechanismus der biologischen Oxydation läßt sich dann in
wenigen Sätzen zusammenfassen: Das Nikotinsäureamid entzieht den Brenn-
stoffen Elektronen, wodurch sie oxydiert werden. Es folgt der Transport dieser
Elektronen von dem Nikotinsäureamid zu dem Alloxazin, von dem Alloxazin zu
den Histohämatinen, von den Histohämatinen zu dem sauerstoffübertragenden
Eisen, von dem sauerstoffübertragenden Eisen zu dem molekularen Sauerstoff. Der
eigentliche und innerste Mechanismus der Verbrennung in dieser 6stufigen Kette
ist der Übergang der Elektronen von den Brennstoffen auf das Nikotinsäureamid.
Alles weitere ist Abtransport dieser Elektronen zum molekularen Sauerstoff.
Von keinem Glied der Kette kann man sagen, daß es wichtiger sei als das andre.
Fällt ein Glied aus, so kommt die Zellatmung zum Stillstand. Zum Beispiel beruht
Über die Wirkungsgruppen der oxydierenden und reduzierenden Fermente
213
die giftige Wirkung der Blausäure darauf, daß sie sich mit dem sauerstoffübertra-
genden Eisen verbindet. Dann ist dieses Eisen nicht mehr imstande, Elektronen
auf den molekularen Sauerstoff zu übertragen; es stauen sich die Elektronen am
Nikotinsäureamid, und damit kommt der ganze Prozeß der Atmung zum Stillstand.
Nukleotide. Es bleibt noch, die Bindung der Wirkungsgruppen Nikotinsäureamid
und Alloxazin in den Katalysatoren zu erläutern. Wie das Eisen nicht als freies Ion
NE,
H— C— OPO3H,
O O
H— C-OH
CH.,— O— P— O— P— O— CH,
I I
O- OH
Fig. 4. Triphospho-Pyridin-Nukleotid.
CH.,— O— P— O— P— O— CH,
OH OH
Fig. 5. Alloxazin-Adenin-Dinukleotid.
vorliegt, sondern eingebaut in Porphyrine, so liegen Nikotinsäureamid und Allo-
xazin nicht als freie Basen vor, sondern eingebaut in Molekeln, die Phosphorsäure,
Kohlenhydrat und meistens auch Adenin enthalten und die Nukleotide genannt
worden sind. Aus den Fig. 4 und 5 sieht man, daß in solchen Nukleotiden die
(umrandeten) Wirkungsgruppen nur einen kleinen Teil der Molekeln ausmachen.
Bindung an Eiweiß. Die Nukleotide sind in den Katalysatoren nicht frei, sondern
sie sind, ebenso wie die Hämine, an Eiweißkörper gebunden, deren Molekular-
214 Über die Wirkungsgruppen der oxydierenden und reduzierenden Fermente
gewicht von der Größenordnung 100000 ist. Damit bin ich in meiner Darstellung
von den Wirkungsgruppen bis zu den Sauerstoff- und wasserstoffübertragenden
Fermenten vorgedrungen, die also nach dem Gesagten drei Komponenten ent-
halten. Ihre Größenverhältnisse soll die Fig. 6 veranschaulichen. Der große Kreis
ist das Eiweiß. Der mittlere Kreis ist das Hämin oder das Nukleotid. Der innerste
Kreis ist die Wirkungsgruppe — das Eisen oder das Nikotinsäureamid oder das
Alloxazin.
So ist es also bei der Untersuchung der Zellatmung gewesen, daß die Natur —
zum ersten Male — das Geheimnis von Fermentwirkungen preisgegeben hat.
Dabei hat sich gezeigt, daß diese Fermente nicht, wie noch Willstaetter glaubte,
durch besondere, nur dem Leben eigene Kräfte wirken; sondern die sauerstoff-
und wasserstoffübertragenden Fermente wirken durch chemische Zwischenreak-
Fig. 6. Größenverhältnisse der 3
Komponenten der Sauerstoff- und
wasserstoffübertragenden Fermente.
tionen einfacher, längst bekannter Substanzen, deren Besonderheit es lediglich ist,
daß die Zwischenreaktionen schneller verlaufen, als die organische Chemie es für
möglich gehalten hätte.
Hugo Theorell. Untrennbar mit diesen Ergebnissen verbunden ist ein Name, dessen
Träger zu unserer Freude unter uns weilt. Ich meine Hugo Theorell. Als Theo-
rell 1933 nach Dahlem kam, war das gelbe Ferment noch mehr als unrein, und
von den Alloxazinen war nur das Luminoflavin entdeckt. Theorell stellte das
gelbe Ferment rein dar. Er zerlegte das reine Ferment in Eiweiß und Alloxazin und
entdeckte dabei das k\\o\2LZ\n-Nukleotid. Und schließlich glückte es Theorell,
Eiweiß und Nukleotid wieder zu dem voll wirksamen Ferment zu vereinigen. Es ist
die noch heute unübertroffene Meisterarbeit der Fermentchemie.
Anmerkungen
1 . Anlaß zu diesem Vortrag war der Fortschritt in der Chemie des sauerstoffüber-
tragenden Eisens und — noch mehr — der Wunsch, ein Gebiet, auf dem Physik
und Chemie am weitesten in das Gebiet der Lebensvorgänge hineinragen, auch in
der Sprache dieser Wissenschaften darzustellen. Wir sagen also nicht mehr, daß
„Kodehydrasen Reaktionen aktivieren", wenn wir wissen, daß Wasserstoffüber-
tragungen durch Nikotinsäureamid vorliegen. Wir sagen nicht mehr, daß „Cyto-
chrom a'3 den molekularen Sauerstoff aktiviert", wenn wir wissen, daß Reaktionen
des Sauerstoffs mit Ferro-Eisen vorliegen. Wir sagen nicht mehr, daß „Gärungs-
fermente die Dismutation von Substraten aktivieren", wenn wir wissen, daß Was-
Über die Wirkungsgruppen der oxydierenden und reduzierenden Fermente 215
serstoffverschiebungen durch Nikotinsäureamid vorliegen. Erst so werden wir die
biologische Verbrennung in ihrer großartigen Einfachheit verstehen und sie ande-
ren klar machen können.
2. Wenn wir dem Ferro-Eisen den Preis als biologischen Reaktionspartner des
molekularen Sauerstoffs zuerkennen, so vergessen wir dabei doch nicht das sauer-
stoffübertragende Kupfer, das wir 1937 entdeckt haben, das aber als biologischer
Reaktionspartner des Sauerstoffs gegenüber dem Eisen zu vernachlässigen ist. —
Wir vergessen auch nicht die gelben Fermente, die in manchen Anaerobiern ohne
vorgeschaltetes Eisen vorkommen und dann direkt mit molekularem Sauerstoff
reagieren können. Aber diese Anaerobier — dereinst die Vorkämpfer im Kampf
gegen das sauerstoffübertragende Eisen — beteiligen sich per definitionem nicht
wesentlich an dem Sauerstoffverbrauch der lebenden Natur.
3. In dem ersten Pyridin-Proteid, das wir kristallisiert haben — in dem reduzie-
renden Gärungsferment der Hefe — fanden wir, daß das Protein das Nikotinsäure-
amid hydrieren kann, das heißt wahrscheinlich, daß die SH-Gruppen des Proteins
das Nikotinsäureamid hydrieren können. (Biochem. Z. 293, 351 [1937].) Aber die
Hydrierung des Nikotinsäureamids durch das Protein verläuft eine Million mal
langsamer als die Hydrierung des Nikotinsäureamids durch den Alkohol im Ver-
band des Proteins. Es ist also ausgeschlossen, daß die Hydrierung des Nikotin-
säureamids durch den Alkohol über die SH- oder irgendwelche andere Gruppen
des Proteins geschieht.
4. Es ist wahr, daß die zusammengefaßten Wirkungen der Sauerstoff- und wasser-
stoffübertragenden Fermente nicht der Zellatmung gleichgesetzt werden dürfen.
Denn zur Zellatmung gehören auch die Phosphorylierungen; die Spaltungen und
Kondensationen; der C4-Zyklus; die Reaktionen des Koferments A; kurz der ge-
samte intermediäre Stoffwechsel. Aber überall da, wo eine Oxydation oder Reduk-
tion zu vollziehen ist, erscheinen das Eisen oder das Nikotinsäureamid oder das
Alloxazin, die deshalb die Wirkungsgruppen nicht der Atmungsfermente, aber der
Oxydations- und Reduktionsfermente sind.
20 Über das Verhalten von Aszites-Tumorzellen zu Sauerstoff
von höheren Drucken*
Von Otto Warburg
Seit bekannt ist, daß Tumorzellen und fakultative Anaerobier in ihrem Stoffwech-
seltypus übereinstimmen, ist diskutiert und untersucht worden, wie sich Tumor-
zellen zu Sauerstoff verhalten. Offenbar sind für derartige Untersuchungen Aszites-
tumorzellen besonders geeignet, da man hier — anders als bei Versuchen mit
Gewebeschnitten — sicher ist, daß 02-Gleichgewicht zwischen Zellinnerem und
Umgebung herrscht. Von diesem Gesichtspunkt aus haben wir Versuche über den
Einfluß verschiedener Sauerstoffdrucke auf Aszitestumorzellen angestellt, über
deren Ergebnisse ich im folgenden berichte.
Versuchsanordnung
Zellen des Ehrlichschen Mäuseaszitestumors, dessen Stamm wir Herrn Dr. Georg
Klein, Stockholm, verdanken, wurden, wie früher beschrieben, unter Zusatz von
0,1 mg Heparin zu 1 cm3 entnommen und weitergeimpft. Der für die Versuche
verwendete Aszites war fünf- bis zehntägig und enthielt in 1 cm3 200—350 mm3
Zellen. Die Zwischenflüssigkeit, das „ Aszitesserum", enthielt nur sehr wenig Zucker,
dagegen reichlich Milchsäure, nämlich 1 bis 1,5 mg je Kubikzentimeter. Der Ge-
halt an Bikarbonat betrug etwa 350 mm3 Kohlensäure. Ist der Aszites mit Sauer-
stoff in Berührung, so verbrennen die Zellen die Milchsäure des Serums, wobei
der Bikarbonatgehalt um soviel Kubikmillimeter C02 zunimmt, als Kubikmilli-
meter Milchsäure verbrennen; denn die Zunahme an Bikarbonat fanden wir genau
gleich der Abnahme der nach Avery und Hastings bestimmten Milchsäure. Setzt
man Zucker zu dem Aszites, so entwickeln die Zellen, unter anaeroben Bedin-
gungen, 40 bis 60 mm3 Milchsäure je Milligramm und Stunde. Wegen dieser
starken Gärung muß der Aszites für die Gärungsmessungen auf das 50— lOOfache
verdünnt werden. Verdünnt man dabei mit Aszitesserum und schüttelt während
der Hauptzeit der manometrischen Messungen langsam und nur vor den Ablesun-
gen schnell, so kann die hohe Gärung viele Stunden konstant gehalten werden.
Zur Prüfung der Wirkung der Sauerstoffdrucke wurden einige Kubikzenti-
meter des verdünnten Aszites, der je Kubikzentimeter 0,1 mg Heparin enthielt, in
ein Manometriekästchen gegeben, immer ohne Zusatz von Zucker, da andernfalls
das Bikarbonat zu schnell verbraucht worden wäre. Das Kästchen wurde in einen
auf 38° geheizten Druckkasten gebracht und hier offen so langsam bewegt, daß
die Zellen nicht sedimentierten. In dem Druckkasten war der CO-2-Druck immer
l/20 Atm., während der Sauerstoffdruck von 1/5 bis auf 5 Atm. variiert wurde.
Nach 15—16 Stunden wurden die Kästchen aus dem Druckkasten herausge-
nommen. Zur Prüfung auf Virulenz wurde 0,2 cm3 des behandelten Aszites auf
* Aus Archiv für Geschwulstforschung VI (1953): 7.
Über das Verhalten von Aszites-Tumorzellen zu Sauerstoff von höheren Drucken 217
Mäuse verimpft; in einem anderen Teil wurde das Bikarbonat durch Ansäuern
mit Schwefelsäure manometrisch bestimmt; in einem anderen Teil wurde die
Milchsäure nach Avery und Hastings bestimmt; ein anderer Teil wurde auf das
50 — lOOfache mit Serum von nicht behandeltem Aszites verdünnt; in dem ver-
dünnten Aszites wurde nach Zusatz von Glukose die anaerobe Milchsäurebildung
manometrisch bestimmt.
Zur Virulenzprüfung ist zu bemerken, daß die Impfmenge 0,2 cm3 Aszites je
Maus immer in wenigen Tagen Aszites erzeugte, wenn der Aszites nicht vorbe-
handelt worden war. Spätestens in 10 Tagen mußten die Mäuse wegen Aszites
getötet werden. Erzeugten 0,2 cm3 des behandelten Materials nach 7 — 10 Tagen
keinen Aszites, so betrachteten wir die Virulenz als vernichtet, obwohl es möglich
ist, daß nach langen Zeiten doch noch Aszites aufgetreten wäre.
Ergebnisse
Sauerstoffdrucke bis zu 2 Atm., die bei 38° aufzuckerfreien, unverdünnten Aszites
16 Stunden einwirken, bringen weder die Virulenz noch den Gärungsstoffwechsel
zum Verschwinden.
Beträgt unter sonst gleichen Bedingungen der Sauerstoffdruck 5 Atm., so werden
Virulenz und Gärungsstoffwechsel vernichtet.
Der kritische Sauerstoffdruck scheint etwas unter 2,5 Atm. zu liegen. Im allge-
meinen haben wir bei 2,5 Atm. Sauerstoff starke Schädigung des Gärungsstoff-
wechsels und Vernichtung der Virulenz beobachtet.
Zum Beleg sind in dem folgenden Abschnitt einige Versuche mit experimentel-
len Einzelheiten mitgeteilt.
Versuchsbeispiele
Versuch vom 14. 2. 1952. Aszites enthielt 250 mm3 Zellen je Kubikzentimeter. 3 cm3 Aszites -
0,3 mg Heparin 16 Stunden bei 38° in 5 Vol.-",, COo-Luft, Gesamtdruck 1 Atm., bewegt.
hupftest: 2 Mäuse vorher mit 0,2 cm3 Aszites geimpft. Nach 6 Tagen beide wegen Aszites
getötet. — 5 Mäuse nachher mit 0,2 cm3 Aszites geimpft. Nach 7 Tagen alle wegen Aszites getötet.
Gärungsmessung: Der Aszites wurde nach der 16 stündigen Behandlung soweit mit Aszites-
serum verdünnt, daß 3,05 mm3 Zellen = 0,532 mg Trockensubstanz auf 1 cm3 kamen.
38°. Kästchen v = 4,603 cm3; ^!5lim = 0,450 mm2.
VF = 1 cm3 J-2mg Glukose mit 0,532 mg Zellsubstanz. Gasraum 5 Vol.0,', CO2 — N2.
60' + 50 mm = 22,5 mm3.
Ql* = -H2I = 42.
M 0,532
Der Versuch lehrt, daß die Virulenz vollständig und die Gärung zu 85",, er-
halten bleiben, wenn der unverdünnte Aszites 16 Stunden bei 38° bei : 5 Atm. O2,
1/-2o Atm. CO-:, bewegt wird.
218 Über das Verhalten von Aszites-Tumorzellen zu Sauerstoff von höheren Drucken
Versuch vom 4. 2. 1952. Aszites enthielt 230 mm3 Zellen/cm3 • 5 cm3 mit 0,5 mg Heparin
15 Stunden bei 38° bei ö2 Druck von 5 Atm. bewegt.
Impftest: 3 Mäuse vorher mit 0,2 cm3 Aszites geimpft. Nach 4 Tagen wegen Aszites ge-
tötet. 5 Mäuse nachher mit 0,2 cm3 Aszites geimpft. Nach 25 Tagen alle gesund.
Gärungsmessung: Der Aszites wurde nach der löstündigen Behandlung so weit mit Aszites-
serum verdünnt, daß 3,02 mm3 Zellen == 0,53 mg Trockensubstanz auf 1 cm3 kamen.
38°. Kästchen v = 4,603 cm3; ^™ == 0,450 mm2.
VF = 1 cm3 mit 0,53 mg Zelltrockensubstanz 2 mg Glukose. Gasraum 5 Vol.-%
C02 — N2.
60' I 2 mm = 0,90 mm3.
Der Versuch lehrt, daß 5 Atm. 02 die Virulenz und den Stoffwechsel der Aszites-
zellen zum Verschwinden bringt.
Versuch vom 19.2. 1952. Aszites enthielt 300 mm3 Zellen/cm3. 6 cm3 wurden mit 0,6 mg Heparin
16 Stunden bei 38° bei Oi-Druck von 2 Atm. bewegt.
Impftest: 5 Mäuse vorher mit 0,2 cm3 Aszites geimpft. Nach 7 Tagen alle wegen Aszites ge-
tötet.
5 Mäuse nachher mit 0,2 cm3 Aszites geimpft. Nach 8 Tagen alle wegen Aszites getötet.
Gärungsmessimg: Der Aszites wurde nach der 16stündigen Behandlung so weit mit Aszites-
serum verdünnt, daß 3,38 mm3 Zellen == 0,59 mg auf 1 cm3 kamen.
38". Kästchens == 4,603 cm3; k^um == 0,450 mm-.
VF == 1 cm3 mit 0,59 mg Zelltrockensubstanz • 2 mg Glukose.
Gasraum 5 Vol.-",, CO-2 — N2.
60' • 21,5 mm = 9,65 mm3 \ QXZ = W = 16 5
60' + 21,5 mm = 9,65 mm3 j ^M " 0,59
■1 n c
Gärungsrest ^—7- 100 = 41%.
40
Bikarbonat zunähme: 1 cm3 Aszites enthielt vor der Behandlung 358 mm3 Bikar-
bonat-Kohlensäure; nach der 16stündigen Behandlung 680 mm3 Bikarbonat-C02.
Zunahme also 322 mm3 in Bikarbonat gebundene CO2.
Milchsäurebestimmung nach Avery und Hastings, bei der die Milchsäure mit
Übermangansaure zu Essigsäure oxydiert und 1 Mol CO2 aus 1 Mol Milchsäure
entwickelt wird.
1 cm3 Aszites entwickelte mit Übermangansaure vor der Behandlung 359 mm3
CO> und nach der 16stündigen Behandlung 39 mm3 C02. Die Abnahme betrug
also 320 mm3 Milchsäure, in Übereinstimmung mit der Zunahme des Bikarbonats.
Der Versuch lehrt, daß ein 02-Druck von 2 Atm. in 16 Stunden bei 38° den
Gärungsstoffwechsel zwar wesentlich vermindert, aber die Virulenz nicht ver-
nichtet.
Versuch vom 22. 2. 1952. Aszites enthielt 350 mm3 Zellen/cm3 • 4 cm3 wurden mit 0,4 mg
Heparin 16 Stunden bei 38° bei 2,5 Atm. 02 bewegt.
Über das Verhalten von Aszites-Tumorzellen zu Sauerstoff von höheren Drucken 219
Impftest: 5 Mäuse nachher mit 0,2 cm3 Aszites geimpft. Nach 7 Tagen waren alle Tiere gesund.
Gärungsmessung: Der Aszites wurde nach der 16stündigen Behandlung so weit mit Aszitesserum
verdünnt, daß 3,12 mm:i Zellen == 0,546 mg Trockensubstanz auf 1 cm:! kamen.
38". Kästchen v = 4,603 cm:!; äJJ™1 = 0,450 mm2.
1 cm3 mit 3,12 mm3 Zellen == 0,546 mg Trockensubstanz 2 mg Glukose.
Gasraum 5 Vol.-% COo — N2.
60'
60'
120'
3 mm
2 mm
2,25
5 mm = 2,25 mm3. Q*2 =
M 2 • 0,546
2,1.
Gärungsrest
M
40
100 = 5,3",,.
Der Versuch lehrt, daß ein 02-Druck von 2,5 Atm. in 16 Stunden bei 38° den
Gärungsstoffwechsel fast vollständig und auch die Virulenz zum Verschwinden
bringt.
Schrifttum
Allgemeines Schrifttum über die Giftwirkung höherer O^-Drucke auf Tiere, Körperzellen und Fermente:
Bean, J. W., J. Physiology 72 (1931), 27.
Dickens, F., Biochemical J. 40 (1946), 145, 171.
Gesell, Amer. J. Physiology 66 (1923), 5.
Spezielles Schrifttum
Avery, B. F., und Hastings, A. Baird, J. Biolog. Chem.
94 (1931/32), 273.
Novy und Soule, J. Infect. Diseares 36 (1925), 92.
Stadie, C, und Mitarbeiter, J. Biolog. Chemistrv 160
(1945), 191, 209; 161 (1945), 153, 181; 164 (1946), 257.
Warburg, O., und Hiepler, E., Z. Naturforsch. 7 b
(1952), 193.
21 Isolierung der Hefezymohexase
und ihre Kristallisation als Quecksilbersalz*
Von Otto Warburg und Karlfried Gawehn
Anders als Muskelzymohexase ist Hefezymohexase nur im Verein mit gewissen
Schwermetallsalzen imstande, Hexosediphosphat zu Triosephosphat zu spalten1.
Zu den wirksamen Schwermetallen gehören z. B. Zink und 2wertiges Eisen, wäh-
rend 3wertiges Eisen unwirksam ist. Deshalb wird in einer Lösung, die Hefe-
zymohexase, autoxydables Eisensalz und Hexosediphosphat enthält, je nachdem
die Bedingungen anaerob oder aerob sind, der phosphorylierte Zucker gespalten
oder nicht gespalten. Mit Hefezymohexase und Eisen läßt sich also in reinen Lö-
sungen ein Pasteur-Effekt hervorrufen.
Abb. 1. Quecksilbersalz der Hefezymohexase aus Ammonsulfat. Phasenkontrast.
1400fache Vergrößerung.
Offenbar wäre es für die Zellphysiologie von großer Bedeutung, das Zusammen-
wirken von Metallsalzen und Hefezymohexase zu erforschen und zu ergründen,
warum die aus tierischen Zellen isolierte Zymohexase keiner Schwermetalle zu
ihrer Wirkung bedarf; und wahrscheinlich führt der Weg zur Lösung dieser
Probleme über die Isolierung der Hefezymohexase, die uns 1943, als wir die Mus-
kelzymohexase kristallisierten, nicht gelang.
Wir beschreiben in dieser Arbeit eine sehr einfache Methode zur Isolierung der
Hefezymohexase und ihre Kristallisation als Quecksilbersalz. Wir befreien dabei
die Hefezymohexase durch Äthylendiamintetraessigsäure von anderen Schwerme-
* Aus Zeitschrift für Naturforschung Bd. 9 b, 206, 1954.
Isolierung der Hefezymohexase und ihre Kristallisation als Quecksilbersalz 221
tallsalzen und geben erst dann das Quecksilbersalz hinzu. Wie das Quecksilber aus
den kristallisierten Quecksilbersalzen der Enolase- und der reduzierenden Gä-
rungsfermente3, so kann auch das Quecksilber aus dem Hg-Salz der Hefezymo-
hexase durch Cystein sehr schnell entfernt und dann durch andere aktivierende
Metallsalze, wie Zinksulfat, ersetzt werden. Dieser Austausch von Quecksilber
gegen Zink geht in der Testlösung — die Cystein als Komponente enthält — so
schnell, daß man im Test keinen Unterschied in 1 In -y- pro Minute findet, ob
man die Hefezymohexase als Quecksilbersalz oder als freies Ferment zusetzt.
Schließlich heben wir noch hervor, daß die durch Zinksulfat aktivierte Hefe-
zymohexase nahezu die gleiche katalytische Wirkung besitzt wie die ohne Metalle
wirkende Muskelzymohexase, wenn von beiden Zymohexasen die reinen Fermente
geprüft werden.
Messung der Wirkung des Ferments
Die Wirkung der Hefezymohexase wurde mit der optischen Methode gemessen,
nach der Vorschrift von 19421:
0,5 cm3 w/10-K-Hexosediphosphat pH 7,4,
0,3 cm3 Glykokoll 20 mg cm3,
0,6 cm3 m 10-Cysteinchlorhydrat,
0,6 cm3 n 10-NaOH,
0,1 cm3 ZnS04 1,74 10 - molar,
0,1 cm3 Pyridinnucleotid 6 mg cm3,
0,3 cm3 Na-Arseniat 5,4proz.,
2,35 cm3 Wasser,
0,1 cm3 Oxydierendes Gärungs-Ferment 4,35 mg, cm3 und zur Zeit Null etwa 0,(
prüfenden Zymohexase-Lösung.
Wie schon 1948 hervorgehoben wurde4, reagiert Cystein, das eine Komponente
der Testlösung ist, mit Triosephosphat unter Bildung von Thiolverbindungen.
Beim optischen Zymohexasetest muß deshalb das oxydierende Ferment zuerst zu-
gesetzt werden, und erst dann darf die Spaltung des Hexosediphosphats durch Zu-
satz der Zymohexase in Gang gebracht werden. Dann nämlich hat das Triosephos-
phat keine Zeit, von dem Cystein abgefangen zu werden, sondern reagiert in statu
nascendi mit dem Nicotinsäureamid des Pyridinnucleotids.
Das Maß der Zymohexase ist die Zunahme des natürlichen Logarithmus der
Lichtschwächung für die Wellenlänge 340 m/>, für die Schfchtdicke 1 cm, für die
Proteinkonzentration c = 1 mg/cm3 pro Minute bei 20° :
A In in I i.
W = .
c - Min.
Für die kristallisierte Muskelzymohexase fanden wir früher1 W — 200. Für
die durch Zinksulfat aktivierte Hefezymohexase finden wir W ■■ 200—240.
Auch die Konzentration des Ferment-Proteins wurde optisch bestimmt, indem
zunächst, nach der Vorschrift von 19432, das Verhältnis der Lichtabsorptions-
Koeffizienten bei 280 m// und 260 mu gemessen wurde,
0280
" = ~~ß '
P260
222 Isolierung der Hefezymohexase und ihre Kristallisation als Quecksilbersalz
Dann wurde der zu n gehörende Wert von />28o aus der Tabelle entnommen und
die Proteinkonzentration c mit Hilfe der Gleichung
(In /o/O = ß280 ' c • d
berechnet.
Aceton-Trockenpulver
3 kg Trockenhefe aus Unterhefe werden mit 9 / auf 38° erwärmter ra/15-Na2-
HPO_i-Lösung verrührt und 2 Stdn. bei 38° digeriert. Dann wird 1 Stde. zentri-
fugiert. Das Volumen des überstehenden Lebedewsaftes beträgt 3600 cm3.
Der Lebedewsaft wird auf 0° abgekühlt und zunächst mit 1520 cm3 kaltem Ace-
ton gefällt, wobei ein Niederschlag entsteht, der abzentrifugiert und verworfen
wird. Die überstehende Lösung wird mit 750 cm3 kaltem Aceton weiter gefällt.
Der Niederschlag, der das Ferment enthält, wird abzentrifugiert und im Vakuum
bei 0° über Blaugel getrocknet. Auswaage: 103 g. Das trockene Pulver ist haltbar.
Protaminfällung, Erhitzen
40 g Acetontrockenpulver werden mit 800 cm3 kaltem Wasser verrieben. Ohne zu
zentrifugieren werden 1200 mg Salmiridinsulfat, gelöst in 60 cm3 Wasser, zuge-
geben. Dann wird zentrifugiert und das Sediment verworfen. Die überstehende
Lösung, deren Volumen 800 cm3 beträgt, wird mit festem Ammonsulfat auf 0,4
Sättigung gebracht und dann 10 Min. auf 65° erhitzt. Nach Abkühlung auf Zim-
mertemperatur wird zentrifugiert und das Sediment verworfen. Die überstehende
Flüssigkeit, deren Volumen 800 cm3 beträgt, wird mit festem Ammonsulfat auf
0,75 Sättigung gebracht; der Niederschlag, der das Ferment enthält, wird abzen-
trifugiert und kann unter Ammonsulfat aufbewahrt werden.
Adsorption an Al(OH)3
Der Ammonsulfat-Niederschlag aus 80 g Aceton-Trockenpulver wird in 100 cm3
«/IOO-NH3 bei 0°C gelöst. Wenig Ungelöstes wird bei 0° in der Spinco-Zentri-
fuge bei 40000 g abzentrifugiert und verworfen. Die überstehende Lösung, deren
Volumen 200 cm3 beträgt, wird mit kaltem Wasser auf 2000 cm3 verdünnt und
mit 250 cm3 30volumproz. Al(OH)3 versetzt. Das Al(OH)3, das 90% des Ferments
adsorbiert, wird abzentrifugiert und 2mal mit je 2000 cm3 kaltem Wasser in der
Reibschale verrührt, wobei das Ferment adsorbiert bleibt. Dann wird zentrifugiert
und das Ferment von dem Al(OH)3 eluiert, indem man 3mal mit je 240 cm3 kalter
0,3gesättigter Ammonsulfatlösung, die in bezug auf NH3 w/100 ist, verrührt und
zentrifugiert. Die Eluate sind nicht gleichwertig. Z, B. war für das erste Eluat die
Wirkung W =140, für das zweite Eluat W - 185 und für das dritte Eluat
W - 200. Man verwirft in diesem Fall das erste Eluat, vereinigt das zweite und
dritte, fällt mit festem Ammonsulfat bis zum Sättigungsgrad 0,77 und zentrifu-
giert den Niederschlag, der das Ferment enthält, auf der Spinco-Zentrifuge.
Isolierung der Hefezymohexase und ihre Kristallisation als Quecksilbersalz 223
Man kann Adsorption an Al(OH)3 und Elution wiederholen, doch steigt dabei
im allgemeinen die Wirksamkeit W des Ferments nicht mehr wesentlich.
Unter 0,77 gesättigtem Ammonsulfat bei 0° aufbewahrt, ist das Ferment haltbar.
Kristallisation als Hg- Salz (alle Ammonsulfatlösungen sind in bezug auf NH3
w/100)
100 mg Hefezymohexase werden aus dem 0,77 gesättigten Ammonsulfat abzen-
trifugiert. Auf den voluminösen Niederschlag gibt man bei 0° tropfenweise eine
mit Ammoniak neutralisierte ra/10-Lösung von Äthylendiamintetraessigsäure, bis
der Niederschlag gelöst ist. Man fällt aus dieser Lösung, die etwa 0,4 gesättigt be-
züglich Ammonsulfat ist, durch Zusatz von gesättigter Ammonsulfatlösung das
Ferment aus, zentrifugiert es hochtourig ab und wäscht den Niederschlag mit
0,77 gesättigter Ammonsulfatlösung, die in bezug auf Äthylendiamintetraessig-
säure m/500 ist. Der Niederschlag wird in möglichst wenig «/IOO-NH3 bei 0°
gelöst, 1 mg mit NH3 neutralisierte Äthylendiamintetraessigsäure werden auf
1 cm3 zugegeben. Dann gibt man bei 0° gesättigtes Ammonsulfat tropfenweise bis
zur Trübung zu und läßt die Lösung im nicht evakuierten Exsiccator langsam 20°
warm werden, wobei das Ferment ausfällt.
Der Fermentniederschlag, der nunmehr spezifisch so schwer ist, daß er von selbst
sedimentiert, wird abzentrifugiert und bei 0° tropfenweise mit n TOO-NH3 bis zur
Lösung versetzt. Dann gibt man zu 1 cm3 etwa 0,1 cm3 einer Quecksilbersalz-
lösung, die in ^gesättigtem Ammonsulfat, das in bezug auf NH3 w/10 ist, 3 mg
HgSÜ4 pro cm3 enthält, und weiterhin gesättigtes Ammonsulfat bis zur schwachen
Trübung bei 0°. Läßt man dann die Flüssigkeit im nicht evakuierten Exsiccator
sich langsam auf Zimmertemperatur erwärmen, so scheidet sich das Hg-Salz der
Hefezymohexase in regelmäßigen Kristallen ab, die aus Abb. 1 ersichtlich sind.
Die Prüfung des Quecksilbersalzes im optischen Test ergab : 0,00146 mg Protein
pro cm3 erzeugten in 1 Min. bei 20°, bei 1 cm Schichtdicke, ein zlln io/i = 0,290,
als0 J In 1'0/i 0,290
W = — = =199
c-Min. " 0,00146- 1
Man beachte, daß man das Quecksilber zur Wirkungsprüfung nicht zu entfer-
nen braucht, da die Testlösung Cystein enthält.
Literatur
1 W.arburg, O., und Christian, W., Biochem. Z. 314 3 Kubowitz, F., und Ott, P.. Biochem. Z. 314 (1943), 94.
(1943), 149. Warburg, O., Wasserstoffübertragende 4 Wasserstoffübertragende Fermente, S. 39.
Fermente, Berlin 1948. 5 Wasserstoffübertragende Fermente, S. 49.
2 Warburg, O., und Christian, W., Biochem. Z. 310
(1941), 384.
22 Über das Verhalten von Ascites-Krebszellen zu Zymohexase1
Von Otto Warburg, Karlfried Gawehn und Günter Lange
Nicht gärende Ascites-Zellen geben Zymohexase an das umgebende Ascites-Serum ab. Gärende
Ascites-Zellen nehmen Zymohexase aus dem umgebenden Ascites-Serum heraus oder zerstören
die Zymohexase in ihrer Umgebung.
1943 wurde gefunden1, daß das Blutserum von Tieren und Menschen Gärungs-
fermente enthält; daß das Gärungsferment Zymohexase sowie einige andere
Gärungsfermente in dem Blutserum von Tumor-Ratten vermehrt sind, und daß
diese Vermehrung, wenn die Tumoren groß sind, z. B. das lOfache des Normal-
werts betragen kann. Virulente Tumoren vermehrten die Zymohexase im Serum
mehr als nekrotisierende Tumoren.
Diese Ergebnisse wurden durch eine Arbeit aus dem Institut von Charles
Huggins erweitert. Sibley und Lehninger2 verfolgten die Zunahme der Zymo-
hexase im zeitlichen Verlauf des Tumorwachstums und fanden schnelle Rückkehr
zum Normalwert nach Exstirpation der Tumoren. Wurde das Wachstum der
Tumoren durch Äthylurethan gehemmt, so ging eine vorher gefundene Zunahme
des Ferments auf den Normalwert zurück.
In einer zweiten Arbeit aus dem Institut von Huggins fanden Baker und
Dovan3, daß bei fortgeschrittenem menschlichen Prostata-Carcinom die Zymo-
hexase im Blutserum im allgemeinen stark vermehrt ist, daß die Zymohexase bei
Hoden-Exstirpation oder bei Östrogenbehandlung im Serum wieder abnimmt,
und daß die Zymohexase im Blut bei Testosterongabe wieder ansteigt.
Aus alledem wird man den Schluß ziehen, daß es die Virulenz der Tumorzellen
ist, die für die Vermehrung der Zymohexase im Blut maßgebend ist.
Zymohexase im Blut gravider Tiere
In den drei zitierten Arbeiten wurde übereinstimmend festgestellt, daß die Zymo-
hexase in dem Blut von graviden Tieren oder Menschen, in keinem Stadium der
Gravidität, vermehrt ist. Wie die Gärung der Tumoren ist also auch die Zunahme
der Zymohexase im Blut eine Erscheinung, durch die sich im lebenden Tier das
Tumorwachstum von dem normalen Wachstum unterscheidet. Nicht Embryonen,
aber Tumoren entwickeln im lebenden Tier, bei Sättigung mit Sauerstoff, Milch-
säure. Nicht Embryonen, aber Tumoren erhöhen im Blut lebender Tiere den Ge-
halt an Gärungsfermenten.
Ascites-Tumor-Zellen
Zellen des Ehrlichschen Mäuse-Ascites-Tumors sind von Lettre4 für biochemische
Versuche benutzt und empfohlen worden. Tatsächlich eignen sie sich hervor-
* Aus Zeitschrift für Naturforschung Bd. 9b 109. 1954.
Über das Verhalten von Aswites-Krebszellen zu Zymohexase 225
ragend für quantitative Versuche. Resistent beim Zentrifugieren und beim Schüt-
teln in Manometergefäßen, sind sie histologisch reiner als Tumorgewebe. Sie sind
das erste Material, mit dem der Stoffwechsel der Tumorzellen quantitativ be-
stimmt werden konnte, und sie liefern, wie es sein muß, wesentlich höhere Q-
Werte als die früher untersuchten Tumorgewebe (die alle Mischgewebe waren) —
nämlich anaerob etwa 50 und aerob etwa 30 — für in Ascites-Serum suspendierte
Zellen.* Hält man bei derartigen Versuchen, die wegen der großen Gärung der
Ascites-Zellen mit sehr verdünntem Ascites ausgeführt werden müssen, Kohlen-
säuredruck, Bicarbonat und Zucker konstant, so sinkt der Stoffwechsel im Ver-
lauf von stundenlangen manometrischen Versuchen nur wenig ab.
Bei Versuchen mit diesen Zellen wurde früher, in einer Arbeit mit Hiepler5,
gefunden, daß sie Zymohexase an das umgebende Ascites-Serum abgeben, wenn
sie bei 38° ohne Zusatz von Zucker, gehalten werden. Es wurde ferner gefunden,
daß die Abgabe von Zymohexase anaerob wesentlich größer ist als aerob, Ergebnisse,
die in einer interessanten Arbeit von Schade6 erweitert worden sind.
Im folgenden berichten wir über Versuche, bei denen Zucker zu den Ascites-
Zellen zugesetzt wurde, bei denen also das Verhalten von Zymohexase zu gärenden
Ascites-Zellen untersucht wurde. Den Impftumor verdanken wir Dr. Georg
Klein, Stockholm.
Entwicklung der Versuchstechnik
Unverdünnter Ascites gärt so stark, daß bei 38° nach einigen Minuten Zucker und
Bicarbonat verbraucht sind. In unseren früheren Versuchen über die Abgabe der
Zymohexase, in denen der Ascites unverdünnt war, konnte deshalb nicht bei
Gegenwart von Zucker gearbeitet werden. Verdünnt man andererseits den Ascites
zu sehr, so kann man keine wesentlichen Effekte erwarten, da die Fermentabgabe
in einem stöchiometrischen Verhältnis zur Zellmenge steht. Wir wählten unter
diesen Umständen einen Mittelweg und verdünnten den Ascites nicht, wie bei den
Messungen der Gärung, auf das lOOfache, sondern nur auf etwa das 8fache.
Zucker und Bicarbonat wurden dann unter manometrischer Kontrolle ihres Ver-
brauchs halb- oder ganzstündlich ersetzt, und zu große Verschiebungen des pH
nach der sauren Seite wurden vermieden. So konnte das Verhalten der Krebszellen
zu Zymohexase auch bei Gegenwart von Zucker, während der Gärung, untersucht
werden.
Eine zweite Schwierigkeit betraf die Gerinnungshemmung. Ersatz des Serums
durch Ringerlösung oder durch eine andere Salzlösung kam nicht in Frage.
Andererseits zeigte sich, daß alle gerinnungshemmenden Mittel, auch Heparin,
die Effekte verminderten. Folgendes Verfahren bewährte sich unter diesen Um-
ständen: Wir entnahmen den Ascites unter Zusatz einer sehr kleinen Menge
Heparin, zentrifugierten und verwarfen das überstehende Serum, das die Haupt-
menge des Heparins enthielt. Zur Resuspension der Zellen diente dann ein anderes
Ascites-Serum, das ohne Heparin entnommen, nach der Entnahme sofort zentri-
fugiert, dann 10 Minuten auf 57° erhitzt und schließlich klar zentrifugiert werden
* Zusatz 1961. Vergleiche aber Beitrag Nr. 17 dieses Buchs.
15 Warburg, Zellphysiologie
226 Über das Verhalten von Ascites-Krebszellen zu Zymohexase
war. Unsere Suspensionsflüssigkeit war also „inaktiviertes", ohne gerinnungs-
hemmende Mittel entnommenes Ascites-Serum. Es enthielt keine Zymohexase,
da es auf 57° erhitzt worden war, und es enthielt nur sehr wenig Zucker, da in der
Zeit zwischen Entnahme und Zentrifugieren fast der gesamte Zucker des Ascites-
Serums verbraucht worden war. Dagegen enthielt es viel Milchsäure, im Mittel
1 mg pro cm3.
Zusatz von Zymohexase
Bei anaeroben Versuchen ohne Zucker, bei denen Zymohexase nie von den Krebs-
zellen aufgenommen, sondern immer nur abgegeben wurde, war es nicht nötig,
dem inaktivierten Ascites-Serum Zymohexase zuzusetzen. Bei allen anderen Ver-
suchen jedoch mußte Zymohexase zugesetzt werden. Dies geschah in Form von
Muskelsaft. Frische Muskeln wurden mit der 3fachen Menge Wasser und mit
Sand zerrieben; der Saft wurde bei 12000 g klar zentrifugiert und dem inaktivierten
Ascites-Serum in solchen Mengen zugesetzt, daß 1 ccm 3 y Zymohexase enthielt,
eine Zymohexasemenge, die in etwa 0,005 ccm Muskelsaft enthalten ist. Die anderen
Fermente und Kofermente, die bei diesem Verfahren dem Ascites-Serum gleich-
zeitig mit der Zymohexase zugesetzt wurden, störten wegen der Spezifität des
Zymohexasetestes nicht. Durch Kontrollen überzeugten wir uns, daß die Zymo-
hexase in zellfreiem Ascites-Serum, nach Zusatz des Muskelsaftes, nicht wesent-
lich abnimmt, woran man mit Hinblick auf verdauende Fermente hätte denken
können (vgl. Tab. 2).
Bestimmung der Zymohexase
Die Zymohexase wurde optisch bestimmt7, nach Zusatz von Hexosediphosphat,
DPN, oxydierendem Gärungsferment und Arseniat eine Methode, die inzwi-
schen sehr allgemein angewandt worden ist. Dabei ist die optische Wirkung W*
definiert als die Zunahme des Logarithmus der Lichtschwächung bei der Wellen-
länge 340 m/i pro Stunde auf dem Lichtweg d für unverdünntes Serum, bei 38°.
1 In —
W*
Stunden • d ■ v
wo d der Lichtweg in cm ist und v das Serumvolumen pro cm3 Testlösung.
Enthält 1 cm3 Serum 1 y Zymohexase, so ist bei pH 7,4 und 38° W* = 47. Man
erhält also die Konzentration der Zymohexase in y pro cm3, wenn man W* durch
47 dividiert. c = n7*/47.
Da bei den optischen Messungen zu große Ausschläge nicht erwünscht sind, so
mußte das Serum für den Test sehr erheblich, z. B. auf das 50— lOOfache, verdünnt
werden, und auch dann genügten noch Ablesungszeiten von 5 Minuten. Durch die
Verdünnung wurde die Genauigkeit nicht beeinträchtigt, da es ja immer nur auf
die prozentische Änderung der lln to/i- Werte ankam.
Zwei Modifikationen der früheren Vorschriften wurden vorgenommen. Erstens
wurde die Lichtschwächung nicht bei der Wellenlänge 340 mu, sondern bei
Über das Verhalten von Ascites-Krebszellen zu Zymohexase 227
366 m// gemessen, weil 366 m/u leicht aus der Quecksilberlampe zu isolieren ist.
Akuo/i für 366 m// wurde dann durch Multiplikation mit dem Faktor 1,95 auf
340 mit umgerechnet.
Zweitens wurde in der Testlösung das Glykokoll durch Thioharnstoff ersetzt.
Die Testlösung hatte dann die Zusammensetzung :
3,70 cm3 Wasser,
0,5 cm3 8-proz. Thioharnstofflösung,
0,25 cm3 DPN-Lösung (6 mg/cm3),
0,1 cm3 Lösung des oxydierenden Ferments (4,35 mg/cm3),
0,2 cm3 5,4-proz. Na-Arseniat,
0,05 cm3 Ascites-Serum,
bei t0: 0,2 cm3 m/10-hexosediphosphorsaures K, pH 7,4.
Summe: 5,0 cm3.
Sibley und Lehninger- haben auf die Möglichkeit hingewiesen, daß bei op-
tischen Testen Organextrakte das DPN so schnell zerstören, daß keine Licht-
schwächung in den Testen entsteht, auch wenn Zymohexase vorhanden ist. Ins-
besondere für Leberextrakte solle dieser Einwand ernstlich in Betracht kommen.
In Serum haben wir nie DPN-Zerstörung beobachtet. Auch der Muskelsaft,
der im Ascites-Serum auf das 14000fache verdünnt ist, zerstört DPN nicht
merklich. Zur Sicherheit aber prüfe man jedes neue System auf DPN-Zer-
störung, indem man gleiche Mengen kristallisierter Zymohexase zu der Test-
lösung mit und ohne Organsaft zusetzt. Dann muß man in beiden Fällen gleiche
Endwerte der Lichtschwächung erhalten.
Versuchsanordnung
Zu inaktiviertem Ascites-Serum wurde so viel an Zellen und Substanzen zu-
gegeben, daß nach den Zusätzen 1 cm3 enthielt:
35 mm3 Ascites-Zellen,
3 mg Glucose,
3 /Muskelzymohexase,
500 mm3 in Bicarbonat gebundene Kohlensäure (wobei der Bicar-
bonatgehalt des inaktivierten Ascites-Serums vorher manome-
trisch bestimmt werden mußte).
Die Gesamtmenge der Mischung betrug im allgemeinen 5 cm3. 1 cm3 davon
wurde zentrifugiert, das abgehobene Serum diente zur Bestimmung der Zymo-
hexase zur Zeit Null und wurde zunächst im Eisschrank aufbewahrt. 3 cm3 wur-
den in den Hauptraum eines kegelförmigen Manometrie-Gefäßes gegeben (Vo-
lumen etwa 17 cm3), dessen Gasraum 5 Vol.-Proz. C02 in 02 oder N> oder Argon
enthielt. Nachdem das Gefäß 2 Stunden bei 38° bewegt worden war, wurde 1 cm3
entnommen, zentrifugiert und das überstehende Serum bei 0° aufbewahrt. Der
Rest wurde nach Maßgabe des manometrisch beobachteten Verbrauchs mit Zucker
und Bicarbonat versetzt und weiter bei 38° bewegt. Nach weiteren 2 Stunden
wurde wieder 1 cm3 entnommen, zentrifugiert und das überstehende Serum ab-
gehoben. Schließlich wurde in den 3 Serumproben — der Zeit Null und den Zeiten
2 und 4 Stunden — die Zymohexase nach geeigneter Verdünnung mit der optischen
Methode bestimmt.
+
mit
Zellen
Glucose
+ = mit
ohne
Gasgemisch
5% CO, in
Optischer Test
Änderung der
Zymohexase im
Äscites-Serum
in"„ des
Anfangswertes
Änderung der
Zymohexase im
Nr.
V
nach Stdn.
Inkubation
1 In i0 i
W*
Ascites-Serum
in j'/cra1
1
+
+
N2
0,02
0
2
4
0,228
0,198
0,170
137
119
102
— 25,6
— 0,75
2
+
+
Ar
0,01
0
2
4
0,141
0,1335
0,119
169
160
143
— 15,4
— 0,55
3
+
+
Ar
0,01
0
2
4
0,090
0,078
0,066
107,5
93,5
79
— 26,5
— 0,6
4
+
+
Ar
0,01
0
2
4
0,0975
0,0825
0,0765
117
99
92
— 21,4
— 0,53
5
I
+
o2
0,01
0
2
4
0,141
0,1285
0,121
169
154
145
— 14,2
— 0,51
6
+
+
o2
0,01
0
2
4
0,1085
0,0965
0,090
130
115,5
108
— 16,9
— 0,47
7
+
+
o2
0,01
0
2
4
0,0935
0,0875
0,079
112
105
95
— 15,2
— 0,36
8
+
+
o2
0,01
0
2
4
0,0895
0,075
0,0675
107,5
90
81
— 24,6
— 0,57
9
+
+
Luft
0,01
0
2
4
0,116
0,109
0,101
139
131
121
— 13
— 0,38
10
+
+
Luft
0,01
0
2
4
0,0975
0,0860
0,0787
117
103
94,5
— 19,2
— 0,48
11
+
—
Ar
0,01
0,004
0,002
0
2
4
0,1115
0,0687
0,0610
134
206
366
+ 173
+ 4,93
12
+
—
Ar
0,01
0,01
0,004
0
2
4
0,1045
0,140
0,084
125,5
168
252
+ 101
+ 2,7
13
+
—
o2
0,01
0
2
4
0,097
0,106
0,1135
116
127
136
17,2
+ 0,425
14
+
—
o2
0,01
0
2
4
0,0965
0,1025
0,1025
116,5
123
123
5,6
+ 0,138
15
+
—
o2
0,01
0
2
4
0,1045
0,1085
0,1085
125,5
130
130
3,6
+ 0,096
16
+
—
Luft
0,01
0
2
4
0,0965
0,1135
0,1135
116,5
136
136
16,7
+ 0,415
17
+
—
Luft
0,01
0
2
4
0,104
0,113
0,116
124,5
135,5
139
11,7
+ 0,31
Tabelle 1. Verhalten der Zymohexase in Ascites-Serum mit 35 mm3 Zellen pro cm3.
Ascites-Serum in 1 cm3 Testlösung. I In io/i = Zunahme des Logarithmus in
d = 1 cm, für /. = 340 m/t bei 38" C.
v = cm-5
5 Min. für
Zellen
+ mit
— ohne
Glucose
+ mit
— ohne
Gasgemisch
5% CO, in
Optischer Test
Änderung der
Zymohexase im
Ascites-Serum
in % des
Anfangswertes
Änderung der
Zymohexase im
Nr.
V
nach Stdn.
Inkubation
J In /0/i
w*
Ascites-Serum
in y cm'
1
+
+
+
Ar
Ar
0,01
0,01
0
2
4
0
2
4
0,0935
0,0815
0,0760
0,0935
0,0935
0,0900
112
98
91
112
112
108
18,8
3,6
-0,45
- 0,085
2
+
+
+
Ar
Ar
0,004
0,004
0
2
4
0
4
0,130
0,123
0,116
0,130
0,1265
390
368
348
390
380
— 10,8
2,6
—0,9
0,21
3
+
+
1
Ar
Ar
0,01
0,01
0
2
4
0
4
0,0970
0,0935
0,0890
0,0970
0,0970
116,5
112
107
116,5
116,5
8,2
o
0,2
±0
4
+
+
+
Ar
Ar
0,01
0,01
0
2
4
0
2
4
0,0965
0,0890
0,0835
0,0965
0,0950
0,0935
116
107
100
116
114
112
13,8
3,5
0,34
-0,085
5
+
+
+
Ar
Ar
0,01
0,01
0
2
0
2
0,075
0,064
0,075
0,075
90
77
90
90
14,5
± o
-0,277
6
+
+
+
Ar
Ar
0,01
0,01
0
2
0
2
0,1235
0,1080
0,1205
0,116
148
130
146
139,5
— 12,2
4,45
-0,384
0,138
7
+
+
+
Ar
Ar
0,01
0,01
0
2
4
0
2
4
0,101
0,096
0,096
0,101
0,101
0,1025
121
115
115
121
121
123
5
1,65
-0,128
+ 0,043
8
+
+
+
Ar
Ar
0,01
0,01
0
z.
4
0
4
0,112
0,106
0,0935
0,108
0,108
134
127
112
130
130
16,5
o
0,4Y
±0
Tab. 2. Verhalten der Zymohexase in Ascites-Serum ohne Zellen und mit 35 mm3 Zellen pro cm3.
v = cm3 Ascites-Serum in 1 cm3 Testlösung. 1 In z'n/z = Zunahme des Logarithmus in 5 Min., für
d = 1 cm, für /. = 340 m/< bei 38° C.
230 Über das Verhalten von Ascites-Krebszellen zu Zymohexase
Zur Zymohexase-Bestimmung in den Zellen wurden 105 mm3 Ascites-Zellen
3mal mit je 1,5 ccm Wasser extrahiert. In den vereinigten Extrakten wurde die
Zymohexase optisch bestimmt.
Wir fanden im Mittel 7 y Zymohexase in 35 mm3 Zellen.
Ergebnisse
Die Zellmenge pro ccm betrug bei allen Versuchen 35 cmm. Der Gehalt an Zymo-
hexase in diesen 35 cmm betug im Mittel 7 y.
Anaerob, bei Abwesenheit von Zucker, gaben 35 cmm Zellen in 4 Stunden bei
38° an das umgebende Serum im Mittel 3,8 y Zymohexase ab, das ist etwa die
Hälfte ihres Zymohexase-Gehalts.
Aerob, bei Abwesenheit von Zucker, gaben 35 cmm Zellen unter sonst gleichen
Bedingungen weniger Zymohexase ab.
Bei Gegenwart von Zucker, gleichgültig ob die Bedingungen aerob oder anaerob
waren, gaben die Zellen keine Zymohexase an die Umgebung ab, sondern nahmen
umgekehrt Zymohexase aus ihrer Umgebung heraus. 35 cmm Krebszellen nahmen
im Mittel in 4 Stunden 0,5 y Zymohexase heraus, das ist eine im Vergleich zum
Zymohexase-Gehalt der Zellen nicht unbeträchtliche Menge.
Das Ergebnis ist also, daß gärende Krebszellen den Zymohexase-Gehalt ihrer
Umgebung vermindern, während nicht-gärende Zellen den Zymohexase-Gehalt
ihrer Umgebung vermehren.
Über den Verbleib des von den gärenden Zellen aus ihrer Umgebung heraus-
genommenen Ferments können wir keine Angaben machen. Wir wissen nicht, ob
es von den Zellen zerstört wird, oder ob es in die Zellen als funktionierendes Fer-
ment eingebaut wird. Die Bestimmungen der Zymohexase der Zellen durch Extrak-
tion ist zu ungenau, als daß man die Zunahmen messen könnte.
In den Tabellen 1 und 2 sind die experimentellen Daten und die daraus be-
rechneten Ergebnisse für 25 Versuche wiedergegeben.
Literatur
1 Warburg, O., und Christian, W., Biochem. Z. 314 5 Warburg, O., und Hiepler, Ernst, Z. Naturforschg.
(1943), 399. 7b (1952), 193.
2 Sibley, J. A., und Lehninger, A. L., J. nat. Cancer 6 Schade, A. L., Biochim. biophysica Acta (Amsterdam)
Inst. 9 (1949), 303. 12 (1953), 163.
3 Baker, R., und Govan, D., Cancer Res. 13 (1953), 141. 7 Warburg, O., und Christian, W., Biochem. Z. 314
4 Lettre, H., Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 268 (1943), 149, 399 sowie Warburg, O., Wasserstoffüber-
(1941), 59; Z. Krebsforschg. 57 (1950), 1; Naturwissen- tragende Fermente, Berlin 1948.
Schäften 38 (1951), 490.
23 Über die Oxydationsreaktion der Gärung*
Von Otto Warburg, Helmut Klotzsch und Karlfried Gawehn
In wässerigen Phosphatlösungen, bei neutraler Reaktion, ohne Protein, oxydiert Pyridinnucleotid
Glycerinaldehyd.
I.
1925 fanden wir1, daß Glycerinaldehyd, der in neutraler wässeriger Lösung nicht
wesentlich autoxydabel ist, bei Zusatz von Phosphat durch molekularen Sauerstoff
zu Glykolsäure oxydiert wird. Meyerhof und Lohmann2 fügten 1934 die Beob-
achtung hinzu, daß sich der phosphorylierte Glycerinaldehyd (FiscHER-Ester) ent-
sprechend verhält. Da Glycerin unter dem Einfluß von Phosphat nicht autoxy-
dabel wird, so kann die Ursache der Aktivierung des Aldehyds kaum eine andere
sein, als daß primär die Aldehydgruppe mit dem Phosphat reagiert :
R CHO - H3P04r RC— OH
\0P03Hj
Die Aktivierung des Aldehyds durch Phosphat kann man nicht nur mit mole-
kularem Sauerstoff, sondern auch mit andern Oxydationsmitteln nachweisen, z. B.
mit Jod, das in neutralen Phosphatlösungen mit Glycerinaldehyd schneller reagiert
als bei gleichem pH in andern Lösungen. Am bemerkenswertesten aber, im Hin-
blick auf die Oxydationsreaktion der Gärung, ist das Verhalten des Glycerin-
aldehyds in Phosphatlösungen gegen Pyridinnucleotid.
OH
mk/
mh;
/ ;
s
f
<■■■■- i
f TT '
I
Abb. 1. Die Phosphatlösungen, deren pH
7,7 war, enthielten kein Protein, aber pro
cm3 1 mg Diphospho-Pyridinnucleotid und
3 mg Glycerinaldehyd. Sie wurden unter
Luftabschluß in Quarzküvetten (Schicht-
dicken 1 cm) eingefüllt und bei 38° gehalten.
Die Lichtabsorption der Lösungen in diesen
Küvetten wurde für die Wellenlänge 340 m//
gemessen.
0,3
~<0,2
'S
?0,1
10 20 30 HO . 50 60
min — »-
Abb. 2. Die Phosphatlösungen, deren pH
7,7 war, enthielten kein Protein, aber pro
cm3 0,1 mg Dihydro-Diphospho-Pyridin-
nucleotid und 0,18 mg Glykolaldehyd.
Sie wurden unter Luftabschluß in Quarz-
küvetten (Schichtdicken 1 cm) eingefüllt und
bei 38" C gehalten. Die Lichtabsorption der
Lösungen in diesen Küvetten wurde für die
Wellenlänge 340 m// gemessen.
Aus Zeitschrift für Naturforschung 9 b (1954): 391.
232 Über die Oxydationsreaktion der Gärung
Wie Dorothy Needham3 fand, reagieren Pyridinnucleotid und Glycerinaldehyd,
ohne Protein, in schwach alkalischer Lösung unter Bildung von hydriertem Pyri-
dinnucleotid. Wir fanden, daß diese Reaktion in Phosphatlösungen wesentlich
schneller und auch bei neutraler Reaktion vor sich geht. Ein Versuch ist in Abb. 1
graphisch dargestellt. Wie Glycerinaldehyd wird auch Glykolaldehyd durch
Pyridinnucleotid oxydiert, in beiden Fällen entsteht die Bande 340 m// des hy-
drierten Pyridinnucleotids.* Andererseits reagiert in Phosphatlösungen auch das
hydrierte Pyridinnucleotid, unter Abgabe von Wasserstoff, mit Aldehyden (Abb. 2).
Sowohl bei diesen Reaktionen als auch bei der Oxydation der Aldehyde durch
molekularen Sauerstoff haben wir verglichen, wie sich Orthophosphat, Pyrophos-
phat und Metaphosphat verhalten, und haben gefunden, daß molekularer Sauer-
stoff nur in Orthophosphat oxydierend wirkt. Pyridinnucleotide jedoch oxydieren
Aldehyde in Pyrophosphat schneller als in Orthophosphat, in Metaphosphat jedoch
langsamer als in Orthophosphat. Dihydro-Pyridinnucleotid reduziert Aldehyde
wesentlich nur in Orthophosphat.
Es sei dazu bemerkt, daß die physiologische Oxydationsreaktion der Gärung,
mit Protein und FiscHER-Ecter, nicht nur in Orthophosphat, sondern auch in
Pyrophosphat abläuft und daß dabei wie in Orthophosphat (aber anders als in
Arseniat) ein Oxydations-Reduktions-Gleichgewicht entsteht.
II.
In den Jahren 1943 bis 1947 versuchte Meyerhof4, die Reaktion zwischen Fischer-
Ester und Phosphat durch eine Verschiebung des Triosephosphat-Gleichgewichts
nachzuweisen, fand jedoch keine Verschiebung. Lipmann5 versuchte, ähnliche
Reaktionen durch Änderung der UV-Absorption nachzuweisen, gleichfalls ohne
Erfolg. Angesichts der Abb. 1 und 2 wird man aus derartigen Versuchen schlie-
ßen, daß im Gleichgewicht weniger von dem Reaktionsprodukt vorhanden ist, als
mit den Methoden von Meyerhof und Lipmann nachgewiesen werden kann;
während unsere Methode, die Messung des Verbrauchs an aktivem Wasserstoff —
der bei Verbrauch immer wieder nachgebildet wird — offenbar empfindlicher ist.**
III.
Unter dem Einfluß der negativen Ergebnisse von Meyerhof stellte Racker6 1952
die Theorie auf, daß bei der Oxydationsreaktion der Gärung zunächst der Fischer-
Ester an das Fermentprotein — und zwar an dessen SH-Gruppe — gebunden
werde; daß er in dieser Bindung durch das Pyridinnucleotid zur Acylthioverbin-
dung oxydiert werde; und daß dann die Acylthioverbindung durch Phosphorsäure
zu Acylphosphat und SH aufgespalten werde. Keine dieser 3 Reaktionen ist bisher
durch ein Experiment nachgewiesen worden.
* Zusatz 1961. Das hierbei entstehende hydrierte Pyridinnukleotid ist nicht
imstande, in biologischen Reaktionen Wasserstoff abzugeben und ist also vermut-
lich ein Isomeres des biologischen Dihydro-Pyridinnukleotids.
** Anm. b. d. Korr.: Wir haben inzwischen gefunden, daß eine starke Bande (Enolbande?) bei
290 m// auftritt, wenn man Glycerinaldehyd in w/2-Orthophosphat anaerob bei pH 7,7 und 38°
stehen läßt; und daß diese Bande bei Sauerstoff-Zutritt abnimmt.
Über die Oxydationsreaktion der Gärung 233
IV.
Die erste Forderung der Theorie Rackers ist, daß Protein, FiscHER-Ester und
Pyridinnucleotid ohne Phosphat mindestens ebenso schnell reagieren wie das
ganze System mit Phosphat. Quantitative Versuche, in denen das Protein nicht
Katalysator, sondern stöchiometrischer Reaktionsteilnehmer ist, wären also not-
wendig. Da aber der Umsatz in der Oxydations-Reaktion der Gärung bei Gegenwart
von Phosphat rund 20000 Mole pro Minute beträgt, so müßte der stöchiometrische
Fermentumsatz in 0,003 Sek. gemessen werden, während 3 Sek., wegen der Mi-
schungszeit, die kürzeste Zeit ist, in der man den Umsatz messen kann. Fischer-
Ester als Substrat eignet sich also nicht zur Prüfung der Theorie.
Ersetzt man den FiscHER-Ester durch nicht phosphorylierten Glycerinaldehyd,
so hat man den Vorteil, daß die Reaktion etwa lOOOmal langsamer geht. Dann reicht
die mögliche Meßzeit von 3 Sek. gerade aus, um den Umsatz stöchiometrischer
Fermentmengen zu messen. Wir fanden, mit reinem oxydierendem Ferment aus
Hefe, Glycerinaldehyd und Pyridinnucleotid immer — auch in den ersten 3 Sek. —
größere Umsatzgeschwindigkeiten bei Gegenwart von Phosphat als bei Abwesen-
heit von Phosphat.
V.
Unter den Gründen, die zugunsten der Theorie von Racker angeführt werden,
nehmen die kristallisierten Quecksilbersalze der Fermentproteine, die wir ent-
deckt haben7, einen hervorragenden Platz ein : weil wir fanden, daß sie katalytisch
inaktiv sind, und daß Cystein ihre katalytische Wirkung wieder herstellt, sollen sie
die chemische Bindung der Substrate an die SH-Gruppen der Proteine beweisen.
Bedenkt man aber, daß die Hefezymohexase aktiviert wird, wenn man das Queck-
silber durch Zink verdrängt, so wird man aus der Inaktivierung der Fermentpro-
teine durch Quecksilber und ihrer Reaktivierung durch Cystein keine weiteren
Schlüsse ziehen, als sie bei der Entdeckung der Erscheinungen gezogen worden
sind.
VI.
Wenn nun auch nichts sicherer ist, als daß Glycerinaldehyd und Phosphat unter
den Bedingungen der Oxydationsreaktion der Gärung miteinander reagieren, und
daß dabei Wasserstoff des Aldehyds aktiviert wird, so wäre es trotzdem möglich,
daß die lebende Natur von dieser Aktivierung keinen Gebrauch macht, sondern
daß sie den Rackerschen Umweg zur Erzeugung des Acylphosphats wählt. Indessen
— will man hier etwas beweisen oder widerlegen, so wird man zu den Tatsachen8
von 1939 nicht nur neue Überlegungen9, sondern auch neue Tatsachen hinzufügen
müssen.
Nachtrag siehe Seite 633.
Literatur
1 Wind, F., Biochem. Z. 159 (1925), 58. 7 Warburg, O., und Christian, W., Biochem. Z. 310
2 Meyerhof, O., und Lohmann, K., Biochem. Z. 271 (1941), 384; Kubowitz, F., und Ott, P., Biochem. Z.
(1934), 89. 314 (1943), 94.
3 Needham, Dorothy, und Mitarbeiter, Biochem. J. 49 8 Warburg, O., und Christian, W., Biochem. Z. 303
(1951), 113. (1939), 40.
4 Meyerhof, O., und Mitarbeiter, J. biol. Chemistry 149 9 Bücher, Th., Biochim. et biophysica Acta (Amsterdam)
(1943), 71; 157 (1945), 571; 170 (1947), 1. 8 (1952), 219—222; Sidney F. Velick und Mitarb.,
5 Lipmann, F., Advances in Enzymol. 6 (1946), 240. J. biol. Chemistry 203 (1953), 527—583; Segal, H. L.,
6 Racker, E., und Krimsky, J., J. biol. Chemistry 198 und Boyers, P. D.,J. biol. Chemistry 204 (1953), 265;
(1952), 731. Oesper, P.,J. biol. Chemistry 207 (1954), 421.
24 Stöchiometrische Versuche mit dem oxydierenden
Gärungsferment*
Von Otto Warburg, Karlfried Gawehn und August Wilhelm Geissler
Widerlegung der Theorie, daß SH des oxydierenden Gärungsferments durch Abgabe und Auf-
nahme von Wasserstoff an der Wirkung des Ferments beteiligt ist.
Da das oxydierende Gärungsferment bei Sättigung mit Substrat bei Zimmertem-
peratur pro Mol und Minute etwa 20000 Mole FiscHER-Ester oxydiert, so ist
die Geschwindigkeit der stöchiometrischen Reaktion zwischen Ferment und Sub-
strat so groß1, daß sie mit den zur Verfügung stehenden Methoden nicht gemessen
werden kann; Messungen, soweit solche vorliegen, sind keine Messungen der
chemischen Reaktionsgeschwindigkeit, sondern Messungen von Mischungs- oder
Zusatzgeschwindigkeiten. Benutzt man anstatt FiscHER-Ester den nicht phosphory-
lierten Glycerinaldehyd als Substrat, so verläuft die Oxydation des Aldehyds zwar
sehr viel langsamer, aber unter den üblichen Versuchsbedingungen doch noch zu
schnell zur Messung des stöchiometrischen Umsatzes2.
Die Messung der stöchiometrischen Reaktion aber wäre erwünscht, um zu ent-
scheiden, ob die Theorie von Racker3 von 1952 richtig ist:
R r R R
I /H I /H I yO I yO
C<^ ;- SH-- Ferment — C^-OH+D.P.N. »c( + H3P04-^C = 5,3 • 0,7 = 3,7,
also wiederum nahezu dasselbe wie für rotes oder für grünes Meßlicht.
Wenn wir 1923 fanden5, daß der Quantenbedarf im Rot und im Gelb 4,4, im
Blau aber, bezogen auf die Gesamtabsorption, 5,1 war, so könnte man dies jetzt
durch die Annahme erklären, daß im Rot und Gelb das katalysierende Licht zur
Erzielung der maximalen Ausbeute fehlte. Bezogen auf die Chlorophyllabsorption
betragen die Werte von 1923 im Rot und im Gelb I/95 = = 4,4, im Blau aber 1/9? =
5,1 • 0,7 = 3,6.
Es ist also nunmehr, nach der Entdeckung der katalytischen Wirkung des blau-
grünen Lichts, zweifelhaft geworden, ob die von den gelben Farbstoffen absor-
bierte Lichtenergie auch zur Reduktion der Kohlensäure oder ob sie nur zur Bil-
dung des Luminoferments benutzt wird.
11. Sommerzellen
Die katalytische Wirkung des blaugrünen Lichts wurde im Januar dieses Jahres
entdeckt. In einer fast ununterbrochenen Versuchsserie bis Ende Juli wurde diese
Wirkung immer wieder gefunden, mit Ausnahme einer Periode von 3 Wochen im
* Zusatz 1961. Dieser Absatz ist heute zu streichen. Er ist noch ein Tribut an
den Irrtum, daß der chemische Mechanismus die Umkehr des Mechanismus der
Atmung ist.
Katalytische Wirkung des blaugrünen Lichts auf den Energieumsatz bei der Photosynthese 255
Juni. Es ist in diesem Zusammenhang erwähnenswert, daß die im Jahre 1953 ver-
öffentlichten Versuche3, bei denen in monochromatischem Rot, ohne Kompen-
sation durch weißes Licht, gute Ausbeuten erhalten wurden, nach Ausweis der
veröffentlichten Protokolle, Mitte Mai und Ende Juni ausgeführt worden sind;
und daß die im Jahre 1953 veröffentlichten Versuche, bei denen im Grün, ohne
Kompensation mit weißem Licht, gute Ausbeuten erhalten wurden, zwar im März
ausgeführt worden sind, aber mit Grün, das mit Orangeglas 4 isoliert war und des-
halb noch 510 rn.fi als Verunreinigung enthielt. —
Wie bereits in der Einleitung angedeutet, erklären wir die Unterschiede zwischen
den Sommer- und Winterzellen — bei gleichen spektralen Reinheiten des Meß-
lichts — durch die Annahme, daß die Rückbildung des Lumino-Carotinoids zu
Carotinoid in den Sommerzellen langsamer verläuft.
12. Hemmung durch n 350000-HCN
Autotrophe Chlorella gehört zu denjenigen Organismen, deren Atmung durch
HCN nicht spezifisch gehemmt wird7. Es mag sein, daß HCN in Chlorella ver-
brennt. Aber diese Verbrennung ist jedenfalls eine sehr langsame, da der respira-
torische Quotient CO2/O2 der Chlorellaatmung, der um — 1 ist, sich bei Zusatz
von HCN, deren Verbrennungsquotient CO2/O2 = -2 ist, nicht ändert.
Anders als die Atmung ist die Photosynthese7 der Chlorella in weißem Licht
gegen HCN sehr empfindlich und wird durch w'20000-HCN um 50" „ gehemmt.
Noch viel empfindlicher gegen HCN ist, wie wir fanden, die Wirkung des blau-
grünen Lichts, die bereits durch «350000-HCN vollständig gehemmt wird.
Bei den Versuchen war darauf zu achten, daß die Zellsuspensionen in den
Manometriegefäßen zuerst mit den vorgeschriebenen Gasmischungen gesättigt
wurden und daß erst dann die HCN zugesetzt wurde, da andernfalls die zugesetzte
HCN schon vor Beginn der Versuche wieder ausgetrieben worden wäre. Zu 7 cm3
Zellsuspensionen in Kulturlösung, enthaltend 8 mm3 Zellen, setzten wir 0,2 cm3
10'4 w-HCN und belichteten mit der Wellenlänge 644 m// als Meßlicht (J = 23 mm3
Quanten pro Minute) unter Zusatz oder Fortnahme von Blaugrün {J = 0,3 mm3
Quanten pro Minute). In einem Versuch am 16. Juli dieses Jahres fanden wir:
n
TT^TVT
Ohne HCN
350 000 HC
Blaugrün
Zeit
[min]
1/9
CO2/O2
Blaugrün
Zeit
[min]
V •
1000 cm3 aus Quarz dest. Wasser. pH ist etwa 4,2 und geht bei der Kultur auf etwa 5,2.
Kataly tische Wirkung des blaugrünen Lichts auf den Energieumsatz bei der Photosynthese 257
Mikroelemente nach D. Arnon:
I: 500 mg FeS04 • 7 H20 + 1000 mg Fe(N03)3 ■ 9 H20 - 300 mg HBO3 - 200 mg MnS04 •
4 H-20 + 22 mg ZnS04 ■ 7 H20 - 8 mg CuS04 ■ 5 H20 + 2 mg (NH4)6 M07 024 + 4H20 -
1000cm3^-H2SO4.
II: 5 mg CoS04 • 7 H20 + 5 mg NiS04 • 7 H20 + 5mg Na2W04 + 5 mg CrK (S04)2 ■ 12
H20 + 5 mg VOS04 • 2H20 + 1000cm3 ^5 -H2SO4.
III*: 500 mg VOS04 • 2 H20 + 500 cm3 Wasser (0,1 cm3 = 0,27 /ig Vanadium).**
Vor der Beimpfung der Zuchtkolben werden je 2 cm3 II cm3 II 0,1 cm3 III zu 250 cm
„K" gegeben.
Anordnung der Kultur: Abbildung in: Warburg und Mitarbb., diese Zeitschrift 7b, 142 (1952)
(dort aber andere Kulturlösung).
Temperatur bei der Kultur: 25° C.
Bei der Kultur durchgeleitetes Gas: 5 Vol% C02, 10 Vol% 02, Rest Argon.
Belichtung: Südfenster mit Sonnenschutz. 200-Watt-Metallfadenlampe in etwa 25 cm Abstand
von den Zuchtkolben.
Vermehrung: Einsaat etwa 30 mm3, Ernte nach 24 Stdn. 200 bis 250 mm3, nach 48 Stdn. 500 bis
800 mm3 Zellen.
Vorbereitung zum Versuch: ltägige Kulturen wurden direkt verwendet, 2- oder mehrtägige Kul-
turen wurden 2mal auf der Zentrifuge mit „K"-Lösung gewaschen. Die Zelldichte wurde in
Haematokriten bestimmt und gab einen ungefähren Anhaltspunkt für die Menge der Versuchs-
zellen. Durch Multiplikation mit dem Faktor 0,25 erhält man aus dem Zellvolumen in „K" die
Trockensubstanz.
Einfüllen in die Manometriegefäße: Je 7 cm3 Zellsuspension mit etwa je 7 mm3 Zellen wurden in
zwei Gefäße von gleicher Form aber ungleichem Volumen eingefüllt. Dann wurde weiter nach den
Vorschriften der 2-Gefäß-Methode verfahren.
Messung der Lichtabsorption: Die Lichtabsorption wurde in den bewegten Manometriegefäßen am
Anfang und am Ende der Versuche mit der Ulbrichtschen Kugel gemessen und daraus die Licht-
absorption für die Zwischenzeiten durch lineare Interpolation berechnet. Näheres über die Kugel
bei Warburg und Krippahl, diese Zeitschrift 9b, 181 (1954).
Die Lichtabsorption A als Funktion der Zellkonzentration c: Aus der Gleichung der Lichtabsorption
in Lösungen, j — j -B.c.d
A = =1 — e. p c "
h
folgt für kleine Werte von c
A = ß ■ c ■ d,
d. h. bei kleinen Werten von c ist die Lichtabsorption proportional der Farbstoffkonzentration c,
wenn der Lichtweg d konstant gehalten wird. In den Zellsuspensionen jedoch nimmt, wegen der
Zerstreuung, der Lichtweg d mit der Zellkonzentration c zu, und deshalb findet man bei kleinen
Zellkonzentrationen, daß dAjdc nicht konstant ist, sondern zunimmt.
Manometrie. Die Versuche waren so angeordnet, daß die Atmung vernachlässigt werden konnte. In
der ganzen 5- bis 7stdg. Versuchszeit konnte also ohne Unterbrechung, ohne die Atmung zu
messen, kontinuierlich mit dem Meßlicht belichtet werden. Der große methodische Fortschritt
dieses Verfahrens ist in dieser Zeitschrift 8b, 675 (1953), erläutert. Auch wegen Bolometne,
Optik und Manometrie wird diese Arbeit und die Arbeit diese Zeitschrift 9b, 303 (1954) hier als
bekannt vorausgesetzt.
Aktinometrie. Zur aktinometrischen Messung des diffusen blaugrünen Lichts wurden die Zell-
suspensionen in den Manometriegefäßen durch je 7 cm3 aktinometrische Flüssigkeit ersetzt, die die
Zusammensetzung hatte: 2 mg Äthylchlorophyllid + 200 mg Thioharnstoff in 7 cm3 Pyridin reinst
von Merck. Wenn im Gasraum Luft war — was am bequemsten ist — , so wurden die absorbierten
mm3 02 durch 0,65 dividiert, um die mm3 absorbierten Quanten zu erhalten. Vgl. auch Warburg
und Schocken, Archives of Biochemistry 21, 363 (1949).
* Auf Grund der Mitteilung von D. Arnon in Nature (London) 172, 1039 (1953).
** Zusatz 1961. Es ist nicht VOSO4, sondern NaVOs, also Na-Meta-Vanadat,
zu verwenden.
17 Warburg, Zellphysiologie
258 Katalytische Wirkung des blaugrünen Lichts auf den Energieumsatz bei der Photosynthese
ChlorophyUbestimrnung in Chlorella. Chlorella wurde in dest. Wasser gewaschen und dann mit trocke-
nem Methanol extrahiert, bis der Rückstand nicht mehr rot fluoreszierte. Dann wurde die Licht-
schwächung i'o/z für die Wellenlänge 546 vn.it und den Lichtweg d [cm] bestimmt und daraus die
Chlorophyllkonzentration c mit ß = 9,3 cm2/mg erhalten:
In — r
i
In 4-
i
mg
cm3
ß-d
9,3 • d
Protokoll IL Versuch vom 19. 2. 1954, 1 546 als Meßlicht ± Blaugrün
ltägige Kultur, Vermehrung von 40 -- 250 mm3. 7 cm3 (=7 mm3 Zellen) in jedes Manometriege-
fäß eingefüllt. Anfangsabsorption 7,2",,. Endabsorption nach 6-Stdn. -Versuch 11,5",,. Blaugrün-
Absorption etwa 50",,.
20°. Gasraum 5 Vol. % C02, 10 Vol. % 02, Argon.
v' = 16,88 cm3 v = 21,35 cm3,
v'F = 7,00 cm3 vf = 7,00 cm3.
xo-z = H' ■ 8,05 - H • 10,24 [mm3],
xcoo = — H' ■ 11,49 H ■ 16,57 [mm3].
^546
J blaugrün
H'
H
ll 2 ' b2 ■ d2 '
Anders als im Fall von Lösungen ist hier wegen der Änderung der Zerstreuung mit der Wellen-
länSe j ■ u. A
d\ nicht = d-2,
sondern d nimmt zu, wenn man zu kürzeren Wellenlängen übergeht. In J0!J als Funktion der
Wellenlänge aufgetragen, ergibt also eine Kurve, die wegen der Zerstreuung über der wahren
Absorptionskurve der Pigmente Hegt, um so mehr, je kürzer die Wellenlängen sind. In derselben
Weise ist das Wirkungsspektrum des Ferments — das ja gleichfalls mit lebender Chlorella auf-
genommen ist — in Richtung Blau verzerrt.
Um zu ermitteln, wieviel diese Verzerrung ausmacht, bestimmten wir mit der Ulbrichtschen
Kugel In Jo J einmal für lebende Zellen und dann für einen Methanolextrakt der gleichen Zellen
bei gleicher Pigmentkonzentration in den gleichen Gefäßen. Für 7 ccm auf einer Fläche von 8,3 cm'2
bei einer Zelldichte von 2,5 cmm Zellen pro cm3 fanden wir:
f'n
645 mii. Lebende Zellen. J'Q'J' = 6,23, In— = 1,829
645 m/(. Methanol-Extrakt. J0J' = 5,38, In -=7 = = 1,77
Extrakt
1,03
546 m//. Lebende Zellen. J'ojJ' == 1,73, ln-^- -0,548 ' ZeUen
Tu
546 m/i. Methanol-Extrakt J'o/T = l,417,ln y = 0,349
Extrakt
= 1,57,
d. h. die Zerstreuung machte bei 645 m/< wenig aus, bei 546 mit jedoch so viel, daß der Lichtweg in
der Zellsuspension l,57mal so groß war wie in der Lösung. Dabei machen wir die wahrschein-
liche Annahme, daß die Absorption der Pigmente durch ihre Bindung in der Zelle nur wenig ge-
ändert wird, zumal die Differenzen bei den kürzeren Wellenlängen auftreten.
Aus diesen Überlegungen folgt, daß das Absorptionsspektrum der lebenden Chlorella durch
zwei Einflüsse zustande kommt, durch die Änderung der Pigmentabsorption mit der Wellenlänge
und durch die Änderung der Zerstreuung mit der Wellenlänge.
Die Zellen stammten aus einer ltägigen Südfenster-Kultur 200-WTatt-Metallfadenlampe.
8 mm:i Zellen, suspendiert in 7 ccm Kulturlösung, wurden in ein Manometriekästchen eingefüllt,
dessen Grundfläche 8,3 cm- betrug. Wir fanden:
272
Wirkungsspektrum eines Photosynthese-Ferments
A
In (JolJ)).
m/u
JolJ
In JolJ
: In JoJ)mo
401
2,11
0,747
0,842
405
2,08
0,732
0,825
418
2,34
0,875
0,983
440
2,43
0,888
1,000
457
1,95
0,670
0,762
470
1,91
0,647
0,728
490
1,79
0,582
0,655
501
1,505
0,409
0,460
520
1,19
0,174
0,196
548
1,085
0,082
0,092
578
1,18
0,165
0,186
605
1,24
0,215
0,242
632
1,31
0,270
0,304
645
1,38
0,322
0,362
654
1,46
0,378
0,438
668
1,70
0,531
0,597
Protokoll III (1. 6. 1955). Grün als Meßlicht
Zellen: 2tägige Kultur, Südfenster 200-Watt-Metallfadenlampe. In Kultursalzlösung +
Mikroelemente A. In 5 CO2, 10 O2, 85 Argon. Saat 30 cmm Zellen in 250 ccm. Ernte 610 cmm. pH
5,6. Mit Kulturlösung auf 7 cmm: 7 ccm verdünnt. Vor der Messung 100 y öwertiges Vanadium
als NaVC>3 ■ 4 H2O zugegeben.
Manometrie: Wie Protokoll I.
Meßlicht: Hg-Linie 546 mit, aus 500-Watt-Hg-Hochdrucklampe, 2 cm 10",, CuS04 ■ 5 H20 -
2 mm Orangeglas I von Schott j 10 mm Didymscheibe. Die Filterscheiben befanden sich in
fließendem Wasser, da sie ihre Durchlässigkeit bei Erwärmung erheblich ändern !
Blaugrün: 60-Watt-Cadmiumrohr von Heraeus Hanau („Jupiterlampe"), in 100 cm Entfernung
von den Manometriegefäßen, + 2 mm Blauglas 23 von Schott. Eingestrahlte Intensität J aktino-
metrisch gemessen, indem das Versuchsgefäß im Thermostaten durch ein Aktinometergefäß
gleicher Dimension ersetzt wurde. J == 0,6 cmm Quanten pro Minute (ist 468 480 509 m/t).
Lichtabsorption: Der absorbierte Bruchteil a des grünen Lichts wurde mit der Ulbrichtschen Kugel
am Anfang und am Ende des Versuchs gemessen. Anfang a = 0,132, Ende a = 0,148. Die Ab-
sorption für die dazwischenliegenden Zeiten wurde durch geradlinige Interpolation berechnet.
Berechnung des Quantenbedarfs: Die absorbierte Intensität des blaugrünen Lichts konnte ver-
nachlässigt werden. Wurden von dem Meßlicht J cmm Quanten pro Minute eingestrahlt und
wurden in t Min. xo2 cmm Sauerstoff aus der Zelle entwickelt, so war der Quantenbedarf
1 ( ^546 • «546) ' t
V ' xo2
ig wurde also vernachlässigt.
Großes Gefäß Kleines Gefäß
1
•?46 = 10J ß ( 40' + 20'5' + 43'5
Jblaugrün — Ujb J
xoo + 123
• *co2 — 138
y 1,12
1
= 4,37
1
J546 = 101 |30, + 17. +29j5
Jblaugrün — 0 J
xo2 + 55
> *co2 — 45
y _ o,82
1
" .1
xo2 + 97
f %co2 — 109
y 1,12
1
-Kapazität des Blutes bestimmt werden. Beide Kapazitäten aber unterschei-
den sich wesentlich durch die Festigkeit, mit der der O2 in den Zellen gebunden ist.
In Chlorella ist der O2 mit 40000 Kalorien sehr fest gebunden, während er aus
roten Blutzellen bereits bei Erniedrigung des 02-Drucks abdissoziiert.
Treibt man die (^-Kapazität aus Chlorella aus, so ist zunächst die Quantenaus-
beute -Drucken von 20 bis
30",, einer Atmosphäre, verhindert die Wiederherstellung der Oo-Kapazität ebenso
wie O-2-Mangel, woraus hervorgeht, daß es nicht der Druck des O2, sondern eine
chemische Reaktion des 0> ist, welche die Kapazität wiederherstellt.
Man kann sich keine besseren Beweise unserer Gleichungen denken, als diese
Experimente : die Wiederherstellung der Ch-Kapazität in der Abklingungszeit der
induzierten Atmung und die NichtWiederherstellung der Kapazität, wenn die indu-
zierte Atmung durch Oo-Mangel oder durch Blausäure gehemmt ist.
Anmerkung. Die induzierte Atmung, die nach unseren Messungen und nach unsern Gleichungen
immer mindestens das Doppelte der stationären Photosynthese beträgt, kann heute mit fast be-
liebig großen manometrischen Ausschlägen gemessen werden. Die induzierte Atmung bestreiten,
wäre heute dasselbe, als ob man die Sauerstoffkapazität des Blutes bestreiten wollte. Kein Isotop,
weder 14C noch 180, kann an der Tatsache der induzierten Atmung und ihrer Äquivalenz zur
Photosynthese etwas ändern. Wenn die Kohlensäure 14COo im Licht reduziert wird, so ist gemäß
unsern Gleichungen der Kohlenstoff, der verbrennt, nicht, wie Weigl annimmt (Amer. Chem.
Soc. 73, 5058 [1951]), der Kohlenstoff V1C, sondern es ist der Kohlenstoff 14C. Wenn der schwere
Sauerstoff lsO im Dunkel veratmet wird, während das gewöhnliche Wasser rLieO im Licht ge-
spalten wird, so ist es nicht der schwere Sauerstoff 180, wie Brown glaubt (J. Bot. 40, 719 [1953]),
sondern es ist der gewöhnliche Sauerstoff ieO, der im Licht veratmet wird, da in der belichteten
Chlorella kein Gasgleichgewicht und somit auch kein Isotopen-Gleichgewicht herrscht. — Im
übrigen ist es klar, daß die Entdeckung der großen induzierten Atmung die Deutung vieler älterer
Photosynthese-Versuche ändern kann. Wenn man z. B. bald nach Einsetzen der Belichtung in
Chlorella irgendein Zwischenprodukt findet, so darf man heute nicht mehr ohne weiteres daraus
schließen, daß dies ein Zwischenprodukt der Photosynthese sei, sondern man wird daran denken
müssen, daß es ein Zwischenprodukt der induzierten Atmung sein könnte.*
1. Versuchsmedium, pH, Gasdrucke
Unser Versuchsmedium bei der Entdeckung der Quantenausbeute l4 war Kultur-
medium, dessen Nitrat durch NH4CI ersetzt war und dessen pH nach kurzer Ver-
suchsdauer (wegen des Verbrauchs an NH3 aus NH 4CI) bereits pH 3,8 war. In
einer späteren Arbeit5 über die Quantenausbeute 1 war das Versuchsmedium dest.
Wasser. In beiden Arbeiten also war das Versuchsmedium frei von Nitrat und
* Zusatz 1961. Die lichtinduzierte Atmung erklärt, daß sofort beim Einsetzen
der Belichtung in den Radiogrammen die Zwischenprodukte der Sauerstoff-
atmung auftreten. Photosynthese ist also nicht, wie Calvin aus seinen Radiogram-
men geschlossen hat, Umkehr der Atmung; sondern eine Teilreaktion der Photo-
synthese ist Atmung.
Sauerstoff-Kapazität der Chlorella 277
relativ sauer. Auf der Suche nach einem geeigneten Medium zur Bestimmung der
O-2-Kapazität gingen wir von diesen Erfahrungen aus und fanden es günstig, nicht
nur das Nitrat, sondern auch das Calcium aus dem Versuchsmedium fortzulassen,
das dann die folgende Zusammensetzung hatte :
5 g MgS04 • 7 H20 + 2,5 g KH2P04 + 2 g NaCl + 1000 cm3 aus Quarz dest.
Wasser, mit «/I-H2SO4 auf pH 3,75 angesäuert. Es schien nicht notwendig zu
sein, diesem Versuchsmedium die bei der Züchtung verwendeten Mikroelemente
zuzusetzen, doch sollte ein solcher Zusatz immer wieder geprüft werden.
Chlorella Pyrenoidosa aus der Sammlung von Professor Härder (Göttingen), wie
kürzlich beschrieben, gezüchtet, wurde in diesem Medium 2 mal gewaschen und
dann zu der gewünschten Zelldichte aufgefüllt.
Der COj-Druck bei den manometrischen Messungen betrug 10" n, der O2-
Druck 20 — 30° () einer Atmosphäre. Das indifferente Gas war Stickstoff oder Argon.
Unter diesen Bedingungen betrug die Abklingungszeit der induzierten Atmung
25 — 30 Minuten. Die induzierte Atmung verlief also sehr langsam, wie es zur
Messung der O-2-Kapazität erwünscht war.
Die 2-Gefäß-Methode war zur Messung der Oi-Kapazität notwendig, da mit
dem O2, der entwickelt wurde, immer gleichzeitig eine nahezu äquimolekulare
Menge CO2 absorbiert wurde.
2. Zellmenge
Da die 02-Kapazität eine stöchiometrische Eigenschaft der Zellen ist, so erhält
man bei der Messung der 02-Kapazität um so größere manometrische Ausschläge,
je größer die verwendeten Zellmengen sind. 100 — 200 mm3 Zellen waren eine
geeignete Zellmenge, die bei einer Kapazität von 200 mm3 pro cm3 20 — 40 mm3
O2 im Licht entwickelten. Während wir also heute die Photosynthese — die Reak-
tion [5] unsrer Gleichungen — mit möglichst dünnen Zellsuspensionen messen
(~ 1 mm3 Zellen pro cm3), müssen die Zellmengen bei der Messung der 02-
Kapazität 15 — 30-mal so groß sein.
3. Blaugrün
Wegen der katalytischen Wirkung des blaugrünen Lichts haben wir bei den Mes-
sungen der 02-Kapazität zu dem grünen oder roten Meßlicht, von dem 20 bis
50 mm3 Quanten pro Minute eingestrahlt wurden, immer Blaugrün hinzugefügt,
dessen eingestrahlte Intensität J *~ 1,0 mm3 Quanten pro Minute war. Als Quelle
des Blaugrün diente eine 60-Watt-Jupiterlampe von Heraeus in Hanau, die mit
Blaufilter in einer Entfernung von 45 cm von den Manometriegefäßen aufgestellt
war. Es ist unwahrscheinlich, daß hierbei die maximale katalytische Wirkung des
blaugrünen Lichts schon erreicht wurde, da bei der großen Zelldichte das Blau-
grün schon in 1/io oder 1/oo der Schichtdicke der Zellsuspension absorbiert wurde.
?V
,Time Lag"
Bei jedem Übergang von dunkel zu hell dauert es eine gewisse Zeit, bis der Strom
des O2, der im Dunkel aus dem Gasraum in die Suspensionsflüssigkeit und von
278 Sauerstoff-Kapazität der Chlorella
hier in die Zellen hineingeht, seine Richtung umkehrt und aus den Zellen in die
umgebende Flüssigkeit und von hier aus in den Gasraum austritt. Durch große
Schüttelgeschwindigkeit, die in unsern Versuchen 190 Exkursionen pro Minute
betrug, kann diese „Nachwirkezeit" verkleinert, aber sie kann nie Null werden.
Wenn wir z. B. 100 mm3 Chlorella in unserm Versuchsmedium mit / 546 m//
(J = 32,6 mm3 Quanten pro Minute, Absorption 89%) belichteten, fanden wir die
folgenden Druckänderungen :
im kleinen Gefäß im großen Gefäß
v == 16,88 vF = 7,00 v = 21,35 vF = 7,00
(mm) (mm)
10' dunkel —5,0 —2,5
l'hell +4,5 +2,5
1' dunkel + 1,5 + 0,5
5' dunkel —5,0 —3,0
Ein erheblicher Teil der durch das Licht bewirkten positiven Drucke kam also in
der ersten Dunkelminute noch „nach", und es kam in dem kleinen Gefäß relativ
mehr Druck nach als in dem großen Gefäß. Berechnet man I/7 ohne Berücksichti-
gung der Nachwirkung, so erhält man 1/r/ : = 1,87 und y = — 0,96, während man
bei Berücksichtigung der Nachwirkung \\y = 1,23 und y = — 1,05 erhält. Bei
Nichtberücksichtigung findet man also sowohl y als auch die Ausbeute zu niedrig.
Um hier Abhilfe zu schaffen, lesen wir bei allen manometrischen Versuchen, bei
denen die Belichtungszeiten kurz sind, nicht sofort bei Beendigung der Hellzeit ab,
sondern erst nach Ablauf einer auf die Hellzeit folgenden Dunkelminute. Wir lesen
außerdem unsere Manometer nicht am Anfang der Hellzeit ab, sondern eine Minute
vor Einsetzen der Belichtung, damit die Schüttelbewegung am Anfang der Hell-
zeit nicht unterbrochen werden muß.
Wenn wir also die Wirkung des Lichts in 1 Hellminute messen wollen, so ist die
Zeitfolge 1' dunkel 1' hell 1' dunkel. Wenn wir die Wirkung des Lichts in n Hell-
minuten messen wollen, so ist die Zeitfolge 1' dunkel n hell 1' dunkel. Wenn wir die
Lichtwirkung für drei aufeinanderfolgende Hellminuten messen wollen, so messen
wir niemals nach V und nach 2' und nach 3' hell, sondern wir machen 3 Versuche
mit der Zeiteinteilung 1' dunkel, V hell, V dunkel; 1' dunkel, 2' hell, V dunkel;
1' dunkel, 3' hell, 1' dunkel, wobei dann zur Berechnung des Quantenbedarfs die
Atmung sowohl in den begrenzenden Dunkelminuten als auch in den Hellminuten
berücksichtigt werden muß.
Das Verfahren wird erläutert durch die Abb. 1 u. 2 sowie durch die Protokolle II
u. III. Die so erreichte Eliminierung des „Time lag" ist eine wesentliche Verbesse-
rung der Manometrie kurzer Belichtungszeiten und hat die Ausbeuten der Photo-
dissoziation wesentlich verbessert.
5. Thermoeffekte
Da wir beim Einsetzen der Belichtung größere positive Druckveränderungen
finden als später und da wir beim Einsetzen der Verdunkelung größere negative
Druckveränderungen finden als später — wobei „Time lag" als eliminiert zu den-
ken ist — , so sind wir gefragt worden, ob diese Effekte nicht von Erwärmungen
und Abkühlungen herrühren.
Sauerstoff-Kapazität der Chlorella
279
Abb. 1. Bestimmung des Quan-
tenbedarfs der Photodissozia-
tion mit Licht der Wellenlänge
644 m// und der Intensität 36
mm:3 Quanten pro Minute. Be-
lichtungszeit 1 Minute. O Be-
ginn der Belichtung; 0 Ende
der Belichtung; -- manometri-
sche Ablesungen.
Daten in Protokoll II
10 15 20 25 30 35
Minuten ►
Enthält ein Manometriegefäß 7 cm3 Zellsuspension und werden in diese 7 cm3
pro Minute 2 //Mole Quanten, das sind im Mittel 2 • 0,05 Kalorien, eingestrahlt
und in ihnen absorbiert; wird ferner diese Energie nicht für die Photodissoziation
verbraucht, sondern in Wärme umgewandelt; und findet, trotz der Schüttel-
frequenz von 190 pro Min., kein Wärmeaustausch mit dem Thermostatenwasser
>iz
Abb. 2. Bestimmung des Quantenbedarfs
der Photodissoziation mit Licht der Wellen-
länge 644 m/< und der Intensität 36 mm3
Quanten pro Minute. Belichtungszeit 5 Mi-
nuten. O Beginn der Belichtung; 0 Ende der
Belichtung; manometrische Ablesungen.
Daten in Protokoll II.
t"
I
5 n
E U
-8
-12
■16
jrirz*
/
r*
\
/
\
\
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d
\
k
4-
i i,
1 , i
10
15 20 25 30
Minuten ■>
statt: dann könnte die Erwärmung in den Manometriegefäßen 1/7o°C betragen und
die Druckänderung könnte in 1 Min. + 0,5 mm Brodie betragen; während wir
bei der Messung der Photodissoziation in der ersten Hellminute etwa die lOfache
Druckänderung finden. In Wirklichkeit jedoch wird die eingestrahlte Energie fast
vollständig für die Photodissoziation verbraucht; und in Wirklichkeit wird einge-
strahlte Wärme wegen der großen Schüttelgeschwindigkeit an das Thermostaten-
wasser abgeführt, so daß auch nicht kleine Bruchteile der gefundenen Effekte Ther-
280 Sauerstoff-Kapazität der Chlorella
moeffekte sein können. Das gleiche folgt aus allen Versuchen, bei denen beim Ein-
setzen der Belichtung keine positiven Drucke auftreten — bei alkalischer Reaktion,
bei Mangel an CO2, bei Mangel an O2, bei Gegenwart von HCN usw.
Um diese Überlegungen zu bestätigen, ersetze man in den Manometriegef äßen
die Zellsuspension durch 7 cm3 einer das Licht vollständig absorbierenden Methy-
lenblaulösung (20 mg Methylenblau Merck + 20 cm3 Versuchsmedium pH 3,8,
wovon 7 cm3 in den Manometriegefäßen die Wellenlänge 546 m/t vollständig ab-
sorbieren), sättige mit 10 Vol.-Proz. Kohlensäure-Luft und belichte wie bei den
Messungen der Photodissoziation mit 546 m/t der Intensität 20 — 50 mm3 Quan-
ten pro Minute. Man findet dann bei Zusatz oder Fortnahme des Lichts keine
Druckänderungen.
6. Sauerstoff-Kapazität
Bei den Bestimmungen der 02-Kapazität ist es von entscheidender Bedeutung, daß
die Zellen zunächst 30 Min. im Dunkeln oder in ganz schwachem Blaugrün ge-
halten werden, damit, gemäß unsern Gleichungen, die O-2-Kapazität durch die
Energie der Atmung aufgebaut wird. Erst dann belichtet man, und zwar mit
35 — 60 mm3 Quanten pro Minute, die im Rot vollständig und im Grün fast voll-
ständig von den 100 — 200 mm3 Zellen absorbiert werden. Die Dauer der Belich-
tung beträgt dabei 10 Minuten. Bereits in den ersten 5 Min. wird die Kapazität im
wesentlichen als positiver Druck entwickelt. In den zweiten 5 Min. hat man dann
die stationäre Photosynthese, deren viel kleinere Druckentwicklung von der Druck-
entwicklung in den ersten 5 Minuten abgezogen wird. Die Differenz zwischen an-
fänglicher und stationärer (^-Entwicklung ist die O-2-Kapazität. Zur Erläuterung
dient das Protokoll I, in dem 2 Versuche genau beschrieben sind. Insbesondere
beachte man, daß die Oo-Kapazität unabhängig von den angewandten Lichtinten-
sitäten ist.
Die Kapazitätsbestimmung wurde stets mit einer Chlorophyllbestimmung ver-
bunden, indem aus den Versuchszellen ein Methanolextrakt hergestellt wurde,
dessen Lichtschwächung io/i bei 546 m/t die Chlorophyllkonzentration c ergab :
ln-^- ln-^
mgr
cm:!
ß-d 9,3 -d
In dem ersten Versuch des Protokolls I wurden aus 200 mm3 2tägiger Chlorella
(Chlorophyllgehalt 6,4" ()) 48 mm3 O2 entwickelt, während der Chlorophyllgehalt
79,5 mm3 betrug. Es war also o2-KaPazität
Chlorophyll
In dem zweiten Versuch des Protokolls I wurden aus 200 mm3 ltägiger Chlo-
rella (2,34" 0 Chlorophyll) 31,5 mm3 O2 entwickelt, während der Chlorophyllgehalt
29,2 mm3 betrug. Es war also o2-KaPazität
= 1,08.
Chlorophyll
Bei der Bestimmung der 02-Kapazität ist darauf zu achten, daß der C02-Druck
der in der allgemeinen Versuchsanordnung vorgeschriebene von 1/io einer Atm.
Sauerstoff-Kapazität der Chlorella
281
ist. Es ist experimentell wie theoretisch in gleichem Maße wichtig, daß man bei
niedrigen CO-j-Drucken kleinere 02-Kapazitäten findet.
Auch der vorgeschriebene O-2-Druck ist einzuhalten. Um sicher zu gehen, haben
wir für den O-2-Druck 20 — 30" „ einer Atm. vorgeschrieben.
7. Quantenbedarf der Photodissoziation
Bei der Bestimmung des Quantenbedarfs ist zu berücksichtigen, daß die Atmung
sehr erheblich ansteigt, wenn man belichtet. In den Versuchen der Abb. 1 und 2
war die Atmung nach 1 Hellminute bereits verdoppelt und nach 5 Hellminuten ver-
dreifacht. Die gleichen Abbildungen erläutern graphisch, wie man die Atmung bei
der Berechnung des Quantenbedarfs berücksichtigt.
Wir berechnen in dieser Weise den Quantenbedarf für die Austreibung des
gesamten Oz nach Abb. 3 und finden (O2 aus 100 mm3 Zellen mit Jeu = 35,8 mm3
Quanten pro ' ausgetrieben) :
Tab. 1.
Belichtungszeit
xo2
»co2
(Min.)
(mm3)
(mm3)
Y
1 /
/
O
C — c
dt
XO-2
d. h.j man findet für den ganzen Verlauf der Austreibung der Kapazität nahezu
die Quantenausbeute 1.
Wie man nun das Absinken der Ausbeute mit fortschreitender Austreibung der
Kapazität auch erklären mag, jedenfalls lehren die Versuche, daß man die Quan-
tenausbeute 1 nur findet, wenn die Zellen ihre volle O-2-Kapazität besitzen. Sinkt
die Kapazität, weil die Lichtintensität zu groß und die induzierte Atmung zu klein
ist, so sinkt auch die Ausbeute.
8. Wiederherstellung der Sauerstoff-Kapazität
Wie man aus den Abb. 1 und 2 sieht, dauerte es unter den Bedingungen unserer
Versuche 25 bis 30 Min., bis nach Verdunkelung die durch das Licht induzierte
Atmung wieder abgeklungen war. Unter den gleichen Bedingungen untersuchten
wir, wie lange es nach Verdunkelung dauert, bis eine im Licht verbrauchte O2-
Kapazität vollständig wiederhergestellt war. Wir fanden eine „Erholungszeit" von
25 — 30 Min., also die Abklingungszeit der induzierten Atmung.
Bei einem Versuch, der in Protokoll III mit allen experimentellen Einzelheiten
beschrieben ist, wurden 100 mm3 Chlorella (mit der Wellenlänge 644 m// der
Intensität J = 33,4 mm3 Quanten pro ') 1 Min. lang belichtet. Dann wurde ver-
Sauerstoff-Kapazität der Chlorella
283
dunkelt und nach verschiedenen Dunkelzeiten wiederum 1 Min. lang mit der
gleichen Intensität belichtet. Wir fanden, daß nach den verschiedenen Dunkel-
intervallen die folgenden positiven Drucke in 1 Hellminute entstanden:
Tab. 3.
Positive Drucke in 1 Hellminute
Dunkelintervall
(Min.)
im kleinen Gefäß
im großen Gefäß
(mm)
(mm)
5
+ 1,1
-1- 0,5
10
+ 2,5
+ 1,25
15
+ 4,0
- 1,5
20
+ 4,5
+ 2,0
30
+ 5,5
+ 2,5
145
+ 5,5
+ 2,0
Dieser wichtige Versuch ist in Abb. 4 graphisch dargestellt. Er beweist, daß es
die induzierte Atmung ist, die den dissoziierbaren Oo immer von neuem bildet.
Natürlich kann dann bei Mangel an O2 die Oo-Kapazität nicht wiederhergestellt
werden, eine Konsequenz, die sich leicht bestätigen läßt. Man hat dazu nicht nötig,
Abb. 4. Wiederherstellung der O^-Kapazität
im Dunkeln. Abszissen: Dunkelintervalle
zwischen den Belichtungen. Ordinaten: po-
sitive Drucke in der Belichtungszeit (1 Min.).
Daten in Protokoll III.
*6M
S V0
!
.2.0
E
-
_— ^
1
*- +
>/"-
-
/
■
■ /
/
. . ,
1 _
10 15 20 25 30
Minuten dunkel —
7V5
die letzten Spuren von O2 mit gelbem Phosphor aus dem Gasraum zu entfernen,
sondern es genügt, die Zellen mit 10 Vol.-Proz. C02-Argon zu sättigen und so
lange zu warten, z. B. 20 Minuten, bis das Manometer im Dunkeln keine negativen
Drucke mehr anzeigt. Belichtet man dann mit Quantenintensitäten von 30 bis
50 mm3 Quanten pro Minute, so erhält man keine positiven Drucke, während die
positiven Drucke, wieder auftreten, wenn man 10 Vol.-Proz. Kohlensäure-Lz///1
einleitet.
9. Blausäure
Würde HCN die Atmung der Chlorella hemmen, so wäie es nach dem vorigen
Abschnitt selbstverständlich, daß HCN die 02-Kapazität zum Verschwinden
bringt. Tatsächlich hemmt HCN die Atmung der autotrophen Chlorella nicht, und
doch findet man, daß HCN die O^-Kapazität zum Verschwinden bringt.
284
Sauerstoff-Kapazität der Chlorella
Wurde HCN zu Zellen, die in dem Versuchsmedium pH 3,8 suspendiert waren,
hinzugefügt, so wurden die folgenden Atmungswerte und respiratorischen Quo-
tienten gefunden (100 mm3 Zellen in 7 cm3, Gasraum 10 Vol.-Proz. CO2 und
20—30 Vol.-Proz. 02):
Tab. 4.
HCN-
Konzentration
100 mm3 Zellen
verbrauchten
pro Stde. mm3 O2
CO2/O2
0
154
-1,2
0
126
-1,0
n/35000
190
— 1,09
m/10 000
138
-1,0
h/3500
126
-0,95
m/350
130
-1,0
Die Atmung wurde also durch so hohe HCN-Konzentrationen wie w/350 nicht
gehemmt. Dabei verbrannte die HCN nicht merklich, da bei der Verbrennung der
HCN der Quotient CO2/O2 = — 2 hätte sein müssen, während C02/0.2 = — 1
gefunden wurde.
In keiner der angeführten HCN-Konzentrationen wurden bei Belichtung von
100 mm3 Zellen positive Drucke erhalten, in keiner der angeführten HCN-Kon-
zentrationen also war eine 02-Kapazität nachweisbar. Bei der niedrigsten HCN-
Konzentration (n/35000) kamen dabei 0,2 //Mole HCN auf 100 mm3 Zellen. Da
die normale O^-Kapazität von 100 mm3 Zellen 1,2 //Mole O2 ist, so kann die HCN
den dissoziierbaren O2 nicht durch eine zur Kapazität stöchiometrische Reaktion
zum Verschwinden bringen; sondern die Wirkung der HCN muß eine antikata-
lytische sein.
In erster Linie wird man an eine Hemmung der induzierten Atmung denken.
Erinnern wir uns daran, daß wir früher fanden7, daß die durch Zucker induzierte
Atmung der Chlorella durch HCN gehemmt wird ; daß ferner die Blackmansche
Reaktion durch n 10000-Blausäure gehemmt wird8, so ist es mehr als wahrschein-
lich, daß Blausäure die induzierte Atmung hemmt und daß sie dadurch die O2-
Kapazität zum Verschwinden bringt.
Protokoll I. Bestimmung der Sauerstoff- Kapazität der Chlorella
Erster Versuch. 2tägige Zellen. Chlorophyllgehalt 6,4%. Die Zellen wurden 2 mal
in dem Versuchsmedium (Abschnitt 1) gewaschen, dann auf die Konzentration
200 mm3 in 7 cm3 gebracht und in die Manometriegefäße eingefüllt. Die Gefäße
waren: v = 16^ ^ = JQ^ v = 21 ^ ^ = 7j0.
xoo = H' 8,05 — Hx 10,24 (mm3);
xCoz = —H' 11,49 + H 16,57 (mm3).
20°. Schüttelfrequenz 190 pro Minute. Gasraum 10 Vol.-Proz. CO2 in Luft. Die
beobachteten Drucke waren:
Sauerstoff-Kapazität der Chlorella
285
Immer Jupiterlampe
2 mm B.G. 23 in 45 cm
Abstand J = 1,2 (mm3
Quanten pro ').
Großes Gefäß
Kleines Gefäß
H
(mm)
H'
(mm)
/. 644 J = 59,8 1
(mm3 Quanten pro ') |
59,8
59,8
59,8
10' bg*
15' bg
5'bg
2,5' bg
2,5' bg
5,0' bg
5,0' bg
vor
— 9,0
— 2,5
7>51+14
6,5 j
— 2,0
+ 2,0
H+ 12
vor
— 18,0
- 4,0
"14>5 1-24,5]
+ 10,0 j
+ 3,0
+ 3,0
ir+21,5
0,96
*bg = Blaugrün ^ = + 48 mm3
xco2 = — 46 mm3
200 mm3 Zellen enthielten 3,2 mg == 3,56 // Mole = 79,5 mm3 Chlorophyll.
O^-Kapazität 48
Chlorophyll 79,5
0,6.
Immer Jupiterlampe
2 mm G.B. 23 in 45 cm
Abstand. J =-- 1,2 (mm3
Großes Gefäß
Kleines Gefäß
H
H'
Quanten pro ').
(mm)
(mm)
25' bg*
vor
vor
—
5'bg
— 6,0
— 10,0
- /.644J = 37,5
2,5' bg
+ 4,01
+ 7,0)
37,5
2,5' bg
+ 0,5 H - 6 mm
+ 1,0 H' 11,5 mm
37,5
5,0' bg
1,5 |
3,5) xo2 +29,61 __ljQ
5'bg
— 9,0
— 16,5 -Yco^30 1
20' bg
— 17,0
— 32,0
5'bg
4,0
- 7,5
+ A 644 J = 59,5
2,5' bg
+ 5,5 |
+ 10
59,5
2,5' bg
1,0 H + 6,0
+ 3,5j H' 12,0
l,5Uo2 -33,5) ,_j 08
J .x-coo-36,0 1 '
59,5
5,0' bg
- 0,5 J
*bg = Blaugrün
200 mm3 Zellen enthielten 1,17 mg
Mittel der O-2-Kapazität 31,5 mm3
1,305// Mole = 29,2 mm3 Chlorophyll
Oi-Kapazität 31,5
Chlorophyll 29,2
1,08
Zweiter Versuch, ltägige Zellen. Chlorophyllgehalt 2,34%. Vermehrung von 15 auf
142 mm3. Alles übrige wie im ersten Versuch. Die beobachteten Drucke sind aus
der obenstehenden Tabelle ersichtlich.
Man beachte, daß die stationäre Photosynthese bei kleinen Lichtstärken wegen
der großen Atmung negativ ist und dann zu den positiven Drucken der ersten
5 Min. addiert werden muß, während bei größeren Lichtstärken die stationären
Drucke positiv sind und deshalb von den positiven Drucken der ersten 5 Min. abge-
zogen werden müssen.
286
Sauerstoff-Kapazität der Chlorella
Protokoll II (Versuch vom 5. 5. 1954). Bestimmung des Quantenbedarfs der Photo-
dissoziation
2tägige Chlorella-Kultur. Saat 30, Ernte 714 mm3 Zellen. 2 mal in dem Versuchs-
medium (s. Abschn. 1) gewaschen und dann auf 100 mm:5 Zellen pro 7 cm3 kon-
zentriert. Die Absorption des Meßlichts wurde in der Ulbrichtschen Kugel be-
stimmt und betrug 97 Prozent. Es wurde ohne Unterbrechung mit Blaugrün be-
Tabelle 5
mm Brodie
I/99 der
Kleines Gefäß
Großes Gefäß
Photodissoziation
5'*bg
— 3,5
— 2,5
26'bg
20,5
-11,0
+ 5,5 + 2,5
5'bg
3,5
1,5)
2,5 \
0,7 0,3
rix' 1'
+ 5,5
1,0 0,45
5'bg
- 6,5
3,0 )
1,3 0,60
H' 8,5 H +3,85
5'bg
5,5
2,5
X02 + 29 XCO2 — 33.8
y— 1,17 ll die 02-Kapazität beliebig oft ausgetrieben werden kann, wenn
man in Dunkelintervallen genügend Zeit zur Nachbildung der Kapazität gibt.
Ein Versuchsbeispiel ist in Abb. 1 graphisch dargestellt, in der die beobachteten
Druckänderungen als Funktion der Hell- und Dunkelzeiten eingezeichnet sind.
Zunächst wurden die Zellen in einem Manometriegefäß mit 10 Vol.-Proz. CO2 in
Argon gesättigt, 21/2 Stdn. im Thermostaten bei 20° bewegt. Dann wurde 5 Min.
belichtet. Wie man aus der Abbildung sieht, entstanden im Licht in summa keine
Drucke ; und es entstanden beim Verdunkeln nur minimale negative Drucke. Wurde
dann das 02-freie Gasgemisch ersetzt durch 10 Vol.-Proz. CO2, 30 Vol.-Proz. O2
und 60 Vol.-Proz. Argon und nach 30 Min. Atmung im Dunkeln genau wie vor-
2 3 V 5 6
7 8 9 10 11 12 '3 n IS
Minuten *■
Abb. 1. Beobachtete Druckänderungen
in mm Brodie. Anaerob,
aerob. 100 cmm Chlorella.
v == 15,764 ccm; w == 7,00 ccm 20°.
„Hell" bedeutet, daß grünes Licht der
Intensität J = 28,6 cmm Quanten pro
Minute eingestrahlt und 0,9 28,6
cmm Quanten absorbiert wurden.
pH == 3,8. Versuch vom 26. 7. 1955.
her belichtet, so stieg nunmehr der Druck in den 5 Hellminuten um 9,5 mm; und
bei Verdunkelung erschien eine Atmung, die 2 ] /2-mal so groß war wie die Atmung
vor der Belichtung.
Derartige Versuche bestätigten die paradoxen Erfahrungen von Pringsheim3
und von Willstaetter4 und Stoll, daß bei der Photosynthese O2 vorhanden sein
muß, damit O2 entwickelt werden kann. Darüber hinaus lehren sie, warum dies so
ist und wieviel O2 vorhanden sein muß. Nach unseren Gleichungen müssen min-
destens 2/3 der (^-Kapazität vorhanden sein, also zum Beispiel etwa 20 cmm, wenn
ein Manometriegefäß, wie üblich, 100 cmm Chlorella enthält. Es sind also durchaus
nicht „Spuren" von O2, die nötig sind, sondern Mengen, die zu den angewandten
Zellmengen in einem stöchiometrischen Verhältnis stehen. Deshalb ist es bei der-
artigen Versuchen nicht notwendig, den O2 mit chemischen Mitteln wie Phosphor
zu entfernen, gegen die man einwenden könnte, daß sie giftige Nebenwirkungen
ausüben.
Es ist kaum notwendig zu erwähnen, daß die (^-Kapazität der Chlorella nicht
wie die 02-Kapazität der roten Blutzellen durch Erniedrigung des (>2-Drucks aus-
getrieben werden kann. Es ist aber möglich, daß die (^-Kapazität der Chlorella
durch ihre eigene normale Atmung verbraucht werden kann.
Versuche über die Sauerstoff- Kapazität der Chlorella 291
2. Phenanthrolin
Phenanthrolin5 hemmt in sehr kleinen Konzentrationen die Photosynthese,
woraus hervorgeht, daß an der Photosynthese ein dissoziierbares Schwermetall
beteiligt ist. Phenanthrolin hemmt nicht die Atmung der Chlorella, auch nicht ihre
induzierte Atmung, wie man zeigen kann, indem man in einem Manometriegef äß
mit Birne, die (^-Kapazität durch Licht austreibt, dann aus der Birne Phenan-
throlin einkippt und anschließend verdunkelt. Dann erscheint die induzierte
Atmung wie in der Kontrolle, zu der kein Phenanthrolin zugegeben worden ist.
Läßt man andererseits — ohne Phenanthrolin — im Dunkeln die 02-Kapazität
entstehen, fügt dann Phenanthrolin hinzu und belichtet, so erhält man keine
positiven Drucke. Phenanthrolin vernichtet also entweder eine vorhandene Kapazi-
tät, oder es verhindert die photochemische Austreibung der Kapazität.
Ein Versuchsbeispiel ist in Abb. 2 graphisch dargestellt, in der die beobachteten
Druckänderungen als Funktion der Dunkel- und Hellzeiten eingezeichnet sind.
Zunächst wurde die O^-Kapazität der Chlorella — ohne Phenanthrolin — durch
Licht entwickelt. Dann wurde wieder verdunkelt. War die induzierte Atmung ab-
geklungen, so wurde Phenanthrolin bis 1/ioo-w. zugesetzt und wieder belichtet.
Nunmehr trat im Licht keine wesentliche Druckänderung auf, sondern der von der
Atmung herrührende negative Druck ging fast unverändert im Licht weiter und
blieb auch bei Verdunkelung unverändert.
Bekanntlich wird von James Franck und seinem Anhang bestritten, daß eine
O-2-Kapazität und eine induzierte Atmung der Chlorella existiert, mit der Be-
gründung, die beobachteten manometrischen Effekte rührten von Erwärmung und
Abkühlung her. Nichts könnte diese unwissenschaftliche Behauptungen besser
widerlegen als die Versuche der Abb. 1 und 2, bei denen trotz Belichtung und Ver-
dunkelung keine Druckänderungen auftreten, wenn man den Ablauf chemischer
Reaktionen in der Chlorella hemmt.
3. Chlorophyll
Wie in der Einleitung erwähnt, ist das Verhältnis
O-2-Kapazität
Chlorophyllgehalt
bei nicht zu hohen Chlorophyllgehalten nahezu gleich eins. Es ist daraus zu schlie-
ßen, daß der Träger des photodissoziierbaren O2 stöchiometrisch mit dem Chloro-
phyll verbunden ist. Dann ist die Entwicklung des O2 bei der Photosynthese nichts
anderes als die Photodissoziation eines Pigments, vergleichbar der Photodissozia-
tion des Kohlenoxyd-Häms
FeCO + 1 hv = Fe + CO,
und es verschwindet aus der Photosynthese die unklare „Photosensibilisierung",
durch die bisher das Chlorophyll-Molekül die absorbierte Lichtenergie auf andere
Moleküle übertragen sollte.
Energieübertragung innerhalb eines Moleküls dagegen ist in der Biophysik eine
wohlbekannte und quantitativ untersuchte Erscheinung, seit die Proteinbande der
292
Versuche über die Sauerstoff- Kapazität der Chlorella
Kohlenoxyd-Eisenoxygenase durch ihr ultraviolettes Wirkungsspektrum entdeckt
worden ist6.
Die Einführung des Chlorophylls in unsere Gleichungen hat den weiteren Vor-
teil, daß wir sofort verstehen, warum und in welchem Maße die photochemische
Ausbeute im Verlauf der Austreibung der O-i-Kapazität abnimmt1. Denn nunmehr
gibt es zwei Arten von lichtabsorbierenden Molekülen, Chlorophyllmoleküle, die
mit photodissoziierbarem O2 verbunden sind, und Chlorophyllmoleküle, die nicht
mit O2 verbunden sind. Nur Licht, das von den mit O2 verbundenen Chlorophyll-
molekülen absorbiert wird, kann photochemisch wirksam sein; während der
andere Teil des Lichts photochemisch verlorengeht — genau wie bei der Photo-
dissoziation des Kohlenoxyd-Häms.
1
6
4
V
k
>»
>*
&,
x
*>
**
V
>
>
1
'
'
Abb. 2. Beobachtete Druckänderungen in mm
Brodie. ohne Phenanthrolin,
?»/100-Phenanthrolin. 100 cmm
Chlorella, v = 15,764 ccm, vf == 7,00 ccm.
20". „Hell" bedeutet, daß grünes Licht der
Intensität J = 17,4 cmm Quanten pro Minute
eingestrahlt und 0,88 • 17,4 cmm Quanten
absorbiert wurden. pH 3,88. Gasraum
10 Vol.-Proz. CO2, 30 Vol.-Proz. 02, 60 Vol.-
Proz. Argon. Versuch vom 15. 7. 1955.
0 2
6 8 7Q 12
W iß W
Minuten
20 22
a
Mathematisch ist dieses Ergebnis folgendermaßen zu formulieren:
Es sei:
K = O-2-Kapazität Chlorophyllgehalt (cmm),
x = nach t Min. ausgetriebene Kapazität = nicht mit O2 verbundenes Chlorophyll (cmm),
K — x = nach r Min. vorhandene Restkapazität - mit O2 verbundenes Chlorophyll,
J = eingestrahlte Intensität (cmm Quanten pro Minute),
a = Bruchteil von y, der insgesamt absorbiert wird,
K x
-- Bruchteil von y, der zur Zeit t von dem mit O2 verbundenen Chlorophyll absorbiert wird.
K
— Quantenbedarf f C1T n Quanten)3
^ der Oi-Entwicklung
cmm O2,
Dann beträgt die in der kleinen Zeit dt absorbierte Lichtmenge
y ■ a dt cmm Quanten,
und es beträgt die in der kleinen Zeit dt entwickelte 0_>-Menge
K—x
y-a
also
, 60% Argon, so erhält man bei Zugabe von Fluorid außer der funk-
tionellen Kohlensäure auch andere Kohlensäure, insgesamt statt 1 Mol pro Mol Chlorophyll
etwa 1,8 Mole CO2, aber nur 1 Mol davon ist mit 10~4 nHCN glatt hemmbar.
Stöchiometrische Kohlensäureentwicklung im Licht*
Da, wie bereits im Text erwähnt, die katalytisch wenig wirksamen Zellen ebensoviel funktionelle
Kohlensäure enthalten wie die katalytisch hochwirksamen Zellen, so kann es nicht die Bindung
* Zusatz 1961. Diese Absätze sind heute zu streichen.
304
Über den chemischen Mechanismus der Kohlensäureassimilation
der Kohlensäure sein, durch die sich die wenig wirksamen und die hochwirksamen Zellen unter-
scheiden, sondern es muß die Wirkung des Lichts auf die gebundene Kohlensäure sein. Tatsäch-
lich entwickeln Zellen, die katalytisch 12 Quanten pro Mol Sauerstoff benötigen, bei der stöchio-
metrischen Anordnung nicht 1 Mol, sondern nur 1U Mol Sauerstoff pro Mol Chlorophyll. Sie
entwickeln aber neben dem !/4 Mo1 Sauerstoff außerdem 3/4 Mole Kohlensäure im Licht. Addiert
man also Sauerstoff- und Kohlensäureentwicklung (im Licht), so erhält man wieder 1 Mol Gas
pro Mol Chlorophyll. Dieses interessante quantitative Ergebnis zeigt, daß diejenige gebundene
Kohlensäure, die aus irgendwelchen Mangelgründen im Licht keinen Sauerstoff entwickeln kann,
durch Licht von dem Chlorophyll wieder abgespalten wird.
Züchtung der Zellen
Aussaat: 0,1 mm3 Zellen pro cm3 Kulturlösung. Ernte nach 24 Stunden: 3 mm3 Zellen pro cm3
Kulturlösung.
Literatur
1 Calvin, M., Z. angew. Chem. 68 (1956), 253.
2 Vgl. dazu O. Warburg und G. Krippahl [Z. Natur-
forsch. 10b (1955), 301], wo gezeigt wird, daß die Hill-
Reaktion in lebender Chlorella durch eine C02-Kata-
lyse zustande kommt.
3 Arnon, D., Nature (London) 172 (1953), 1039; und
allgemein. Amer. J. Bot. 25 (1938), 322.
4 Warburg, O., und Schröder, W., Z. Naturforsch. 10 b
(1955), 639.
5 Burk, Dean, und Warburg, O., Z. Naturforsch. 6b
(1951), 12. O. Warburg, Z. Elektrochem. 55 (1951),
447.
6 Warburg, O., und Krippahl, Günter, Z. Natur-
forsch. IIb (1956), 52.
7 Warburg, O., und Krippahl, G, Z. Naturforsch. IIb
(1956), 179.
8 Willstätter, R., und Stoll, A., Untersuchungen
über die Assimilation der Kohlensäure. Berlin: Sprin-
ger 1918.
9 Conant, James, B., J. Amer. Chem. Soc. 53 (1931),
359, 1615, 2382, 3171.
10 Warburg, O., Krippahl, G., und Schröder, W., Z.
Naturforsch. 9b (1954), 164, 667; 10b (1955), 631.
11 Warburg, O., Naturwiss. 42 (1955), 449.
31b Über die C02-Kapazität der Chlorella und den chemischen
Mechanismus der C02- Assimilation*
Von Otto Warburg und Günther Krippahl
Belichtet man vorher verdunkelte Chlorella, so wird pro Molekül Chlorophyll
1 Mol. O, ausgetrieben (CU)0t + 1 hr = (Chl) + 0&
wo hv die Lichtquanten bedeuten, die von dem mit O2 verbundenen Chlorophyll
absorbiert werden, wie bei der Spaltung des Kohlenoxyd-Häms
FeCO + 1 hv = Fe + CO.
Ist der photodissoziierbare Oj ausgetrieben, so kann er im Dunkeln durch die
Energie der induzierten Atmung wieder ersetzt werden. Verhindert man jedoch
durch Entziehung des O2 die induzierte Atmung, so bleibt die Erholung aus, und
man erhält bei einer folgenden Belichtung keinen Sauerstoff1.
Beim experimentellen Ausbau dieser Ergebnisse haben wir folgendes gefunden :
1. Zum Wiederaufbau der O-2-Kapazität im Dunkeln ist nicht nur O2, sondern
auch CO2 notwendig, Entzieht man nach Austreibung der 02-Kapazität im Licht
der Chlorella die Kohlensäure, so wird trotz Anwesenheit von Sauerstoff im
Dunkeln keine (>2-Kapazität nachgebildet. Zum Beispiel wurde nach einer Dunkel-
zeit von 20 Minuten bei Belichtung von 100 cmm Chlorella eine Entwicklung von
20 cmm oder von 0 cmm O2 gefunden, je nachdem in der Dunkelzeit der CO2-
Druck 1/io Atmosphäre oder 0 betrug.
2. Gibt man Chinon im Dunkeln zu einer Suspension von Chlorella (in Kultur-
lösung), so wird Kohlensäure ausgetrieben, und zwar 1 Mol. pro Mol. Chlorophyll.
Enthielten zum Beispiel 200 cmm Chlorella, suspendiert in 3 ccm Lösung pH 3,9,
3,37 //Mole Chlorophyll und wurden 2 mg Chinon zugegeben (Gasraum Argon),
so wurden in 60 Minuten 69 cmm CO2 (= 3,1 //Mole) ausgetrieben. Diese Aus-
* Aus Zeitschrift für Naturforschung IIb (1956): 52.
Zusatz 1961. Als wir fanden, daß Chlorella große Mengen Kohlensäure mit
Hilfe der Atmung schnell chemisch binden kann und daß die gebundene Menge
in geeignet gezüchteten Zellen nahezu dem Chlorophyll äquivalent ist, nahmen wir
zunächst an, daß diese Kohlensäure von dem Kohlenstoffatom 10 des Chlorophylls
gebunden werde. Wir haben diese Annahme bald zurückgenommen (vergl. die
folgende Arbeit), weil Gewitz und Völker feststellten, daß der Gehalt des Chloro-
phylls an Chlorin während der Bindung der Kohlensäure konstant bleibt; und
daß die Glutaminsäure die Quelle der Kohlensäure ist. Trotzdem haben wir die
Diskussion über das Kohlenstoffatom 10 in diese Sammlung aufgenommen, weil
es noch unentschieden ist, ob das Kohlenstoffatom 10 des Chlorophylls nicht doch
wenn auch in anderer Weise, funktionell im Mechanismus der Photosynthese ist;
und weil die Bindung der Photolyten an das Chlorophyll sich bestätigt hat.
20 Warburg, Zellphysiologie
306 Über die COo-Kapazität der Chlorella und den chemischen Mechanismus usw.
treibung wird durch 10~5-«. HCN wesentlich und durch 10~4-«. HCN vollstän-
dig gehemmt. Wir nennen die durch Chinon austreibbare CO.» die CO-2-Kapazi-
tät der Chlorella.
3. Nach der Austreibung der CO-2-Kapazität aus Chlorella durch Chinon im
Dunkeln ist die Wirkung des Lichts auf die CO 2 vollständig verschwunden, aber
die Wirkung des Lichts auf das Chinon erhalten. Die ihrer CO2 beraubte Chlorella
verhält sich also im Licht wie die isoliertengrünen Grana,oder, anders ausgedrückt:
die chemisch gebundene CO2 ist nicht an der Chinon-Reduktion beteiligt.
4. Aus isolierten Grana kann durch Chinon keine CO2 ausgetrieben werden.
5. Noch schneller als durch Chinon wird die COo-Kapazität der Chlorella im
Dunkeln durch Milchsäure ausgetrieben, wobei man am besten beim CÜ2-Druck
0 arbeitet, um keine Bicarbonat-CO-2 in den Zellen zu haben. Auch diese Austrei-
bung der CO2 wird durch 10 ~5-n. HCN wesentlich und durch 10 ~4-n. HCN voll-
ständig gehemmt. Zum Beispiel gaben wir 0,2 ccm 2-n. Milchsäure zu 200 ccm
Chlorella, suspendiert in 3 ccm Kulturlösung (Gasraum Argon), und erhielten
dann (bei pH 2,7) in 20 Minuten, nachdem der Endwert erreicht war, 3,16 Mole
CO2, während die 200 cmm Zellen 3,37 //Mole Chlorophyll enthielten. \-n. H2SO4
jedoch, die das Magnesium abspaltet, treibt keine CO2 aus, da sie die Fermente
zerstört.
6. Erhitzt man eine Chlorella-Suspension 7 Minuten auf 63°, wobei die Sus-
pension ihr Aussehen nicht ändert, und gibt dann zu dieser erhitzten Suspension
Chinon oder Milchsäure, so wird keine CO2 ausgetrieben. Es folgt daraus, ebenso
wie aus der Antikatalyse der Blausäure, daß an der Austreibung der C02-Kapazität
Fermentreaktionen beteiligt sind.
7. Chlorophyll, in Alkohol gelöst, absorbiert in alkalischer Lösung, wie Conant
1931 fand2, 1 Mol. Sauerstoff. Wir fanden, daß das in Chlorella gebundene Chlo-
rophyll, in wäßriger Suspension, sich entsprechend verhält. Suspendiert man 200
cmm Chlorella in 3 ccm Wasser, erhitzt die Suspension 7 Minuten auf 63° und
gibt (Gasraum Luft) bei 20° 50 mg LiOH hinzu, so wird im Verlauf von 40 Minu-
ten 1 Mol. O2 pro Mol. Chlorophyll absorbiert. Man kann also die „Conantzahl"
des Chlorophylls der Chlorella bestimmen, ohne das Chlorophyll zu isolieren.
Aus unseren Experimenten schließen wir, daß die C02-Assimilation auf chemi-
schen Zwischenreaktionen des Chlorophylls beruht. Von der Chlorophyllformel
interessiert dabei nur der halbfett gedruckte Teil, das ist ein Teil des geöffneten
isocyclischen Rings Fischers, den Conant2 bereits 1931 in der hier benutzten
Form geschrieben hat.
I
CH II
CH
CH
IV
III |
[10]
CHOH
[111
COOH
Über die CO-2-Kapazität der Chlorella und den chemischen Mechanismus usw. 307
An diesem Teil des Chlorophylls sollen sich die folgenden Reaktionen abspielen:
1 . Reduktion der CO, : = c
= C— + C02 + H20
I
CHO
I /OH
| XOH
COOH
= C-
OH
c< - o
| XOH
COOH H2
= C—
OH
= C—
| xOOH
CHO
2. Reduktion des Chinons:
= C—
CHOH + 2 Chinon + 2 H20
COOH
=c-
OOH
OH
COOH
C< - H20
vOOH
CHO
=c—
I /H
C{ - 02 + COH>
xo
=c—
I .OOH
C<^ 2 Hydrochinon
| xOH
COOH
= C—
1 /H
c< - Oo
| xOH
COOH
oder dasselbe nach Abspaltung der COi.
Auch die induzierte Atmung bei der COo-Assimilation wird durch unsere
Formeln chemisch erklärt. Wenn der 02 im Licht abgespalten worden ist, so muß,
damit der Anfangszustand wiederhergestellt wird, der reduzierte Kohlenstoff in
Stellung [11] sich ablösen und durch neue Kohlensäure ersetzt werden, was chemi-
sche Arbeit erfordert. Diese Arbeit wird dadurch gewonnen, daß in anderen belich-
teten Chlorophyllmolekülen der 02 seinen ganzen Weg zurückreagiert und dabei
— CHO zu —COOH zurückoxydiert. Die bei dieser Oxydation freiwerdende
Energie wird dann als ATP oder in anderer Form für die Fixierung der COi zur
Verfügung gestellt.
Von allen Assimilationstheorien der Vergangenheit kommt hiernach dem tat-
sächlichen Sachverhalt am nächsten die Peroxyd-Theorie von Willstaetter und
Stoll3, die zu einer Zeit aufgestellt wurde, als die chemische Konstitution des
Chlorophylls noch unbekannt war und als die Photodissoziation des 02 und die
induzierte Atmung noch nicht entdeckt worden waren. So fehlte in der Theorie
von Willstaetter und Stoll das Zusammenwirken von Atmungs- und Licht-
energie, und es fehlte näheres über den Ort der Peroxydbildung im Chlorophyll-
molekül. Erst durch Fischer4, vor allem aber durch Conant2 und seine Arbeiten
über die Allomerisation des Chlorophylls, ist es möglich geworden, den Ort der
Peroxydbildung im Chlorophyllmolekül anzugeben.
308 Über die CO^-Kapazität der Chlorella und den chemischen Mechanismus usw.
Aus unsern Gleichungen folgt, daß es in assimilierenden grünen Zellen 3 Arten
von Chlorophyll gibt: solche, die an Stelle [11] einCarboxyl tragen; solche, deren
[ll]-Carboxyl reduziert ist; und solche, deren [ll]-Stelle frei ist. Es ist in diesem
Zusammenhang interessant, daß die Chlorophyll-Präparate vonFiscHER5, auch
wenn sie kristallisiert waren, zu seinem Leidwesen oft erhebliche Mengen von
„Pyro-Chlorophyll" enthielten, das ist Chlorophyll, das an Stelle [11] das Carboxyl
abgespalten hat ; und daß seine Chlorophyll-Derivate oft erhebliche Mengen Pur-
purin enthielten, das ist ein Chlorophyll-Derivat, das in [10]-Stellung oxydiert ist.
Es ist hier ferner interessant, daß Clendenning6 30 Sekunden nach Belichtung
von Chlorella in 14CO-2 in der Lipoidfraktion (die das Chlorophyll enthält), Radio-
aktivität fand. Es sei ferner hervorgehoben, daß nach unseren Gleichungen der
gesamte im Licht dissoziierende O2 aus dem Wasser stammt; daß man aber die
Gleichungen leicht so ändern kann, daß die Hälfte des abgespaltenen O2 aus dem
Wasser und die Hälfte aus der C02 stammt.
Hierbei ist Chlorophyll die prosthetische Gruppe eines Ferments, das durch
chemische Zwischenreaktionen katalytisch wirkt. Aber die chemischen Reaktionen
in diesem Ferment sind ihrerseits wiederum Fermentreaktionen, und so ist Raum
für die Wirkung des Carotinoido-Ferments (das durch sein Wirkungsspektrum
entdeckt worden ist) und für die Schwermetallfermente (die durch das Phenan-
throlin und die Blausäure entdeckt worden sind). Auch ist Raum für eine mögliche
Beteiligung der Phosphorsäure, wenn man in [11] die Bildung von Acylphosphat an-
nimmt und erst dann die Reduktion vor sich gehen läßt nach Analogie der Oxy-
dationsreaktion der Gärung,;a. — Was das Endprodukt anbetrifft, so wird heute,
nachdem Horecker die universelle kondensierende Wirkung der Zymohexasen
nachgewiesen hat, niemand mehr nach Formaldehyd suchen. Im übrigen könnte
in [11] nicht nur Kohlensäure, sondern auch Oxalsäure angelagert werden, bei deren
Reduktion dann die von Tolbert7 gefundene Glykolsäure entstehen würde. Doch
sind dies, wie auch die Frage der Beteiligung der Phosphorsäure, zunächst un-
wichtige Einzelheiten gegenüber dem Hauptergebnis: daß die CO2- Assimilation
auf einer Wechselwirkung zwischen den C- Atomen [10] und [11] des Chlorophylls
beruht, bei der [10] oxydiert und [11] reduziert wird.
Unsere Gleichungen erfüllen ferner eine Forderung, die wir seit 1944, seit der
Entdeckung der Chinonreaktion8 in den isolierten grünen Grana, immer gestellt
haben: daß die photochemische O-2-Entwicklung bei der Reduktion der Kohlen-
säure und des Chinons aus der gleichen Substanz, durch den gleichen Mechanismus
erfolgen muß. Tatsächlich unterscheiden sich Grana und intakte Zellen nur da-
durch, daß in den Grana die Fermente fehlen, die für die Wechselwirkung zwi-
schen den C-Atomen [10] und [11] verantwortlich sind.
Schließlich ist durch unsere Gleichungen die Photosensibilisierung aus der
C02-Assimilation eliminiert worden und damit alles, was mit Radikalen, aktiven
Zuständen und Lebensdauern zusammenhängt. Denn nunmehr wirkt die Licht-
energie in demselben Molekül, in dem sie absorbiert wird.
Über die COo-Kapazität der Chlorella und den chemischen Mechanismus usw.
309
Literatur
1 Warburg, O., Krippahl, G., Schröder, W., und 5 Fischer, H., und Riedmair, I., Liebigs Ann. Chem.
Buchholz, W., Z. Naturforschg. 9b (1954), 769; 506 (1933), 107^ ,..,,,.. _,
O Warburg, und W. Schröder 10b (1955), 639. 6 Clendenning, K. A., Arch. Biochemistry 27 (1950), 75.
2 Conant, J. B., J. Amer. chem. Soc. 53 (1931), 359, 6a Warburg, O., Biochem. Z. 303 (1939), 40.
1615, 2382, 3171; Science (New York) 73 (1931), 268. 7 Tolbert, N. E., Fed. Proc. 14 (1955), 292.
3 Willstaetter, R , und Stoll, A., Untersuchungen 8 Warburg, O., und Lüttgens, W., Naturwissenschaften
über die Assimilation der Kohlensäure, Berlin 1918. 32 (1944), 161, 301; O. Warburg, Heavy Metals,
4 Fischer, H., und Stern, A., Chemie des Pyrrols, Clarendon Press, Oxford 1949.
Band II, 2, Leipzig 1940.
31c Über die funktionelle Carboxylgruppe des Chlorophylls'
Von Otto Warburg und Günter Krippahl
Wie wir vor kurzem mitgeteilt haben1, enthält das Chlorophyll lebender Chlorella
eine Carboxylgruppe, deren Sauerstoff bei Belichtung über ein Chlorophyllperoxyd
als molekularer Sauerstoff abgespalten wird. Wir haben nunmehr gefunden, daß
man diese „funktionelle" Carboxylgruppe des Chlorophylls, ohne die Chlorella zu
töten oder zu schädigen, durch Natriumfluorid abspalten kann. Dabei erscheint
pro Mol Chlorophyll 1 Mol CO2, und zwar um so schneller, je größer die Konzen-
tration des Fluorids ist. 4 • 10_3-w. Fluorid treibt die CO2 in etwa 20 Minuten aus.
Zum Beispiel gaben wir in den Hauptraum eines Manometriegefäßes (v = 87,7
ccm) 1500 cmm Chlorella, suspendiert in 25 ccm Salzlösung (pH 3,8); in die An-
satzbirne 1 ccm «/10-Natriumfluorid, mit H2SO4 auf pH 3,8 angesäuert; in den
Gasraum Argon. Wurde dann das Fluorid in den Hauptraum gegeben, so erschie-
nen bei 20° die folgenden Mengen an CO2: nach 5 Minuten 354 cmm, nach 10' 527
cmm, nach 15' 580 cmm, nach 20' 592 cmm, als Endwert also 26,4 //Mole CO2,
während die Chlorophyllbestimmung 27,2 //Mole Chlorophyll ergab. Wurde das
Chlorophyll aus den Zellen durch Ausbleichen im Licht entfernt, so entwickelte
Fluorid keine CO2. Wurde der Chlorophyllgehalt der Chlorella, durch Variation
ade Lichtstärke bei der Zucht, im Verhältnis 1 : lj-i : lli variiert, so standen die
ursgetriebenen C(>2-Mengen im gleichen Verhältnis, wodurch bewiesen wurde,
daß die durch Fluorid austreibbare CO2 aus dem Chlorophyll stammt.
Die Austreibung der C02 durch Fluorid wird durch 10 4-«. HCN fast voll-
ständig gehemmt. Erhitzt man die Chlorella-Suspension 5 Minuten auf 65° oder
trocknet man die Suspension in gefrorenem Zustand, so wird bei Zugabe von
Fluorid keine CO2 ausgetrieben. Die Austreibung ist also ein eng mit dem Leben
zusammenhängender Vorgang. Wäscht man nach der Austreibung der CO2 das
Fluorid fort, so wird — falls Sauerstoff zugegen ist — abgespaltene CO2 wieder
aufgenommen. Bestimmt man dabei die Wirkung des Lichts unter linearen Inten-
sitätsbedingungen, so zeigt sich, daß die Lichtwirkung in dem Maß verschwindet,
als die CO2 ausgetrieben ist, und in dem Maß wieder erscheint, als die CO2 wie-
der gebunden wird. Wurden die mit Fluorid behandelten Zellen weitergezüchtet,
so wurden keine wesentlichen Wachstumshemmungen gefunden.
Gewitz und Voelker isolierten nach Austreibung der CO2 durch Fluorid das
Chlorophyll und bestimmten darin das Chlorin e, dessen Menge dem Carboxyl [11]
des Chlorophylls proportional ist. Sie fanden keinen Unterschied, ob die CO2
vorher durch Fluorid ausgetrieben war oder nicht, woraus hervorgeht, daß die
funktionelle Carboxylgruppe nicht die Carboxylgruppe [11] des Chlorophylls sein
kann:
Aus Zeitschrift für Naturforschung IIb (1956): 179.
Über die funktionelle Carboxylgruppe des Chlorophylls 311
= C—
[10] CHOH
[11] COOH
Chlorophyll muß also im Leben eine weitere Carboxylgruppe enthalten,* die bis-
her in der Chlorophyllformel nicht verzeichnet ist und von der wir vermuten, daß
sie neben Carboxyl [11] an C-Atom [10] gebunden ist. Dann wäre der chemische
Mechanismus der CO-2- Assimilation :
=c— =c—
Licht**
[10] C— OH ► C— OOH -»
/\ /\
[11] COOH COOH [12] COOH COH
= C—
dunkel***
C— H + O2 ► +C02 + H20 =
COOH COH
= C—
C— OH + CH2O
/\
COOH COOH
Die funktionelle und labile Carboxylgruppe in [12] würde manches erklären, was
nach unsrer vorigen Mitteilung noch unklar war. Sie würde erklären, warum be-
reits Druck auf ein Blatt oder warum Trocknen die CO2- Assimilation zum Ver-
schwinden bringt. Sie würde ferner erklären, warum das Chlorophyll nicht im
Leben, aber nach der Extraktion aus den grünen Zellen autoxydabel ist : weil die
nach Conant2 zur Autoxydation notwendige Konfiguration — CHOH — COOH erst
bei der Extraktion des Chlorophylls, bei der Abspaltung von [12], entstehen würde.
Literatur
1 Warburg, O., und Krippahl, G., Z. Naturforschg. IIb (1956), 52.
2 Conant, J. B., Science (New York) 73 (1931), 268.
* Zusatz 1961. Diese Mitteilung, die 6 Wochen nach der Arbeit Nr. 31b er-
schien, enthält die Entdeckung der funktionellen Kohlensäure und ihrer reversibeln
Austreibung durch Fluorid, aber noch nicht die Entdeckung der Glutaminsäure
und ihrer Funktion bei der Photosynthese. Mit der Entdeckung der funktionellen
Kohlensäure war die Theorie widerlegt, daß die funktionelle Kohlensäure die
Carboxylgruppe (11) der Hans FiscHERschen Chlorophyllformel ist. Eine halb-
richtige Theorie, deren Fehler sehr schnell zurückgenommen wurde, hat so auf
den richtigen Weg geführt.
** Erfordert etwa 40000 cal.
*** Mit Hilfe der Energie der induzierten Atmung. Erfordert etwa 60 000 cal.
32 Wirkung von Vanadium auf die Photosynthese*
Von Otto Warburg, Günther Krippahl und Wolfgang Buchholz
Vanadium wirkt bei der Photosynthese als Katalysator der Kohlensäure-Reduktion.
Wie Arnon1 gefunden hat, ist Vanadium zum autotrophen Wachstum von
Chlorella notwendig. Bei unsern Versuchen, die Bedingungen festzulegen, unter
denen Chlorella das Licht maximal ausnutzt, haben wir unserm üblichen Salz-
medium Arnons „Microelemente A" zugesetzt — Eisen, Mangan, Zink, Kupfer,
Molybdän und Bor — und außerdem Vanadium oder kein Vanadium. 30 cmm
Chlorella wurden dabei in 250 ccm eingesät. Die Ernte nach 24 Stdn. betrug 250
cmm und nach 48 Stdn. etwa 500 cmm. Lichtquelle war eine 200-Watt-Metall-
fadenlampe. Die Züchtungstemperatur war 25°. Der Kohlensäuredruck bei der
Züchtung betrug 1/2o Atmosphäre.
Wir fanden bei der hohen Lichtstärke der Züchtung mit und ohne Vanadium in
48 Stdn. nahezu das gleiche Wachstum. Anders bei den niedrigeren Lichtstärken,
bei denen der Quantenbedarf gemessen wurde. Wurden in das Meßgefäß 50 cmm
Quanten der Wellenlänge 546 m// pro Minute eingestrahlt, unter Zusatz des not-
wendigen blaugrünen Lichts, so war die Ausbeute an Sauerstoff sehr schlecht,
wenn die Chlorella ohne Vanadiumzusatz gezüchtet worden war; und das Verhält-
nis y == CO2/O2 war sehr niedrig, das heißt, es wurde viel weniger Kohlensäure
absorbiert, als Sauerstoff entwickelt. Wurde dann so viel Vanadium zugesetzt, daß
die Vanadiumkonzentration 2 10 '> molar war, so stieg sofort die Ausbeute an
Sauerstoff, und es wurde sofort eine dem Sauerstoff etwa äquivalente Menge an
Kohlensäure absorbiert, zum Beispiel :
Ohne Zusatz von Vanadium in 30': .vo2 +12 cmm; .tcc>2 - 2 cmm,
+ 2 10 8 molar Vanadium in 30': .\ro2 + 55 cmm; XCO2 — 64 cmm.
Das Vanadium wurde dabei als öwertiges Vanadium, als gelbes Na-Salz der
Säure HVO3, zugesetzt. Wurde statt dessen das blaue Vanadylsulfat zugesetzt, in
dem das Vanadium 4wertig ist, so wurden keine Wirkungen des Vanadiums beob-
achtet. Um diese Unterschiede festzustellen, müssen die Lösungen frisch bereitet
werden, da an der Luft in Lösungen von Vanadylsulfat auf die Dauer öwertiges
Vanadium entsteht.
Aus der sofortigen Wirkung des zugesetzten Vanadiums auf das Verhältnis
CO2/O2 folgt, daß es von den Teilvorgängen der Photosynthese die Reduktion der
Kohlensäure ist, an der das Vanadium beteiligt ist.
*Aus Zeitschrift für Naturforschung 10b (1955): 422.
Literatur
1 Arnon, D., Nature (London) 172 (1953), 1039
33 Photochemische Wasserzersetzung durch lebende Chlorella*
Von Otto Warburg und Günther Krippahl
Lebende Chlorella reduziert im Licht Ferricyanid katalytisch unter Entwicklung von Sauerstoff.
Diese photochemische Wasserzersetzung wird in eine Dunkel- und eine Heil-Reaktion zerlegt.
1939 fand Hill1, daß isolierte Chloroplasten im Licht Ferri-Oxalat reduzieren
und daß dabei Sauerstoff entwickelt wird nach der Gleichung :
4 Fe*-++ + 2 H20 = 4 Fe++ + 4 H+ + 02. [1]
Da Ferro-Oxalat autoxydabel ist, kann hierbei Sauerstoff nur bis zu sehr nied-
rigen Drucken entwickelt werden; und da Ferri-Oxalat im Licht — ohne Chloro-
plasten — unter COj-Entwicklung reduziert wird, ergeben sich bei photochemi-
schen Versuchen mit Ferri-Oxalat Komplikationen, die vermieden werden, wenn
man, wie wir in unseren Versuchen mit grünen Grana2 zeigten, Ferricyanid als
Eisensalz benutzt. Ferricyanid ist viel lichtbeständiger als Fern'-Oxalat, und Ferro-
cyanid ist nicht autoxydabel, so daß man Sauerstoff bis zu beliebigen Drucken ent-
wickeln kann, wenn man Ferricyanid und grüne Grana im Licht zusammen-
bringt.
Bei der Fortsetzung dieser Versuche haben wir gefunden, daß man — merk-
würdigerweise — die grünen Grana durch lebende Chlorella ersetzen kann, die
also wie grüne Grana im Licht Wasser nach Gleichung [1] zersetzt. Große Mengen
an Ferricyanid können dabei durch wenig Chlorella reduziert werden, ohne wesent-
liche Schädigung der Chlorella, so daß es, aus methodischen Gründen, aussichts-
reich erschien, die photochemische Wasserzersetzung mit lebender Chlorella als
Versuchsobjekt näher zu untersuchen.
Es zeigte sich dabei, daß Ferricyanid durch lebende Chlorella auch im Dunkeln
reduziert wird, und zwar, wenn die Lösungen genügend Sauerstoff enthalten, nur
wenig langsamer als im Licht; daß aber im Dunkeln nicht Sauerstoff, sondern
Kohlensäure erscheint, entsprechend der Gleichung:
4 pe+++ + C + 2 H20 = 4 Fe++ + 4 H+ + C02. [la]
Im Licht folgt auf diese Dunkelreaktion die Reaktion :
C02 = C + 02 tlb]
und die Bilanz ist die Sauerstoffentwicklung aus Wasser gemäß Gleichung [1].
Die photochemische Wasserzersetzung durch Eisen beruht also auf der kataly-
tischen Wirkung einer Kohlenstoffverbindung, die in einer Dunkelreaktion zu
CO2 oxydiert und in einer Hellreaktion — der Photosynthese — wieder zurückredu-
ziert wird.
Von den Eigenschaften der Dunkelreaktion ist erwähnenswert, daß sie bei Gegen-
* Aus Zeitschrift für Naturforschung 10b (1955): 301.
Zusatz 1961. Seit dieser Arbeit waren wir der Überzeugung, daß alle „Hill-
reaktionen" Photolysen der Kohlensäure, nicht Photolysen des Wassers sind.
5 Jahre später (Arbeit 56 dieses Buchs) wurde der Beweis erbracht.
314 Photochemische Wasserzersetzung durch lebende Chlorella
wart von Sauerstoff schneller verläuft als bei Abwesenheit von Sauerstoff; und daß
sie durch Phenanthrolin spezifisch gehemmt wird, daß also an der Dunkelreaktion
eine dissoziierende Schwermetallverbindung beteiligt ist.
I. Methoden
Zellen. Chlorella wurden, wie kürzlich beschrieben3, gezüchtet. Mehrtägige Kulturen, die pro
Zuchtkolben in 250 ccm 1000 bis 2000 cmm Zellen enthielten, wurden für die Versuche verwendet.
Die Zellen wurden 2-mal in w/10-Phosphat pH 6,5 oder 4,3 gewaschen und dann auf die ge-
wünschte Zelldichte mit der gleichen Phosphatlösung aufgefüllt.
Bestimmung des Ferro-Eisens. Die Konzentration des Ferricyanids, das als K;3Fe(CN)ß zugesetzt
wurde, war im allgemeinen 1/ioo molar. Nach dem Versuch wurden die Zellen abzentrifugiert, in
der überstehenden Flüssigkeit wurde das entstandene Ferrocyanid, nach Ansäuern, mit w/100-
Permanganat titriert. In den Kontrollen ohne Eisenzusatz wurde niemals Permanganat verbraucht.
Manometrie. Kegelförmige Gefäße von den ungefähren Abmessungen v = 17,2, vt = 4,2, &o220(> =
1,2, &co2 == 1)55, wurden verwendet. Die Mengen an Zellen und Eisen waren so bemessen, daß die
manometrischen Ausschläge in 1 Stde. 150 — 200 mm betrugen. Der Gasraum enthielt Argon oder
Luft. Die Manometer wurden ohne Unterbrechung der Schüttelbewegung abgelesen. Die Thermo-
statentemperatur betrug 20°.
Als Lichtquellen dienten 200- Watt-Metallfadenlampen, deren Glaskörper direkt in das Thermo-
statenwasser neben die Kegelgefäße versenkt wurde. Die Lichtstärke war dann sehr groß. Bei
gleichem y von Atmung und Photosynthese waren dann die Druckänderungen im Licht, wenn
kein Eisen zugesetzt wurde, Null. Die Druckänderungen, die im Licht auftraten, konnten also, bei
kohlensäure-freien Gasräumen, nur von der Eisenreaktion herrühren. Um Gasraum, Lösungen und
Zellen von Kohlensäure zu befreien, wurde vor Zugabe des Eisens immer bis zur Druckänderung
Null belichtet.
Sollte neben dem Sauerstoff auch die Kohlensäure bestimmt werden, so wurde ein Gefäßpaar
angesetzt, von dem nur das eine Gefäß Kalilauge im Einsatz enthielt. War pH 6,5, so mußte bei der
Berechnung die Retention der Kohlensäure berücksichtigt werden, die bei 20°, pro mm Brodie,
pro ccm w/10-Phosphat R = 0,189 mm:! betrug. Da w/10-Phosphat des pH 4,3 nicht retiniert, so
wurde, wenn die Kohlensäure mitbestimmt werden sollte, oft bei pH 4,3 gearbeitet, wobei in Kauf
genommen wurde, daß dann die Eisenreduktion etwas langsamer verlief als bei pH 6,5.
II. Reduktion des Ferricyanids im Licht
In den Hauptraum von 4 Kegelgefäßen wurden je 4 ccm w/10-Phosphat pH
6,5 gegeben, die je 200 cmm Chlorella enthielten. Die Ansatzbirnen von 2 Gefäßen
blieben leer, in die Ansatzbirne der beiden anderen Gefäße wurde je 0,2 ccm
m/5-K.3Fe(CN)6 gegeben. Die Einsätze aller Gefäße enthielten je 0,1 ccm 20proz.
Kalilauge. Der Gasraum von 2 Gefäßen enthielt Argon, der Gasraum der
beiden andern Gefäße enthielt Luft. Während des Ausgleichs wurde belichtet,
um alle Kohlensäure in Zellen und Lösungen umzusetzen. Dann wurde das Fer-
ricyanid in den Hauptraum gegeben und weiter bis zur Beendigung der Druck-
entwicklung belichtet. Waren die End-Drucke abgelesen, so wurden die Zellen
abzentrifugiert, in den überstehenden Lösungen wurde das gebildete Ferrocyanid
mit w/100-KMnO4 titriert. Zum Beispiel fanden wir 55 Min. nach Zugabe des
Ferricyanids in den Hauptraum (vgl. Abb. 1):
mit Eisen,
Gasraum Argon 226 cmm O-2 I = — 218 cmm
ohne Eisen,
Gasraum Argon 8 cmm O2 J = 98% der Theorie
Photochemische Wasserzersetzung durch lebende Chlorella
315
mit Eisen,
Gasraum Luft 186 cmm O-2 1= — 193 cmm
ohne Eisen,
Gasraum Luft — 6 cmm O2 J= 86% der Theorie
während in jedem der beiden Gefäße, denen Ferricyanid zugesetzt war, ein njlOO-
Permanganat-Verbrauch von 4 ccm gefunden wurde, d. h., 40 //Mole Eisen waren
2W
Abb. 1. Sauerstoffentwicklung aus 200 cmm
Chlorella in starkem Licht, mit oder ohne
Zusatz von Ferricyanid, in Argon oder in
Luft.
berechnet
HO 50
Minuten -
reduziert worden, 9 — 10 //Mole Sauerstoff waren entwickelt worden, das Verhältnis
Eisenverbrauch 'Sauerstoffentwicklung war also, gemäß Gleichung [1], nahezu
gleich 4.
III. Reduktion des Ferricyanids im Dunkeln
Wie in Abschnitt II, waren 200 ccm Chlorella in 4 ccm Phosphatlösung pH 6,5 sus-
pendiert. Anders als in Abschnitt II erhielten alle 4 Gefäße Eisen, 2 von den 4
Gefäßen blieben verdunkelt. Zum Beispiel fanden wir, daß 45 Min. nach Zugabe
von 40 //Molen Ferricyanid die folgenden Eisenmengen verbraucht worden waren:
Gasraum
[//Mole]
Luft, hell
38
Luft, dunkel
27
Argon, hell
38
Argon, dunkel
9,5
Vergleichen wir zunächst Luft hell und dunkel, so ergibt sich, daß die Reduk-
tionsgeschwindigkeit des Eisens im Dunkeln 70% der Hellgeschwindigkeit be-
trägt. In anderen Versuchen war der Unterschied zwischen hell und dunkel noch
kleiner; im ganzen fanden wir im Dunkeln 70 — 90% der Hellgeschwindigkeit.
Vergleichen wir Argon hell und dunkel, so ergibt sich, daß die Reduktionsge-
schwindigkeit des Eisens im Dunkeln nur 25" 0 von der Hellgeschwindigkeit be-
trägt, während im Licht (Vergleich Luft — hell und Argon — hell) die Reduktions-
geschwindigkeiten des Eisens gleich sind. Es ist daraus zu schließen, daß Sauer-
stoff die Reduktion des Eisens begünstigt. Im Licht, wenn die Zellen Sauerstoff
entwickeln, scheint die Sauerstoffkonzentration immer optimal zu sein, auch wenn
der Gasraum anfangs nur Argon enthielt.
316 Photochemische Wasserzersetzung durch lebende Chlorella
IV. Kohlensäurebildung bei der Eisenreduktion im Dunkeln
Gibt man im Dunkeln Ferricyanid zu Chlorella, die mit Luft gesättigt ist, und
mißt den Gaswechsel mit und ohne KOH im Einatz, so findet man zwei Wirkun-
gen des Eisens :
1. Die Sauer Stoffatmung steigt erheblich an, während man hätte erwarten kön-
nen, daß das Eisen den Sauerstoff „ersetze" und also der Sauerstoffverbrauch
kleiner würde.
2. Außer der Kohlensäure, die dem erhöhten Sauerstoffverbrauch äquivalent ist,
erscheint Extra-Kohlensäure, die in einem stöchiometrischen Verhältnis zu der
reduzierten Eisenmenge steht.
Zur Messung des Gaswechsels wurden in 4 Kegelgefäße je 4 ccm ;w/10-Phosphat
pH 4,3 gegeben, die je 200 cmm Chlorella enthielten. Von den Ansatzbirnen blie-
ben zwei leer, während zwei je 0,2 ccm ra/5-K3Fe(CN)6 enthielten. Von den Ein-
sätzen blieben zwei leer, während zwei je 0,1 ccm 20proz. Kalilauge enthielten.
Die Gasräume enthielten Luft. Alle 4 Gefäße blieben verdunkelt. Wir fanden 90
Min. nach Zugabe der 40 //Mole Ferricyanid den folgenden Sauerstoffverbrauch
jcoo und die folgende Kohlensäurebildung jcco2 •
ohne Eisen, — KOH ] xo2 — 220 cmm |
ohne Eisen, — KOH | *Co2 + 200 cmm | Xco*lXo* = ~ °>91
Eisen, + KOH 1 x02 — 405 cmm 1 „ ^_
C.M rnu ■ 2 ,,, • Extra-COo == 545 — 0,91 405
\- Eisen, — KOH xco* ~ 545 cmm
= 175 cmm
= 7,8 //Mole.
Die Titration des reduzierten Eisens nach 90 Min. ergab in jedem der beiden
mit Eisen versetzten Gefäße einen Verbrauch von 3,25 ccm w/lOO-KMnOa, d. h.
32,5 //Mole Fe waren reduziert worden, während 7,8 //Mole Extra-COj erschienen
waren, also: c , . „ „„ ,
Fe reduziert 32,5
4,17.
Extra COo 7,8
Die Gleichung der Dunkelreaktion ist hiernach :
4 Fe!-++ + C + 2 H20 = 4 Fe++ + 4H+T COo.
V. Zeitliche Trennung von Dunkelreaktion und Hellreaktion bei der
photochemischen Wasserzersetzung
Wenn bei der Wasserzersetzung zunächst in einer Dunkelreaktion Kohlensäure
entsteht und dann die Kohlensäure durch das Licht unter Sauerstoffentwicklung
reduziert wird, so muß es für den Endeffekt gleichgültig sein, ob man während der
Eisen- Reduktion belichtet oder ob man zunächst das Eisen im Dunkeln reagieren
läßt und dann belichtet. Auf beiden Wegen sollte man den gleichen Endwert an
entwickeltem Sauerstoff erhalten. In Wirklichkeit erhält man immer etwas mehr
Sauerstoff, wenn man das Eisen zunächst im Dunkeln reagieren läßt und erst dann
belichtet, woraus folgt, daß im Licht eine kleine Menge Eisen so reagiert, daß keine
Kohlensäure entsteht. Dieses Eisen ist dann für die Sauerstoffbildung verloren.
Die manometrische Methode beruht auf der Tatsache, daß Kohlensäure bei
Photochemische Wasserzersetzung durch lebende Chlorella 317
Gegenwart von stark belichteter Chlorella nicht beständig ist, d. h., daß die End-
drucke, die man im Licht erhält, nur Sauerstoffdrucke sein können; daß man also
den entwickelten Sauerstoff durch Multiplikationen der Enddrucke mit den ein-
fachen Gefäßkonstanten &o2 erhält. Natürlich dürfen die Einsätze der Gefäße bei
dem Versuch keine Kalilauge enthalten, da sonst die im Dunkeln entwickelte
Kohlensäure in die Kalilauge ginge und bei der folgenden Belichtung keinen Sauer-
stoff geben könnte. In starkem Licht jedoch ist es gleichgültig, ob die Gefäße im
Einsatz Kalilauge enthalten oder nicht. Denn in starkem Licht wird die Kohlen-
säure so schnell reduziert, daß sie nicht in den Gasraum entweichen kann.
Zum Beispiel wurde in zwei Kegelgefäße je 4 ccm ra/10-Phosphat pH 6,5 gegeben,
die je 200 cmm Chlorella enthielten. Die Ansatzbirnen enthielten je 0,2 ccm m!5-
K3Fe(CN)«5. Die Einsätze blieben leer. Die Gasräume enthielten Luft. Zunächst
wurde im Hellen ausgeglichen, um beide Gefäße von Kohlensäure zu befreien.
Dann wurde bei to das Eisen in die Haupträume der Gefäße gegeben, von denen
das eine hell und das andere verdunkelt war. War die Druckentwicklung in dem
Hellgefäß beendet, so wurde der Druck h abgelesen und die Sauerstoffentwicklung
jco2 = h X koo berechnet. Gleichzeitig begann die Belichtung des Dunkelgefäßes.
War hier die Druckentwicklung beendet, so wurde auch für dieses Gefäß die
Sauerstoffentwicklung xo2 = h X ko-2 berechnet.
Wir fanden:
Sofort nach Eisenzusatz belichtet. Endwert nach 55 Min.:
JC02 = 195 cmm = 8,7 //Mole.
Eisen zunächst im Dunkeln reduziert, dann 40 Min. hell :
xo-i = 208 cmm = 9,3 //Mole.
Die Titration des reduzierten Eisens nach Beendigung der manometrischen
Messung ergab für jedes Gefäß 4,05 ccm »/IOO-KM11O4. Das Verhältnis von
Eisenreduktion zu Sauerstoffentwicklung war also :
Wenn das Eisen während der Belichtung reduziert wurde: 40,5/8,7 = 4,65.
Wenn das Eisen im Dunkeln reduziert und dann belichtet wurde: 40,5/9,7 = = 4,2.
VI. Phenanthrolin
a- //Phenanthrolin, das bei der Aufklärung des chemischen Mechanismus der
Photosynthese eine Rolle spielen wird, hemmt in etwa 1/öoo-molarer Lösung spe-
zifisch und reversibel
1. die Photosynthese2,
2. die photochemische Entwicklung des Sauerstoffs aus grünen Grana, denen
Chinon zugesetzt ist2,
3. die photochemische Austreibung der Sauerstoff-Kapazität aus Chlorella4,
während die Atmung der Chlorella, soweit sie nicht mit der Photosynthese zusam-
menhängt, von Phenanthrolin nicht gehemmt wird.
Wir können nunmehr zu den 3 hemmbaren Vorgängen einen 4. hinzufügen.
Wir fanden, daß die Ferricyanid-Reduktion durch Phenanthrolin stark gehemmt
318 Photochemische Wasserzersetzung durch lebende Chlorella
wird. Wenn z. B. 4 ccm ra/10-Phosphat pH 6,5 die 300 cmm Chlorella und 40
//Mole K3Fe(CN)6 enthielten, mit und ohne Plenanthrolin 30 Min. in Luft im
Dunkeln geschüttelt wurden, so fanden wir in der überstehenden Flüssigkeit den
folgenden Verbrauch an Permanganat :
n
Verbrauch von -KMnO.i
ohne Phenanthrolin 3,8 ccm = 38 //Mole Fe++,
in w/400-Phenanthrolin 1,55 ccm = 15,5 //Mole Fe++.
Die Eisenreduktion wurde also durch w/400-Phenanthrolin um rund 60% ge-
hemmt.
Auch Blausäure hemmt die Ferricyanid-Reduktion. Doch hemmt Blausäure
nicht so stark wie Phenanthrolin.
VII. Wieviel Ferricyanid kann Chlorella reduzieren?
Da im Licht das Ferricyanid in der Bilanz Wasser zerlegt, kann im Licht eine
gegebene Menge Chlorella beliebige Mengen Ferricyanid reduzieren. Unsere
Frage hat also nur Sinn, wenn sie sich auf die Dunkelreaktion bezieht, bei der
Ferricyanid in der Bilanz eine KohlenstorTverbindung oxydiert. Wieviel derartig
reaktionsfähiger Kohlenstoff ist in einer gegebenen Menge Chlorella enthalten ?
Wir gaben in eine Gaswaschflasche von 250 ccm Inhalt 95 ccm w/10-Phosphat
pH 6,5 + 5 ccm w/5-K3Fe(CN)6 + 500 cmm Chlorella und leiteten im Dunkeln,
bei Zimmertemperatur, 45 Stdn. Luft durch die Flasche. In geeigneten Zeitab-
ständen entnahmen wir 4 ccm der Suspension und bestimmten nach Zentrifu-
gieren in der überstehenden Lösung das gebildete Ferrocyanid durch Titration
mit Kaliumpermanganat. Da nach 21 Stdn. fast alles Eisen reduziert war, setzten
wir nach 21 Stdn. die Anfangsmenge an Ferricyanid nochmals zu. Der gefundene
Permanganat- Verbrauch war :
Verbrauch von
Min.
»/100-KMnO4
in 4 ccm Zellsuspension
0
0
30
0,3
100
0,9
195
1,25
300
1,70
580
2,40
1270
3,60
neues Fe 1405
4,05
1585
4,60
1765
4,95
2700
6,10
In 45 Stdn. hatten also 20 cmm Zellen = 5 mg Trockensubstanz 61 //Mole
= 20 mg K3Fe(CN)6 zu Ferrocyanid reduziert und 61/4 = 15 //Mole = 0,66 mg
Kohlensäure gebildet, das sind 13% des Trockengewichts der Zellen.
Nach Beendigung des Versuchs, also nach 45 Stdn., wurden die Zellen auf der
Zentrifuge mit Kulturlösung gewaschen. Bei der Kultur vermehrten sich 60 cmm
Photochemische Wasserzersetzung durch lebende Chlorella
319
dieser Zellen in 20 Stdn. auf 250 cmm, während Kontrollzellen unter sonst gleichen
Bedingungen sich von 60 auf 340 cmm vermehrten. Die Vermehrungsgeschwindig-
keit der Chlorella hatte also durch die lange Berührung mit Ferri- und Ferrocyanid
nicht wesentlich gelitten.
Literatur
1 Hill, R., Proc. Royal Soc. (London), Ser. B, 127
(1939), 192; R. Hill und R. Scarisbrik, ebenda 129
(1940), 238.
2 Warburg, O., und Lüttgens, W., Die Naturwissen-
schaften 32 (1944), 161 und 301; O. Warburg, Heavy
Metals and Prosthetic Croups. Clarendon Press, Oxford
1949.
3 Warburg, O., Krippahl, K., und Schröder, W., Z.
Naturforschg. 9b (1954), 667.
4 Warburg, O., Krippahl, G., Schröder, W., und
Buchholz, W., Z. Naturforschg. 9 b (1954), 769.
34 Über die Messung des Energieumsatzes bei der Photosynthese
mit dem Großflächen-Bolometer*
Von Otto Warburg
Das Großflächen-Bolometer, von Lummer und Kurlbaum1 in der Physikalisch-
Technischen Reichsanstalt um 1900 entwickelt, ist bei den grundlegenden Arbei-
ten der Photochemie von Emil Warburg2 als Strahlungsmesser benutzt worden.
Das gleiche Instrument wurde bei den Messungen des Energieumsatzes der Photo-
synthese angewendet, 1920 in der Physikalisch-Technischen Reichsanstalt3 und in
den folgenden Jahren im Kaiser-Wilhelm-Institut für Biologie in Dahlem4.
Da es keinen, für photosynthetische Experimente geeigneteren absoluten Strah-
lungsmesser gibt als das Lummer- KuRLBAUM-Bolometer, veranlaßte ich 1945 in
Berlin die Wiederherstellung dieser Instrumente mit dem Erfolg, daß die Firma
Lassen**, Berlin vor kurzem 2 Großflächen-Bolometer nach den USA. liefern
konnte, das eine nach Madison (Wisconsin) in das Laboratorium von Farrington
Daniels, das andere nach Berkeley (Calif.) in das Laboratorium von Melvin Calvin.
Der Energieumsatz bei der Photosynthese ist dadurch in den U. S. A. in be-
merkenswerter Weise angestiegen. Während Rabinowitsch5 aus dem Laborato-
rium von Emerson, noch im Jahre 1952 einen mittleren Quantenbedarf von 12 pro
Molekül Sauerstoff meldete, nennt 1955 Daniels6 als Mittelwert des von ihm ge-
fundenen Quantenbedarfs die Zahl 8.9 und Calvin7 sogar die Zahl 4.9, wenn bei
niedrigen Intensitäten — unter den Bedingungen unserer Versuche3 von 1920 —
die Dunkelatmung zu dem im Licht entwickelten Sauerstoff addiert wurde.
Trotz dieser Besserung schienen mir die Differenzen zwischen Daniels und
Calvin noch so erheblich zu sein, daß man Fehler in ihren Arbeiten vermuten
mußte. Tatsächlich sind in beiden Arbeiten, wie im folgenden gezeigt wird, we-
sentliche Fehler bei der Messung der Lichtabsorption gemacht worden.
Die Arbeit von Daniels
Um die Absorption des Lichts in C/z/ore//a-Suspensionen zu messen, werden sie
von Daniels in den Weg des zum Bolometer gerichteten Lichtstrahls gebracht.
Daniels bestimmt dann vor und hinter der Zellsuspension die bolometrischen
Ausschläge und nimmt an, daß die Differenz von der Lichtabsorption in den Pig-
menten der Chlorella herrührt. In Wirklichkeit jedoch rührt der gefundene Licht-
verlust nur zum Teil von der Absorption des Lichts her ; ein anderer Teil des Lichts
wird von der Chlorella- Suspension so zerstreut, daß er nicht auf die Platinstreifen
des Bolometers, sondern auf die Wände des Bolometergehäuses trifft.
Der so entstehende Fehler ist erheblich. Bestimmten wir für eine gegebene Zell-
suspension die Absorption der Wellenlänge 546 m// einmal mit der Ulbricht'schen
Kugel — wobei kein zerstreutes Licht verlorengeht8 — und dann nach der Vor-
* Republished from Biochim. et Bioph. Acta 18 (1955): 163.
** Jetzt Firma Röhrig, Berlin SO, Erkelenzdamm 59.
Über die Messung des Energieumsatzes bei der Photosynthese usw.
321
schrift von Daniels mit dem Bolometer, so fanden wir zum Beispiel mit der Kugel
25% Absorption, mit der Methode von Daniels aber, je nach der Ausleuchtung
der Zellsuspension, 40u() bis 60% Absorption. Natürlich erhält Daniels unter sol-
chen Umständen, indem er eine viel zu hohe Absorption in seine Rechnungen
einsetzt, eine viel zu niedrige Ausbeute an chemischer Energie.
Im blau jedoch, das stärker als grün absorbiert wird und das in den Versuchen
von Daniels fast vollständig absorbiert wurde, war der Zerstreuungsverlust ge-
ringer und so erhielt Daniels im blau eine viel bessere Energieausbeute als im
grün, nämlich einen Quantenbedarf um 6, eine erfreuliche Annäherung an den
Blau-Wert 5 von Warburg und Negelein von 1923, wenn man bedenkt, daß
Daniels noch im Jahre 1938 einen mittleren Quantenbedarf von 157 fand9 (vergl.
seine Tabelle III).
Die Arbeit von Calvin
Um den durch die Zerstreuung bewirkten Fehler bei Absorptionsmessungen zu
vermeiden, ersetzte Calvin das Fenster im Bolometergehäuse durch ein Opalglas,
in der Hoffnung, das in das Bolometer eindringende Licht so weit zu zerstreuen,
daß die vor das Opalglas gebrachten C/z/ore/Za-Suspensionen das Licht nicht weiter
zerstreuen könnten.
In Wirklichkeit ist auch Calvins Anordnung fehlerhaft, wegen der zusätzlichen
Zerstreuung, die entsteht, wenn man die Chlorella- Suspension vor das Opalglas-
fenster bringt. Zum Beweis bestimmten wir für eine gegebene Zellsuspension die
Lichtabsorption einmal mit der Ulbricht'schen Kugel und dann nach Calvin mit
Bolometer und Opalglasfenster und fanden wesentlich höhere Absorptionen mit
der Methode von Calvin als mit der Kugel. Zum Beispiel fanden wir im grün
nach Calvin 43% Absorption und mit der Kugel 25% Absorption. Natürlich
erhielt so Calvin, indem er zu hohe Absorptionen einsetzte, zu niedrige Ausbeuten
an chemischer Energie.
Wenn keine Ulbricht'sche Kugel zur Verfügung steht, kann man sich leicht mit
Hilfe von „weißer" Chlorella8 von der Fehlerhaftigkeit der Methoden von Da-
niels und Calvin überzeugen. Bringt man eine Suspension von Chlorella, aus der
die Pigmente mit Methanol extrahiert worden sind, vor das Bolometer in der An-
ordnung von Daniels oder in der Anordnung von Calvin, so findet man immer
eine erhebliche, scheinbare Lichtabsorption, obwohl doch in den Zellen nichts
mehr ist, was das Licht absorbieren könnte.
Literatur
1 Lummer, O., und Kurlbaum, F., Wiedemanns Ann.
Physik 46 (1892), 204; Kurlbaum, F., ibid. 65 (1898),
746.
2 Anwendung des Bolometers bei photochemischen Ar-
beiten: Warburg, Emil, Leithäuser, G., Hupka, E.,
und Müller, C, Ann. Physik 40 (1913), 609; War-
burg, E., und Müller, C.j Verhandl. deut. physik. Ges.
18 (1916), 245; Warburg, E., Z. Elektrochem. 27 (1921),
135; 26 (1920), 54 und 27 (1921), 133.
3 Müller, C.j und Warburg, Otto, Sitzungsberichte
der Preußischen Akademie der Wissenschaften, Sitzung
vom 21. Oktober, 1920, Seite 733.
4 Warburg, O., und Kegelein, E., Z. physik. Chem. 102
(1922), 236; ibid. 106 (1923), 191.
5 Ehrmantraut, H., und Rabinowitsch, E., Arch. Bio-
chem. and Biophys. 38 (1952), 67.
6 Lung Yuan, E., Evans, Robert W., und Daniels, Far-
rington, Biochim. Biophys. Acta 17 (1955), 185.
7 Bassham, James A., Shibata, Kazuo, und Calvin,
Melvin, Biochim. Biophys. Acta 17 (1955), 332.
8 Warburg, Otto, und Krippahl, Günter, Z. Natur-
forsch. 9b (1954), 181.
9 Manning, W. M., Stauffer, J. F., Douglas, B. M..
und Daniels, F., J. Am. Chem. Soc. 60 (1938), 266.
21 Warburg. Zellphysiologie
35 On the Origin of Cancer Cells*
By Otto Warburg
Our principal experimental object for the measurement of the metabolism of Cancer
cells is today no longer the tumor but the ascites Cancer cells l living free in the
abdominal cavity, which are almost pure cultures of Cancer cells with which one
can work quantitatively as in chemical analysis. Formerly, it could be said of tumors,
with their varying Cancer cell content, that they ferment more strongly the more
Cancer cells they contain, but today we can determine the absolute fermentation
values of the Cancer cells and find such high values that we come very close to the
fermentation values of wildly proliferating Torula yeasts.
What was formerly only qualitative has now become quantitative. What was
formerly only probable has now become certain. The era in which the fermentation
of the Cancer cells or its importance could be disputed is over, and no one today
can doubt that we understand the origin of Cancer cells if we know how their large
fermentation originates, or, to express it more fully, if we know how the damaged
respiration and the excessive fermentation of the Cancer cells originate.
Energy of Respiration and Fermentation
We now understand the chemical mechanism of respiration and fermentation
almost completely, but we do not need this knowledge for what follows, since
energy ahne will be the center of our considerations. We need to know no more of
respiration and fermentation here than that they are energy-producing reactions
and that they synthesize the energy-rich adenosine triphosphate, through which
the energy of respiration and fermentation is then made available for life. Since
it is known how much adenosine triphosphate can be synthesized by respiration and
how much by fermentation, we can write immediately the potential, biologically
utilizable energy production of any cells if we have measured their respiration and
fermentation. With the ascites cancer cells of the mouse, for example, we find an
average respiration of 7 cubic millimeters of oxygen consumed per milligram, per
* Reprinted from Science 123 (1956): 309 by permission.
Zusatz 1961. Der in diesem Vortrag beschriebene Fortschritt ist der Über-
gang von den Tumoren, die alle Mischgewebe sind, zu den freien Krebszellen : zu
den Ascites-Krebszellen und zu den in vitro gezüchteten Krebszellen der Earle-
schen Schüttelkulturen, deren Untersuchung Dean Burk in einem Addendum
beschreibt. Im übrigen aber sind viele Ideen des Vortrags heute als überholt zu
betrachten, zum Beispiel die Entstehung des Krebsstoffwechsels durch Selektion,
die Wirkungsweise der Röntgenstrahlen bei der Abtötung der Krebszellen und
auch die Verminderung der Zellgrana als Ursache der zu niedrigen Atmung der
Krebszellen. Trotzdem habe ich den Vortrag in unsere Sammlung aufgenommen,
um zu zeigen, in wie schneller Entwicklung die hier diskutierten Probleme heute
begriffen sind.
On the Origin of Cancer Cells 323
hour, and fermentation of 60 cubic millimeters of lactic acid produced per milli-
gram, per hour. This, converted to energy equivalents, means that the Cancer cells
can obtain approximately the same amount of energy from fermentation as from
respiration, whereas the normal body cells obtain much more energy from res-
piration than from fermentation. For example, the liver and kidney of an adult
animal obtain about 100 times as much energy from respiration as from fermen-
tation.
I shall not consider aerobic fermentation, which is a result of the interaction of
respiration and fermentation, because aerobic fermentation is too labile and too
dependent on external conditions. Of importance for the considerations that follow
are only the two stable independent metabolic processes, respiration and anaerobic
fermentation — respiration, which is measured by the oxygen consumption of cells
that are saturated with oxygen, and fermentation, which is measured by the forma-
tion of lactic acid in the absence of oxygen.
Injuring of Respiration
Since the respiration of all Cancer cells is damaged, our first question is, How can
the respiration of body cells be injured ? Of this damage to respiration, it can be
said at the outset that it must be irreversible, since the respiration of cancer cells
never returns to normal. Second, the injury to respiration must not be so great
that the cells are killed, for then no cancer cells could result. If respiration is dam-
aged when it forms too little adenosine triphosphate, it may be either that the oxygen
consumption has been decreased or that, with undiminished oxygen consumption,
the coupling between respiration and the formation of adenosine triphosphate has
been broken, as was first pointed out by Feodor Lynen2.
One method for the destruction of the respiration of body cells is removal of
oxygen. If, for example, embryonal tissue is exposed to an oxygen deficiency for
some hours and then is placed in oxygen again, 50 percent or more of the respiration
is usually destroyed. The cause of this destruction of respiration is lack of energy.
As a matter of fact, the cells need their respiratory energy to preserve their struc-
ture, and if respiration is inhibited, both structure and respiration disappear.
Another method for destroying respiration is to use respiratory poisons. From
the Standpoint of energy, this method comes to the same result as the first method.
No matter whether oxygen is withdrawn from the cell or whether the oxygen is
prevented from reacting by a poison, the result is the same in both cases — namely,
impairment of respiration from lack of energy.
I may mention a few respiratory poisons. A strong, specific respiratory poison is
arsenious acid, which, as every clinician knows, may produce cancer. Hydrogen
sulfide and many of its derivatives are also strong, specific respiratory poisons. We
know today that certain hydrogen sulfide derivatives, thiourea and thioacetamide,
with which citrus fruit Juices have been preserved in recent times, induce cancer
of the liver and gall bladder in rats.
Urethane is a nonspecific respiratory poison. It inhibits respiration as a chem-
ically indifferent narcotic, since it displaces metabolites from cell structures. In
324 On the Origin of Cancer Cells
recent years it has been recognized that subnarcotic doses of urethane cause lung
cancer in mice in 100 percent of treatments. Urethane is particulary suitable as a
carcinogen, because, in contrast to alcohol, it is not itself burned up on the res-
piring surfaces and, unlike ether or Chloroform, it does not cytolyze the cells. Any
narcotic that has these properties may cause cancer upon chronic administration
in small doses.
The first notable experimental induction of cancer by oxygen deficiency was
described by Goldblatt and Cameron3, who exposed heart fibroblasts in tissue
culture to intermittent oxygen deficiency for long periods and finally obtained trans-
plantable cancer cells, whereas in the control cultures that were maintained without
oxygen deficiency, no cancer cells resulted. Clinical experiences along these lines
are innumerable : the production of cancer by intermittent irritation of the outer
skin and of the mucosa of internal organs, by the plugging of excretory ducts of
glands, by cirrhoses of tissues, and so forth. In all these cases, the intermittent
irritations lead to intermittent circulatory disturbances. Probably chronic inter-
mittent oxygen deficiency plays a greater role in the formation of cancer in the body
than does the chronic administration of respiratory poisons.
Any respiratory injury due to lack of energy, however, whether it is produced
by oxygen deficiency or by respiratory poisons, must be cumulative, since it is
irreversible. Frequent small doses of respiratory poisons are therefore more dan-
gerous than a single large dose, where there is always the chance that the cells will
be killed rather than that they will become carcinogenic.
Grana
If an injury of respiration is to produce cancer, this injury must, as already men-
tioned, be irreversible. We understand by this not only that the inhibition of respira-
tion remains after removal of the respiratory poison but, even more, that the inhibi-
tion of respiration also continues through all the following cell divisions, for measure-
ments of metabolism in transplanted tumors have shown that cancer cells cannot re-
gain normal respiration, even in the course of many decades, once they have lost it.
This originally mysterious phenomenon has been explained by a discovery that
comes from the early years of cell physiology4. When liver cells were cytolyzed by
infusion of water and the cytolyzate was centrifuged, it was found that the greater
part of the respiration sank to the bottom with the cell grana. It was also shown
that the respiration of the centrifuged grana was inhibited by narcotics at concen-
trations affecting cell structures, from which it was concluded — already in 1914 —
that the respiring grana are not insoluble cell particles but autonomous organisms,
a result that has been extended in recent years by the English botanist Darlington5
and particularly by Mark Woods and H. G. du Buyö of the National Cancer Insti-
tute in Bethesda, Md. Woods and du Buy have experimentally expanded our con-
cepts concerning the self-perpetuating nature of mitochondrial elements (grana)
and have demonstrated the hereditary role of extranuclear aberrant forms of these
in the causation of neoplasia. The autonomy of the respiring grana, both biochemi-
cally and genetically, can hardly be doubted today.
On the Origin of Cancer Cells 325
If the principle Omne granum e grano is valid for the respiring grana, we under-
stand why the respiration connected with the grana remains damaged when it has
once been damaged; it is for the same reason that properties linked with genes
remain damaged when the genes have been damaged.
Furthermore, the connection of respiration with the grana" also explains a car-
cinogenesis that I have not mentioned previously, the carcinogenesis by x-rays.
Rajewsky and Pauly have recently shown that the respiration linked with the grana
can be destroyed with strong doses of x-rays, while the small part of the respiration
that takes place in the fluid protoplasm can be inhibited very little by irradiation.
Carcinogenesis by x-rays is obviously nothing eise than a destruction of respiration
by elimination of the respiring grana.
It should also be mentioned here that grana, as Graffi has shown8, fluoresce
brightly if carcinogenic hydrocarbons are brought into their surroundings, because
the grana accumulate the carcinogenic substances. Probably this accumulation is the
explanation for the fact that carcinogenic hydrocarbons, although almost insoluble
in water, can inhibit respiration and therefore have a carcinogenic effect.
Increase of Fermentation
When the respiration of body cells has been irreversibly damaged, Cancer cells by
no means immediately result. For Cancer formation there is necessary not only an
irreversible damaging of the respiration but also an increase in the fermentation —
indeed, such an increase of the fermentation that the failure of respiration is com-
pensated for energetically. But how does this increase of fermentation come about?
The most important fact in this field is that there is no physical or chemical
agent with which the fermentation of cells in the body can be increased directly;
for increasing fermentation, a long time and many cell divisions are always neces-
sary. The temporal course of this increase of fermentation in carcinogenesis has
been measured in many interesting works, among which I should like to make
special mention of those of Dean Burk9.
Burk first cut out part of the liver of healthy rats and investigated the meta-
bolism of the liver cells in the course of the ensuing regeneration, in which, as is
well known, the liver grows more rapidly than a rapidly growing tumor. No increase
of fermentation was found. Burk then fed rats for 200 days on butter yellow,
whereupon liver carcinomas were produced, and he found that the fermentation
slowly increased in the course of 200 days toward values characteristic of tumors.
The mysterious latency period of the production of Cancer is, therefore, noth-
ing more than the time in which the fermentation increases after a damaging of the
respiration. This time differs in various animals ; it is especially long in man and
here often amounts to several decades, as can be determined in the cases in which
the time of the respiratory damage is known — for example, in arsenic Cancer and
irradiation Cancer.
The driving force of the increase of fermentation, however, is the energy de-
ficiency under which the cells operate after destruction of their respiration, which
forces the cells to replace the irretrievably lost respiration energy in some way. They
326 On the Origin of Cancer Cells
are able to do this by a selective process that makes use of the fermentation of the
normal body cells. The more weakly fermenting body cells perish, but the more
strongly fermenting ones remain alive, and this selective process continues until
the respiratory failure is compensated for energetically by the increase in fermen-
tation. Only then has a Cancer cell resulted from the normal body cell.
Now we understand why the increase in fermentation takes such a long time
and why it is possible only with the help of many cell divisions. We also under-
stand why the latency period is different in rats and in man. Since the average
fermentation of normal rat cells is much greater than the average fermentation
of normal human cells, the selective process begins at a higher fermentation level
in the rat and, hence, is completed more quickly than it is in man.
It follows from this that there would be no Cancers if there were no fermentation
of normal body cells, and hence we should like to know, naturally, from where the
fermentation of the normal body cells stems and what its significance is in the
body. Since, as Burk has shown, the fermentation remains almost zero in the re-
generating liver growth, we must conclude that the fermentation of the body cells
has nothing to do with normal growth. On the other hand, we have found that the
fermentation of the body cells is greatest in the very earliest stages of embryonal
development and that it then decreases gradually in the course of embryonal
development. Under these conditions, it is obvious — since ontogeny is the repeti-
tion of phylogeny — that the fermentation of body cells is the inheritance of un-
differentiated ancestors that have lived in the past at the expense of fermentation
energy.
Structure and Energy
But why — and this is our last question — are the body cells dedifferentiated when
their respiration energy is replaced by fermentation energy? At first, one would
think that it is immaterial to the cells whether they obtain their energy from respi-
ration or from fermentation, since the energy of both reactions is transformed into
the energy of adenosine triphosphate, and yet adenosine triphosphate == adenosine
triphosphate. This equation is certainly correct chemically and energetically, but
it is incorrect morphologically, because, although respiration takes place for the
most part in the structure of the grana, the fermentation enzymes are found for a
greater part in the fluid protoplasm. The adenosine triphosphate synthesized by
respiration therefore involves more structure than the adenosine triphosphate syn-
thesized by fermentation. Thus, it is as if one reduced the same amount of silver
on a Photographie plate by the same amount of light, but in one case with dif-
fused light and in the other with patterned light. In the first'case, a diffuse
blackening appears on the plate, but in the second case, a picture appears ; how-
ever, the same thing happens chemically and energetically in both cases. Just as
the one type of light energy involves more structure than the other type, the
adenosine triphosphate energy involves more structure when it is formed by re-
spiration than it does when it is formed by fermentation.
In any event, it is one of the fundamental facts of present-day biochemistry
On the Origin of Cancer Cells 327
that adenosine triphosphate can be synthesized in homogeneous Solutions with
crystallized fermentation enzymes, whereas so far no one has succeeded in syn-
thesizing adenosine triphosphate in homogeneous Solutions with dissolved respi-
ratory enzymes, and the structure always goes with oxidative phosphorylation.
Moreover, it was known for a long time before the advent of crystallized fer-
mentation enzymes and oxidative phosphorylation that fermentation — the energy-
supplying reaction of the lower organisms — is morphologically inferior to respi-
ration. Not even yeast, which is one of the lowest forms of life, can maintain its
structure permanently by fermentation alone; it degenerates to bizarre forms.
However, as Pasteur showed, it is rejuvenated in a wonderful manner if it comes
in contact with oxygen for a short time. "I should not be surprised," Pasteur said
in 187610 in the description of these experiments, "if there should arise in the mind
of an attentive hearer a presentiment about the causes of those great mysteries of
life which we conceal under the words youth and age of cells." Today, after 80
years, the explanation is as follows : the firmer connection of respiration with struc-
ture and the looser connection of fermentation with structure.
This, therefore, is the physicochemical explanation of the dedifferentiation of
Cancer cells. If the structure of yeast cannot be maintained by fermentation alone,
one need not wonder that highly differentiated body cells lose their differentiation
upon continuous replacement of their respiration with fermentation.
I would like at this point to draw attention to a consequence of practical impor-
tance. When one irradiates a tissue that contains cancer cells as well as normal cells,
the respiration of the cancer cells, already too small, will decline further. If the
respiration falls below a certain minimum that the cells need unconditionally,
despite their increased fermentation, they die; whereas the normal cells, where
respitation may be harmed by the same amount, will survive because, with a greater
initial respiration, they will still possess a higher residual respiration after irradia-
tion. This explains the selective killing action of x-rays on cancer cells. But still
further : the descendants of the surviving normal cells may in the course of the
latent period compensate the respiration decrease by fermentation increase and,
thence, become cancer cells. Thus it happens that radiation which kills cancer cells
can also at the same time produce cancer or that urethane, which kills cancer cells,
can also at the same time produce cancer. Both events take place from harming res-
piration : the killing, by harming an already harmed respiration ; the carcinogenesis
by the harming of a not yet harmed respiration.
Maintenance Energy
When dedifferentiation of the body cells has occurred and cancer cells have thereby
developed, there appears a phenomenon to which our attention has been called by
the special living conditions of the ascites cancer cells. In extensively progressed
ascites cancer of the mouse, the abdominal cavity contains so many cancer cells
that the latter cannot utilize their füll capacity to respire and ferment because of
the lack of oxygen and sugar. Nevertheless, the cancer cells remain alive in the
abdominal cavity, as the result of transplantation proves.
328 On the Origin of Cancer Cells
Recently we have confirmed this result by direct experiments in which we placed
varying amounts of energy at the disposal of the ascites outside the body, in vitro,
and then transplanted it. This investigation showed that all Cancer cells were killed
when no energy at all was supplied for 24 hours at 38° C but that one-fifth of the
growth energy was sufficient to preserve the transplantability of the ascites. This
result can also be expressed by saying that Cancer cells require much less energy
to keep them alive than they do for growth. In this they resemble other lower cells,
such as yeast cells, which remain alive for a long time in densely packed packets —
almost without respiration and fermentation.
In any case, the ability of Cancer cells to survive with little energy, if they are not
growing, will be of great importance for the behavior of the Cancer cells in the body.
Sleeping Cancer Cells
Since the increase in fermentation in the development of Cancer cells takes place
gradually, there must be a transitional phase between normal body cells and fully
formed Cancer cells. Thus, for example, when fermentation has become so great
that dedifferentiation has commenced, but not so great that the respiratory defect
has been fully compensated for energetically by fermentation, we may have cells
which indeed look like Cancer cells but are still energetically insufficient. Such cells,
which are clinically not Cancer cells, have lately been found, not only in the pro-
state, but also in the lungs, kidney, and stomach of elderly persons. Such cells
have been referred to as "sleeping Cancer cells"11' 12.
The sleeping Cancer cells will possibly play a role in chemotherapy. From energy
considerations, I could think that sleeping Cancer cells could be killed more
readily than growing Cancer cells in the body and that the most suitable test objects
for finding effective killing agents would be the sleeping Cancer cells of skin — that
is, precancerous skin.
Summary
Cancer cells originate from normal body cells in two phases. The first phase
is the irreversible injuring of respiration. Just as there are many remote causes of
plague — heat, insects, rats — but only one common cause, the plague bacillus,
there are a great many remote causes of Cancer — tar, rays, arsenic, pressure, ure-
thane — but there is only one common cause into which all other causes of Cancer
merge, the irreversible injuring of respiration.
The irreversible injuring of respiration is followed, as the second phase of Cancer
formation, by a long struggle for existence by the injured cells to maintain their
structure, in which a part of the cells perish from lack of energy, while another
part succeed in replacing the irretrievable lost respiration energy by fermentation
energy. Because of the morphological inferiority of fermentation energy, the highly
differentiated body cells are converted by this into undifferentiated cells that grow
wildly — the Cancer cells.
To the thousands of quantitative experiments on which these results are based,
I should like to add, as a further argument, the fact that there is no alternative
On the Origin of Cancer Cells 329
today. If the explanation of a vital process is its reduction to physics and chemistry,
there is today no other explanation for the origin of Cancer cells, either special or
general. From this point of view, mutation and carcinogenic agent are not alterna-
tives, but empty words, unless metabolically specified. Even more harmful in the
struggle against Cancer can be the continual discovery of miscellaneous Cancer
agents and Cancer viruses, which, by obscuring the underlying phenomena, may hin-
der necessary preventive measures and thereby become responsible forcancercases.
Technical Considerations and Comments
Metabolism of the ascites Cancer cells. The high fermentation of ascites Cancer cells
was discovered in Dahlem in 195112 and since then has been confirmed in many
works13' 14. For best measurements, the ascites cells are not transferred to Rin-
ger's Solution but are maintained in their natural medium, ascites serum, which is
adjusted physiologically at the beginning of the measurement by addition of
glucose and bicarbonate. Because of the very large fermentation, it is necessary
to dilute the ascites cells that are removed from the abdominal cavity rather con-
siderably with ascites serum; otherwise the bicarbonate would be used up within
a few minutes after addition of the glucose, and hence the fermentation would be
brought to a standstill.
Under physiological conditions of pH and temperature, we find the following
metabolic quotients in ascites serum15 :
<2o2 = — 5 to — 10
QM°2 = 25 to 35
QMN2 = 50 to 70
where Qo2 is the amount of oxygen in cubic millimeters that 1 milligram of tissue
(dry weight) consumes per hour at 38° C with oxygen Saturation, Qm°2 is the amount
of lactic acid in cubic millimeters that 1 milligram of tissue (dry weight) develops
per hour at 38° C with oxygen Saturation, andQMx-2is the amount of lactic acid in
cubic millimeters that 1 milligram of tissue (dry weight) develops per hour at 38° C
in the absence of oxygen.
Even higher fermentation quotients have been found in the United States with
other strains of mouse ascites Cancer cells13' 14.
All calculations of the energy-production potential of Cancer cells should now
be based on the quotients of the ascites Cancer cells, since these quotients are 2
or 3 times as large anaerobically as the values formerly found for the purest solid
tumors. The quotients of the normal body cells, however, remain as they were
found in Dahlem in the years from 1924 to 192916"19. It is clear that the difference
in metabolism between normal cells and Cancer cells is much greater than it for-
merly appeared to be on the basis of measurements on solid tumors.
Utilizable energy of respiration and fermentation. Since the discovery of the oxida-
tion reaction of fermentation in 193920, we have known the chemical reactions by
which adenosine diphosphate is phosphorylated to adenosine triphosphate in
fermentation; and since then we have found that 1 mole of fermentation lactic
acid produces 1 mole of adenosine triphosphate (ATP).
330 On the Origin of Cancer Cells
The chemical reactions by which ATP is synthesized in respiration are still un-
known, but it can be assumed, according to the existing measurements21, that 7
moles of ATP can be formed when 1 mole of oxygen is consumed in respiration.
ATP quotients. If we multiply Oo2 by 7 and QmN2 by 1, we obtain the number of
cubic millimeters of ATP that 1 milligram of tissue (dry substance) can synthesize
per hour (22,400 cubic millimeters = 1 millimole of ATP). We call these quotients
<2atp°2 and <2atpN23 according to whether the ATP is formed by respiration or by
fermentation, respectively.
Energy production of Cancer cells and of normal body cells. In Table 1, the Q values
of some normal body cells are contrasted with the Q values of our ascites Cancer
cells.
The cancer cells have about as much energy available as the normal body cells,
but the ratio of the fermentation energy to the respiration energy is much greater
in the cancer cells than it is in the normal cells.
Uncoupling of respiration. If a young rat embryo is transferred from the amniotic
sac to Ringer's Solution, the previously transparent embryo becomes opaque and
soon appears coagulated17. At the same time, the connection between respiration
and phosphorylation is broken; that is, although oxygen is still consumed and
carbon dioxide is still developed, the energy of this combustion process is lost for
life. If the metabolism quotients had previously been
Qo2 = -155QM°2 = 0,QMN2= 25,
Qatp°2= 105,QATPN2 = 25
in the amniotic fluid, afterward, in Ringer's Solution, they are
Qoo = - 15,<2m°2 = 25,QMN2 = 25,
Qatp°2 = 0,Qatpn2 = 25
Because of uncoupling of respiration and phosphorylation, the energy produc-
tion of the embryo has fallen from <2atp°2 + QatpN2 = 130, to 25; since the un-
coupling is irreversible, the embryo dies in the Ringer's Solution.
This example will show that the first phase of carcinogenesis, the irreversible
damaging of respiration, need not be an actual decrease in the respiration quotient
but merely an uncoupling of respiration, with undiminished over-all oxygen con-
sumption. Ascites cancer cells, which owe their origin primarily to an uncoupling
of respiration, could conceivably have the following metabolism quotients for
example: Qo2= 50,QM°2 = ioo,QMN2 = ioo,
Qatp°2 = 0,Qatpn2 = 100
which would mean that, despite great respiration, the usable energy production
would be displaced completely toward the side of fermentation. One will now have
to search for such cancer cells among the ascites cancer cells. Solid tumors — and
especially solid spontaneous tumors — need no longer be subjected to such exami-
nations today, of course, since the solid tumors are usually so impure histologically.
Aerobic fermentation. Aerobic fermentation is a property of all growing cancer cells,
but aerobic fermentation without growth is property of damaged body cells — for
On the Origin of Cancer Cells 331
example, embryos that have been transferred from amniotic fluid to Ringer's Solu-
tion. Since it is always easy to detect aerobic fermentation but generally difficult
to detect growth, or lack thereof, of body cells, aerobic fermentation should not
be used as a test for cancer cells, as I made clear in 19281!).
Nevertheless, misuse is still made of aerobic fermentation. Thus, O'Connor2-
recently repeated our old experiments on the aerobic fermentation of the em-
bryo that has been transferred into Ringer's Solution, but he drew the conclusion
that the growth of normal body cells is completed at the expense of the aerobic
fermentation, even though it has long been established that the embryo does not
ferment aerobically when it grows in the amniotic fluid.
Respiratory poisons. The specific respiration-inhibiting effect of arsenious acid
and the irreversibility of its inhibitions were discovered in the first quantitative
works on cell respiration23- 24. There is abundant literature on the carcinogenesis
by arsenic, particularly on arsenic cancer after treatment of psoriasis and on the
cancer of grape owners who spray their vineyards with arsenic. The specific
respirationinhibiting effect of hydrogen sulfide has likewise been described by
Negelein25, and carcinogenesis by derivatives of hydrogen sulfide has been recently
described by D. N. Gupta26.
The irreversible inhibition of cell respiration by urethane was discovered early27
as well as the fact that the urethane inhibition is more irreversible the higher the
temperature. In sea urchin eggs, the effect of urethane was investigated, not only
on the metabolism, but also on cell division in studies28 from which the later
urethane treatment of leukemia was developed. The physicochemical mechanism
by which urethane and other indifferent narcotics inhibit cell respiration was
cleared up in 192129. Only much later did the carcinogenic effect of urethane become
known. Actually, multiple lung adenomas can often be produced in 100 percent
of the mice treated with small doses of urethane30.
Oxygen deficiency. Short-period oxygen deficiency irreversibly destroys the respi-
ration of embryos16 without thereby inhibiting the anaerobic fermentation of the
embryo. If such embryos are transplanted, teratomas are formed31. It has recently
been reported that, in the development of the Alpine Salamander, malformations
occurred when the respiration was inhibited by hydrocyanic acid in the early stages
of embryonal development32.
Goldblatt and Cameron3 reported that, in the in vitro culturing of fibroblasts,
tumor cells appeared when the cultures were exposed to intermittent oyxgen de-
ficiency for long periods, whereas, in the control cultures, no tumor cells appeared.
In the discussion at the Stuttgart Convention, Lettre cited against Goldblatt
and Cameron the fact that another American tissue culturist, Earle, has occa-
sionally obtained tumor cells from fibroblasts for reasons unknown to him and in
an unreproduceable manner, but this objection does not seem weighty, and the
latter part is untrue33. In any event, here is an area in which the methods of tissue
culture could prove useful for cancer research. But warnings must be given against
metabolism measurements in tissue cultures, if and when the tissue cultures are
mixtures of growing and dying cells, especially under conditions of malnutrition.
332 On the Origin of Cancer Cells
Tabel 1. Contrast of theQ values of some normal body with cells the Q values
of ascites Cancer cells.
Cells Qoo <2mN2 Qatp°2 QatpN2 Qatp02 + QatpN2
Liver
- 15
1
105
1
106
Kidney
- 15
1
105
1
106
Embryo (very young)
- 15
25
105
25
130
Cancer
7
60
49
60
109
An example of the latter type of confusion is involved in the discussion by Albert
Fischer34, especially in the chapter "Energy exchange of tissue cells cultivated in
vitro."
Rous agent. If the Rous agent is inoculated into the chorion of chick embryos,
tumors originate in the course of a few days — as rapidly as in the transplantation of
cancer cells. The tumors formed are not chorion tumors but Rous sarcomas. The
Rous agent, to which a particle weight of 150 million is ascribed at present, is
therefore capable of transmitting the morphological properties of the Rous sar-
coma; and whatever we call the Rous agent — "hereditary unit", cell fragment,
microcell, or spore — the transmission of the Rous sarcoma by the Rous agent is,
in any case, nothing more than a transplantion and is to be differentiated strictly
from the production of a chicken sarcoma by methylcholanthrene, which is a neo-
formation of a tumor from normal body cells and as such takes a long time.
The metabolism of the chicken sarcomas, whether produced by the Rous agent
or by methlycholanthrene, is the same and does not differ in any way from the
metabolism of the tumors of other animals35. In the first case, however, the fer-
mentation potential has been transplanted with the Rous agent, whereas in the
second case the fermentation has been intensified by selection from normal body
cells under the action of the methylcholanthrene.
Addendum: in vitro Carcinogenesis and Metabolism
Since this paper was prepared, striking confirmation and extension of its main con-
clusions have been obtained from correlated metabolic and growth studies of two
lines of tissue culture cancer cells of widely differing malignancy that were both
derived from one and the same normal, tissue-culture cell36. The single cell was
isolated some 5 years ago from a 97-day old parent culture of normal subcutaneous
adipose tissue of a strain C3H/He mouse by Sanford, Likely, and Earle33 of the
National Cancer Institute. Up to the time that the singlecell isolation was made, no
tumors developed when cells of the parent culture were injected into strain C3H/
He mice. Injections of in vitro cells of the lines 1742 and 2049 (formerly labeled
substrains VII and III, respectively) first produced tumors in normal C3H/He
mice after the 12th and 19th in vitro transplant generations, respectively; after
l1/2 years, the percentage production of sarcomas was 63 and Opercent, respectively;
and after 3 years, it was 97 and 1 percent, respectively, with correspondingly
marked differences in length of induction period. Despite such gross differences
On the Origin of Cancer Cells 333
in "malignancy" in vivo, the rates of growth of the two lines of cells maintained
continuously in vitro have remained nearly identical and relatively rapid. Neverthe-
less, the metabolism of the two lines of Cancer cells, whose malignancy was deve-
loped in vitro, has been found by Woods, Hunter, Hobby, and Burk to parallel
strikingly the differences in malignancy observed in vivo, in a manner in harmony
with the predications and predictions of this article.
The metabolic values were measured following direct transfer of the liquid cul-
tures form the growth flasks into manometric vessels, without notable alteration
of environmental temperature, pH, or medium composition (horse serum, chick
embryo extract, glucose, bicarbonate, balanced saline). The values obtained thus
accurately represent the metabolism of growing, adequately nourished, pure lines
of healthy Cancer cells free of admixture with any other tissue cell type. The
anaerobic glycolysis of the high-malignancy line 1742 was QMNa == 60 to 80, which
is virtually maximum for any and all Cancer cells previously reported, including
ascites cells12"14. The anaerobic glycolysis of the low-malignancy line was, how-
ever, only one-third as great, QMN2 = = 20 to 30. The average aerobic glycolysis
values for the two lines were in the same order, QM°2 == 30 and 10, respectively,
but of lower magnitude because of the usual, pronounced Pasteur effect, greater
in line 1742 than in line 2049 (QMN'2— Qm°2 == about 40 and 15). On the other
hand, the rates of oxygen consumption were in the converse order, being smaller in
line 1742 (Qo2 == 5 to 10) than in line 2049 (Q0.2 == 10 to 15), corresponding to
a greater degree of respiratory defect in line 1742. The respiratory defect in both
lines was further delineated by the finding of little or no increase in respiration
after the addition of succinate to either line of cells, in contrast to the considerable
increases obtained with virtually all normal tissues9; and the respiratory increase
with paraphenylenediamine was likewise relatively low, compared with normal
tissue responses.
A further notable difference between the two cell lines was the very much lower
inhibition of glycolysis by podophyllin materials (anti-insulin potentiators) ob-
served with line 1742 compared with line 2049 (for example, 10 and 70 percent,
respectively, at a suitably low concentration). This result would be expected on the
basis of the much greater loss of anti-insulin hormonal restraint of glucose meta-
bolism, at the hexokinase phosphorylating level, as the degree of malignancy is
increased, just as was reported for a spectrum of solid tumors14.
Finally, the high-malignancy line 1742 cells have been found by A. L. Schade
to contain 3 times as much aldolase as the low-malignancy line 2049 cells (11, —
300 versus 3700 Warburg activity units per milliliter of packed cells extracted),
and about 2 times as much «-glycero-phosphate dehydrogenase [2600 versus 1400
Schade activity units13 per mililiter of packed cells extracted]. The potential signi-
ficance of these indicated enzymic differences in relation to the parallel glycolytic
differences, measured with aliquots of the same cell cultures, is evident, and may
well be connected with the corresponding hexokinase System differences.
The new metabolic data on the two remarkably contrasting lines of Cancer cells,
which originated from a single, individual cell and have been maintained exclusively
in vitro over a period of years, epitomize and prove finally the main conclusions of
334
On the Origin of Cancer Cells
this article, which are based on decades of research. Such metabolic analyses pro-
vide promise of a powerful tool for diagnosis of malignancy in the ever-increasing
variety of tissue-culture lines now becoming available in this rapidly expanding
biological and medical field, where characterization of malignancy by conventional
methods (animal inoculation or otherwise) may be difficult or impracticable. This
metabolic tool should be especially important in connection with the use of tissue
cultures for the evaluation of chemotherapeutic agents or other control procedures.
References and Notes
1 The transplantable ascites Cancer was discovered by
H. Loewenthal and G. Jahn [Z. Krebsforsch. 37
(1932), 439]. G. Klein (Stockholm) expanded our
knowledge about the physiology and morphology of
the ascites tumors and showed their great advantages
as experimental material. [Exptl. Cell Research 2
(1951), 518].
2 Lynen, F., Naturwissenschaften 30 (1942), 398; Ann.
Chem. Justus Liebig 573 (1951), 60.
3 Goldblatt, H., and Cameron, G., J. Exptl. Med. 97
(1953), 525.
4 Warburg, O., Pflügers Arch. ges. Physiol. 154 (1913),
599; 158 (1914), 19.
5 Darlington, C D., Brit. J. Cancer 2 (1948), 118.
6 Woods, M. W., et al., J. Natl. Cancer Inst. 11 (1951),
1105; 9 (1949), 311; 9 (1949), 325; 16 (1955), 351.
Science 102 (1945), 591; 111 (1950), 572. AAAS
Research Conf. on Cancer (Science Press, Lancaster,
Pa., 1945), p. 162. J. Wash. Acad. Sei. 42 (1952), 169.
Pigment Cell Growth, M. Gordon, Ed. (Academic
Press, New York, 1953), p. 335. Biochem. et Biophys.
Acta 12 (1953), 329. Proc. Am. Assoc. Cancer Research
1 (1954), 7. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 83 (1953), 62.
Phytopathology 33 (1943), 637, 766; 36 (1946), 472;
31 (1941), 978; 32 (1942), 288. Am. J. Botany 33 (1946),
12a; 38(1951), 419.
7 A compilation of American works on the metabolism
of the grana, in which my results of 1914 (4) have been
confirmed, is given by G. Hogeboom, W. Schneider
andM. Striebich in Cancer Research [13(1953), 617].
In a very special case — nucleated red blood cells of
birds, which contain no grana or only poorly visible
ones — the entire respiration can be centrifuged off
with the cell nuclei [O. Warburg, Hoppe-Seyler's Z.
physiol. Chem. 70 (1913), 413].
8 Graffi, A., Z. Krebsforsch. 49 (1939), 477.
9 Burk, D., Symposium on Respiratory Enzymes (Univ.
of Wisconsin Press, Madison, 1942), p. 235; J. G.
Kidd, R. J. Winzler, D. Burk, Cancer Research 4
(1944), 547.
10 Pasteur, L., Etudes sur la Biere (Masson, Paris, 1876),
p. 240.
11 Craigie, J., J. Pathol. Bacteriol. 63 (1951), 177; 64
(1952), 251. H. Hamperl, Verhandl. Deut. Ges. Pathol.
35 (1951), 29.
12 Warburg, O., and Hiepler, E., Z. Naturforsch. 7b
(1952), 193.
13 Schade, A. L., Biochim. et Biophys. Acta 12 (1953),
163.
14 Woods, M., Hunter, J., Burk, D., J. Natl. Cancer
Inst. 16 (1955), 351.
1 5 I am indebted to Georg Klein of the Karolinska Insti-
tute, Stockholm, Sweden, for his Ehrlich strain of
mouse ascites cells.
16 Warburg, O., Posener, K.; Negelein, E., Biochem.
Z. 152 (1924), 309.
17 Negelein, E., ibid. 165 (1925), 122.
18 Warburg, O., et al., ibid. 189 (1927), 114, 175, 242;
193 (1928), 315; 197 (1928), 175; 204 (1929), 475, 479.
19 ibid. 204 (1929). 482.
20 et al., ibid. 303 C1939), 40, 132.
21 Krebs, H. A., et al., Biochem. J. London 54 (1953),
107.
22 O'Connor, R. J., Brit. J. Exptl. Pathol. 31 (1950), 390.
23 Warburg, O., Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 70
(1911), 413; M. Onaka, ibid. 70 (1911), 433; 71 (1911),
193.
24 Dresel, K., Biochem. Z. 178 (1926), 70.
25 Negelein, E., ibid. 165 (1925), 203.
26 Gupta, D. N., Nature 175 (1955), 257.
27 Usui, R., Pflüger's Arch. ges. Physiol. 147 (1912), 100.
28 Warburg, O., Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 66
(1910), 305; 70 (1911), 413.
29 Biochem. 119 (1921), 134.
30 Larsen, C. D., J. Natl. Cancer Inst. 8 (1947), 63.
31 Warburg, O., Biochem. Z. 228 (1930), 257.
32 Tiedemann, H., and Tiedemann, H.. Z. Naturforsch.
9b (1954), 371.
33 Sanford, K. K., Likely, G. D., Earle, W. R., J. Natl.
Cancer Inst. 15 (1954), 215.
34 Fischer, A., Biology of Tissue Culture (Copenhagen,
Der.mark, 1946).
35 Warburg, O., Biochem. Z. 160 (1925), 307; D. Burk
et al., J. Natl. Cancer Inst. 2 (1941), 201.
36 This summary of studies of various collaborating
groups of investigators was prepared by Dean Burk
at Professor Warburg's request.
36 On Respiratory Impairment in Cancer Cells*
By Sidney Weinhouse
Some years ago Otto Warburg1 enunciated a theory of Cancer which, briefly
summarized proposed that Cancer originäres when a nonneoplastic cell adopts an
anaerobic metabolism as a means of survival after injury to its respiratory System.
According to Warburg, the tumor is initiated by a damaged respiration, which
persists as a characteristic feature of the neoplastic condition. In a recent paper,
entitled "On the origin of Cancer cells," originally published in German2 and then
translated into English3, Warburg reiterates this hypothesis and claims further
support for it on the basis of experiments with ascites tumor cells. I recognize the
great debt that biochemists owe this illustrious investigator and regret the necessity
of taking issue with his basic biochemical premise, namely, that cancer cells have
an impaired respiration.
In a comprehensive review of this subject in 1939, Burk4 first pointed out the
essentially fallacious reasoning behind this hypothesis. More recently, Schmidt5
and I6 reviewed this topic independently in the light of modern findings and con-
cluded similarly that there is no sound experimental basis for the belief that oxi-
dative metabolism in tumors is impaired. It is recognized by all, including War-
burg, that despite their high glycolysis, oxygen consumption is not quantitavely
diminished; by and large, a representative group of tumors absorb oxygen about
as rapidly as a comparable group of nonneoplastic tissues (see, for example, Burk's
extensive tables4). An early Statement by Warburg, illustrative of his views concer-
ning the relationship between the high aerobic and anaerobic glycolysis of tumor
cells and their oxygen consumption, is the following pp- i»-"i).
"We determined the Meyerhof quotient for Carcinoma tissue, lactic acid bac-
teria, embryonic tissue and a number of other glycolyzing tissues, and as a rule
obtained the same mean values as Meyerhof. As a rule 1 mol. of breathed oxygen^
just as in muscle, causes the disappearance of 1— 2 mol. lactic acid. This result . . _
* Republished from Science 124 (1956): 267 by permission.
Zusatz 1961. Die anaerobe Gärung der Asciteskrebszellen der Maus hat in
Serum den mittleren Wert Q.^2 = = 70, der Meyerhofquotient der embryonalen
Zellen in Serum hat einen Mittelwert von 1,5. Wären die Krebszellen embryonale
Zellen, so müßte die Atmung Qo, der Krebszellen den Wert 70/1,5 == 47 haben,
während wir im Mittel Qo, == 7 finden. Dies meinen wir, wenn wir sagen, daß die
Atmung der Krebszellen zu klein ist, obwohl wir wissen, daß z. B. Bindegewebe
eine so niedrige Atmung wie Qo, = 1 hat. Im übrigen ist unser Hauptergebnis, die
fakulatative Anaerobiose der Krebszellen im Körper, nicht durch eine ununter-
brochene „reiteration" erhalten worden, sondern durch eine ununterbrochene
Folge von neuen Methoden und neuen Experimenten. Wer ein auf diese Weise
errichtetes Gebäude angreift, riskiert, daß er die Wahrheit angreift, eine wenig
adaequate Tätigkeit für einen Wissenschaftler.
336 On Respiratory Impairment in Cancer Cells
proves that the influence of the respiration on the cleavage metabolism in the car-
cinoma-cell is normal . . . Although in the tumor every oxygen molecule breathed
is just as effective as in muscle — the Meyerhof quotient is equal in the two cases —
yet the respiration does not cause the glycolysis to disappear. The respiration of the
Carcinoma tissue is too small in comparison with its glycolytic power."
Thus, according to Warburg, the Meyerhof quotient (a quantitative expression
of the Pasteur effect) is normal in Carcinoma, and oxygen consumption is also not
quantitatively diminished; but respiration is disturbed, because glycolysis persists
in oxygen. As I pointed out earlier (6> p- 276>, I believe it would be more accurate
to State that anaerobic glycolysis is so high in tumors that a normal respiration and a
normal Pasteur effect are incapable of eliminating it.
Although Warburg still states categorically that ". . . the respiration of all Can-
cer cells is damaged . . ." (3> p- 309), he has given no clearer justification now for
this view than he did 26 years ago. In Table l3, he shows that whereas liver, kid-
ney, and embryo have <2o-2's of — 15, the ascites tumor has a Qo2 of — 7. On these
grounds he concludes that the tumor cannot utilize sufficient oxygen for its needs
and thus requires fermentative energy. On the assumption that each mole of lactic
acid formed from glucose yields 1 mole of ATP, and each mole of oxygen con-
sumed gives rise to 7 moles of ATP, he calculates that the tumor obtains more than
half of its potential phosphate bond energy by glycolysis, whereas the three non-
cancer tissues obtain theirs mainly by respiration. Accepting these results at their face
value, it is still necessary to ask why some normal tissues manage to survive with-
out glycolysis with Qo-Ss of — 3 to — 6; also, why some tumors glycolyze highly
with QoSs as high as — 10 to — 20 (*■. pp- 438— 441>? It is also pertinent to ask why
certain nonneoplastic tissues, with moderate to high oxygen uptakes — for example,
brain, retina, kidney medulla, and intestinal mucosa — glycolyze as highly as many
tumors7 ? It is evident that all tumors produce large amounts of lactic acid, but so do
many noncancer tissues ; and just as noncancer tissues display a wide diversity in
oxygen uptake, so do tumors.
Although it is unintentional, I am sure, Table l3 gives misleading impressions
that the respiratory and glycolytic activities are constant and characteristic for a
single tissue, and that all tissues produce essentially the same amounts of phosphate
bond energy. Actually, tissue even from a single organ will vary considerably in
Qo> from one animal to another. In our experience, rat liver slices display Qoz's
ranging from — 6 to — 12 (usually about — 7), and rat kidney cortex from — 15 to
— 25. Biochemists are confronted with a wide variety of tissues of the most diverse
respiratory behavior. Our present State of knowledge does not allow any cate-
gorical Statements about what represents a proper respiratory activity for main-
tenance of either a normal or a Cancer cell; nor can we State what is an optimal
enzyme activity for a particular cell function.
Perhaps the most damaging evidence against the Warburg hypothesis has been
obtained in isotope tracer studies (6> pp 303ff)# The results of such studies leave no
doubt of the ability of miscellaneous tumors to convert glucose (and fatty acids)
to carbon dioxide at rates similar in magnitude to that of nonneoplastic tissues5' 6.
It is difficult to imagine a type of respiratory disturbance not involving either a
On Respiratory Impairment in Cancer Cells 337
diminution in oxygen consumption or a loss in the ability to convert glucose and
fatty acids to CCK
Warburg suggests in the present paper that perhaps the respiratory impair-
ment may involve an inability to couple oxidation with phosphorylation. Here
again, the available evidence does not support such a concept. Effects of inhibitors
such as fluoride ion or dinitrophenol are similar in neoplastic and nonneoplastic
tissues8 and data of other investigators (6= p- 321) have given no indication that oxida-
tive phosphorylation occurs in tumor mitochondria in a manner different from
that in their noncancerous counterparts.
Another pertinent illustration of the inadequacy of the Warburg concept is that
it fails to consider that a large part of the respiration of Cancer cells may be due to
fatty acid oxidation. Although it seems fairly certain now that animal tissues
generally, including the neoplastic, use fatty acids as a metabolic fuel, nowhere in
Warburg's writings is there any consideration of the possible role played by fatty
acids in the respiration of cells.
Another weakness of the Warburg hypothesis is that it does not fit in with what
we have learned in recent years of chemical mechanisms of glycolysis and respira-
tion. Again, Warburg states, "We need to know no more of respiration and fer-
mentation here than that they are energy-producing reactions . . ." (3> p- 309). This
attitude may have been justified 25 years ago when little was known of their chemi-
cal nature. At present we recognize that they are not "independent metabolic
processes" but are intimately related. To assume that respiration and glycolysis
are separately activated, alternate means of cellular energy production, it is indeed
necessary to ignore all that has been learned of their chemical mechanisms.
According to our present conceptions, the major pathway of oxidation of glu-
cose to carbon dioxide in most animal cells, whether normal or neoplastic, in-
volves its conversion to pyruvic acid by way of the Embden-Meyerhof process,
oxidative decarboxylation of pyruvic acid to acetyl coenzyme A, and condensation
of the latter with oxaloacetic acid to enter the citric acid cycle. Down to the pyruvic
acid stage, respiration and fermentation follow a common pathway. The extent
to which pyruvic acid, a common intermediary in both respiration and glycolysis,
competes for electrons held by the pyridine nucleotides with those factors that
transport electrons to oxygen — namely, the flavoproteins and cytochromes — should
be a crucial factor in determining the degree of aerobic glycolysis.
If there is a disturbance in respiration that leads to an accumulation of lactic
acid, it can occur only at or beyond the pyruvic acid stage and must be due either
to some aberration in carbon transport through the citric acid cycle or to some
"bottleneck" in electron transport. Many enzymatic and isotope tracer studies
have fully established that the citric acid cycle operates in tumors <ß> pp- 311 ff).
Although cytochromes are reportedly low in tumors (9>pp- 404ff)5 as are also someof
the B vitamins invclved in electron transport (9> p- 408), the generally unimpaired oxy-
gen consumption already referred to clearly indicates that electrons reach oxygen
about as readily in tumors as in other tissues. Thus, the available evidence indi-
cates to me that high glycolysis occurs, despite quantitatively and qualitatively
normal occurrence of carbon and electron transport. This can mean only that
22 Warburg, Zellphysiologie
338
On Respiratory Impairment in Cancer Cells
glucose catabolism is so rapid in tumors that the normal Channels for disposal of
pyruvic acid are overloaded. Many possibilities exist for explaining this high
glucose catabolism, which do not involve disturbances in respiration. My colleagues
and I are now attempting to unravel the multiplicity of factors concerned with lactic
acid production in the intact cell.
I do not wish to minimize the significance of the high aerobic and anaerobic
glycolysis of tumor tissue. It is conceivable that glycolytic activity, though not
resulting from a faulty respiration, may play a special role in the neoplastic process.
Data are available from the field of lipid metabolism, for example, which suggest
that some phase of glucose catabolism in liver is coupled with fatty acid synthesis10.
The close association of lactic acid production with the neoplastic process, and
with growth in general, makes this phenomenon a worthy subject of study.
Warburg states (3> p- 309), "We now understand the chemical mechanism of respi-
ration and fermentation almost completely . . ." We have, indeed, learned a great
deal of what can happen in cells, and much of this can be credited to Warburg, who
has played a large part in expanding our biochemical frontiers. The fact that pro-
gress has been so great in the past must make us aware, however, that future pro-
gress will also be great, and that our present knowledge is still primitive. Certainly
we have much to learn before we can feel we understand the mechanisms that
underlie the utilization of metabolic fuels for functional activities of cells.
References and Notes
1 Warburg, O., Metabolism of Tumors, translated by
F. Dickens (Constable, London, 1930).
2 Naturwissenschaften 402 (1955), 401.
3 Science 123 (1956), 309.
4 BuRK, D., Cold Spring Harbor Symposia Quant. Biol.
7 (1939), 420.
5 Schmidt, C. G., Klin. Wochschr. 33 (1955), 409.
fi Weinhouse, S., Advances in Cancer Research 3 (1955),
269. To save space, original references are not cited,
but references are given to the appropriate page of the
writer's review. This may be consulted for a more
detailed discussion of this subject.
7 Dickens, F., The Enzymes (Academic, New York,
1955), vol. II, pt. 1, p. 624.
8 Wenner, C. E., and Weinhouse, S., Cancer Research
15 (1955), 497.
9 Greenstein, J. P., Biochemistry of Cancer (Academic,
New York, 1954).
10 Gurin, S., Fat Metabolism (Johns Hopkins Press,
Baltimore, Md., 1954), p. 138.
36a On Respiratory Impairment in Cancer Cells'
By Dean Burk und Arthur L. Schade
A mass of experimental data published diiring the past 33 years has established
the phenomenon of a metabolism characteristic of living Cancer cells, including
high anaerobic and aerobic glycolysis (formation of lactic acid from glucose) and an
impaired respiration1,2- The impaired respiration may involve any combination —
usually at least three — of the following experimental quantities readily measurable
under appropriate conditions: (i) a high ratio of glycolysis to respiration; (ii) a low
absolute value for oxygen consumption (<2o2); (iü) an inefficient or uncoupled
respiration; or (iv) a low paraphenylenediamine (succinate) oxidative response3.
This list could be expanded.
Respiratory impairment in living Cancer cells, first discovered by Otto War-
burg in 1923, is an experimental fact, and not, as described by Weinhouse4,5 a
hypothesis based on "essentially fallacious reasoning". Statements of Weinhouse
indicating that the author of "Burk's extensive tables" has at any time ever denied
the factual existence of an impaired respiration in Cancer cells are categorically
untrue.
The overwhelming evidence for the occurrence of various forms of respiratory
impairment in neoplastic cells, available in some 1000 experimental papers, but
denied by Weinhouse, obviously cannot be recapitulated in this note. It is, how-
ever, possible to outline here decisive errors in the most tangible support offered
by Weinhouse for his central, underlying view that "by and large, a representative
group of tumors absorb oxygen about as rapidly as a comparable group of nonneo-
plastic tissues . . . oxygen consumption is not quantitavely diminished"6. Curious-
ly, this longdiscarded but now exhumed view, which specifically denies a low<2o2
in most Cancer cells (impairment ii), is alleged to derive its main support from
"Burk's extensive tables"7. Weinhouse 4' (p 271) has selectively Condensed parts
of these extensive tables, on some incompletely defined basis, and arrived at the
following average tissue slice<2o2 values for three groups of tissues, each of which
has a wide spread of individual values: 15 types of malignant tumors, — 11.8; seven
growing tissues (three types), — 9.7; 14 nongrowing tissue types, — 9.3. In short,
by these statistics, the tumors would appear to have an average ("by and large")
respiration that is not lower, but even higher, than that of either the growing or
nongrowing tissues selected as "comparable".
But such average Ooo values are meaningless as they stand, both statistically and
otherwise. They have not been adjusted for important species differences among
the three groups, for medium effects, for cellular impurity in the tumors (normal
tissues, ordinarily being 100 percent nonneoplastic, need no such adjustment), for
differences of technique among the different investigators cited, and so forth. A
remarkable error is Weinhouse's inclusion, in the already small group of growing
* Republished from Science 124 (1956): 270 by permission.
340 On Respiratory Impairment in Cancer Cells
tissues, of certain tissues that had first been severely predamaged by treatment with
Cyanide and anaerobiosis ( !), thus lowering notably the calculated average Qq2 for
this group.
Weinhouse's Statistical approach to the problem of possiblego, impairment in
cancer cells requires the use of the foregoing adjustments just as surely as Cancer
mortality and morbidity statistics require adjustment, in the absence of complete
and perfect data. The types of adjustments listed all tend, without exception, to
raise theQo2 values of normal tissues relative to tumor tissues, with the end result
that, as one approaches truly physiological comparisons, one obtains average Q0.2
values for normal growing and nongrowing tissues that are "by and large" two
to three times higher than those for tumors, with reduction in spread of individual
values.
The first two types of adjustment listed are probably the most important
quantitatively and will be briefly discussed by way of illustration. It is well estab-
lished from the data extensively summarized and formalized, for example, by
Krebs* and Adolph9, that tissue respiratory rate, basal heat production, Venti-
lation rate, and a host of other vital properties are marked, linear log-log functions
of species body weight. The group of normal tissues selected by Weinhouse were
from the rat, rabbit, dog, and man, but none from mice; the tumor tissue types
selected were preponderantly from mice, the normal tissues of which have average
rates of respiration and basal heat production far above those of the larger species,
the basal heat productions being of the rough relative order 160, 100, 60, 35, and
25 in mice, rat, rabbit, dog, and man, respectively. Any reasonable (but impera-
tive !) adjustment of average respiratory rate for species difference alone would
place the tumor group well below that of the normal group, with an adjusted
average Qo* value of — 6 to —7 (instead of — 11. 8,10. This value agrees with the
grand average value that one obtains directly from all 30 widely varying types of
malignant, nonmouse tumors (rat, chicken, man) listed in "Burk's extensive
tables" VII and VIII7, many of which were excluded from, or improperly weighted
in, the selected and Condensed summary prepared by Weinhouse without due
regard to the effect of species. This single error in Weinhouse's statistics, by itself,
reverses the order of average Qa2 values among his three groups, so that non-
growing growing tumor.
The second factor, of equal quantitative importance in tending to widen further
the relative difference between normal and tumor tissues, is that in virtually all of
the experiments selected by Weinhouse from Burk's tables, simple saline media
were e mployed, instead of sera or similar body fluids that are much more physio-
logical and therefore much more pertinent for the Solution of the problem at hand.
Extensive modern studies show, even better than earlier studies, that the use of
sera instead of saline media increases the average Qo2 values of normal tissues much
more than that of tumors— by a relative factor up to 2 and more. This differential
response is due partly, though not wholly, to the greater response of normal tissue
to respiratory Substrates occurring naturally in sera but not added to the early
saline media employed in the experiments selected by Weinhouse. This differential
response finds equivalent and additional expression in the relatively small succin-
On Respiratory Impairment in Cancer Cells 341
ate oxidative response shown by tumor tissue [impairment type iv; compare Kidd
et alß and Weinhouse ^ *■ 302> ].
It is obvious that in the hands of Weinhouse the Statistical approach has led to
gross error in final conclusion. This erroneous conclusion has been woven into
his papers4, 5 extensively and affects still other conclusions based on it, leading to
general confusion not confined to his own papers11.
The error concerning species adjustment that Weinhouse has introduced into
his consideration of "Burk's extensive tables" enters with equal force into var-
ious of his conclusions concerning his own experimental data4, 5 obtained with
isotopically marked Substrates, where again results with miscellaneous rat and
mouse materials are often mixed indiscriminately; Space, however, does not per-
mit tabular detailing of his propagation of errors in this direction. Suffice it to say,
his own data reported onOo2 (sketchy, but republished verbatim many times) show
lower average species unadjusted Q02 values for the tumors ( — 5.3 for 19 deter-
minations) than for the normal tissues ( — 9.5 for 19 determinations) in saline-
substrate (nonserum) media. Unfortunately, the mouse data contain only one
normal tissue (liver) and several tumor types, whereas the rat data contain only
one tumor type (hepatoma) and several normal tissues. If more normal mouse-
tissue types and more rat-tumor types had been available for proper species ad-
justment, the adjusted values (for either species) would have been even wider apart
than — 5.3 and — 9.5, since the Oa> of hepatoma is relatively high among tumors
and the Qq2 of normal liver tissue is relatively low among highly functional nor-
mal tissues.
When, in more extensive experimentation, C14-marked Substrates were tested
(glucose, lactate, and 2,4-acetoacetate), there was in general a relatively much
greater aerobic production of C14Oo by the normal tissue groups than by the tumor
groups employed. On an absolute basis, <2c14o2 in the tumors rarely exceeded 2
("O.C." = 89), and were ordinarily well below 1 ; but normal tissues ranged up to
<2c14o2 = ^ and more, notably with lactate, an important constituent of sera. These
isotope tracer studies of Weinhouse show that fatty aeids and a wide variety of
exogenous Substrates may be oxidized to carbon dioxide by a miscellany of rat and
mouse tumors, but only at quite small initial rates that were on the average lower
than the average of initial rates shown by the highly functional normal rat and mouse
tissues tested. Such studies largely confirm, albeit with superior quantitative
finesse, widely aeeepted conclusions reached decades ago by investigators who had
employed time-honored kinetic, substrate-addition, and respiratory quotient
methods.
G. N. Lewis1'2 has said, "It is a common fault of mankind to refuse to recognize
the extence of a phenomenon unless some mechanism has been devised." Much
of the general confusion11, 13 evident in the discussion advanced by Weinhouse
also derives from his failure to distinguish between various over-all phenomena of
respiratory impairment, on the one hand, and detailed mechanisms thereof, on the
other. In his own experimental work he has looked for respiratory impairment
among details of biochemical respiratory mechanisms, following well-worn
Channels of possible aberrancy — for example, enzyme content14, citric aeid cycle,
342 On Respiratory Impairment in Cancer Cells
exogenous Substrate Oxydation, localized "bottlenecks" in electron transport,
pyruvate shunt, hexosemonophosphate shunt, and fluoride and dinitrophenol
inhibitions. The results obtained by him, even with isotopic tracers, have in no
way contra-indicated the over-all phenomena of respiratory impairment, and have
indeed provided some valuable supporting evidence. In any event, such conven-
tional and assuredly worthwhile studies are, regardless of outcome, no more essen-
tial to experimental recognition of the overall phenomena of respiratory impair-
ment in living Cancer cells than is knowledge of the ultimate physical mechanism
of gravitation essential to experimental recognition of the Square law of gravitation.
In the words of Isaac Newton15, "the main Business of Natural Philosophy is to
argue from Phaenomena . . . we must learn from the Phaenomena of Nature what
are the Laws and Properties of the Attraction before we enquire the Cause by which
the Attraction is perform'd."
It is a tribute to the genius of Otto Warburg that he discovered the impaired
<2o2 of Cancers more than 30 years ago with the now absolete methods and relatively
poor (mixed) Cancer materials then available, and under the handicap of the
Statistical approach. It is a further tribute that in recent years Warburg has been
the first to appreciate and capitalize on the importance of the use of pure Cancer
cells (for example, ascites and tissue culture cells) for final decision on the relative
Status of Qo2 in Cancer cells. It should never be forgotten, however, that in the
characterization of Cancer metabolism, once developed following carcinogenesis,
he has always (1924 — 1956) regarded the invariably high ratio of fermentation to
respiration (impairment type i) as of much greater significance than the usually
low<2<)2 (impairment type ii).
On the basis of impairment type i, and as a confirmatory qualitative demon-
stration thereof, the following simple manometric test has been devised16 that per-
mits investigators to distinguish Cancer cells from virtually all normal body cells,
growing or nongrowing. The cells under test are placed in a manometric vessel of
any convenient size. The vessel is filled to one-third to one-half of its volume with
physiological serum or other equivalent body fluid (5 percent CO-2 in O2 or air as
appropriate, slight alkalinity, adequate glucose and bicarbonate). The volume of
cells is of the order of 1/300 the volume of serum. Cancer cells cause the mano-
meter to register a steady and notable increase in pressure with time (minutes to
hours), whereas normal (uninjured) body cells cause a negative (or <~ zero) change
in pressure with time. The few — if any — exceptions extant are only apparent, or
are readily ruled out on other bases ; thus, use of nonphysiological media (for ex-
ample, unfortified saline) may vitiate the test for normal cells, and Omission of the
carbohydrate glucose certainly will for Cancer cells.
This test can be made quantitative, but in the simple form just outlined it pos-
sesses the advantage of being qualitative. It offers a distinction between neoplastic
and normal cells that is as qualitative as "plus versus minus" or "up versus down,"
and that is observable in terms of mere pressure change — that is, directional
movement of the manometric fluid. The quantitative metabolic basis for the ob-
served qualitative manometry is completely understood. Thus, the sign and magni-
tude of the pressure change can be expressed as an exact mathematical function of
On Respiratory Impairment in Cancer Cells
343
the ratio of the absolute magnitude of aerobic glycolysis to the absolute magnitude
of respiration for any given conditions of experimental arrangement17.
It is hoped that this simple test may prove useful or definitive in studies of many
tissues or cells of questionable malignancy — for example, in tissue cultures of
originally normal cells that are undergoing or have undergone carcinogenesis, as
well as numerous in vivo instances. In any event, the proposed test is a post facto
epitomization of three decades of experimental protocols in the literature that are
in harmony with the concepts recapitulated in this communication on respiratory
impairment in "THE metabolism of THE Cancer cell."
References and Notes
1 Warburg, O., Biochem. Z. 142 (1923), 317; Metabo-
lism of Tumors, translated by F. Dickens (Constable,
London, 1930); Science 123 (1956), 309; Science, this
issue.
2 Various words expressing "impaired" respiration have
been employed by various writers, all, however, to
much the same gross end result, semantics aside:
damaged, destroyed, defective, diminished, disturbed,
eliminated, harmed, inadequate, inhibited, injured,
insufficient, limited, restrained, uncoupled, weakened,
eingeschränkt, entkoppelt, gehemmt, geschädigt, in-
suffizient, unzureichend, vergiftet, vermindert, zer-
stört, zugrunde gegangen, and zurückgegangen. In any
event, the irreversible respiratory limitation referred
to in Cancer cells is always partial, never total; other-
wise, their life and continued growth would totally
cease, so far as is known.
3 Kidd, J. G., Winzler, R. J., Burk, D., Cancer Re-
search 4 (1944), 457.
4 Weinhouse, S., Advances in Cancer Research 3 (1955),
239; Science, this issue.
5 Weinhouse, s., Antimetabolites and Cancer (AAAS,
Washington, D.C, 1955), p. 1; Cancer Research 11
(1951), 585, 845.
6 Weinhouse's frequently reiterated Statement that this
view held by him has now come to be held also by
Warburg is categorically incorrect, as simple inspec-
tion of the two recent articles by the latter in Science ( 1 )
will suffice to show, in addition to many others that
date back to 1924. Questioned directly regarding the
accuracy of this footnote, Warburg has provided writ-
ten, emphatic confirmation (July 1956).
7 Burk, D., Cold Spring Harbor Symposia on Quant.
Bio!. 7 (1939), 437, 441.
8 Krebs, H. A., Metabolism and Function (Elsevier,
Amsterdam, 1950), p. 249.
9 Adolph, E. F., Science 109 (1949), 579.
10 It is important to note that the Qo, values for the
mouse tumors of Crabtree and Murphy and Hawkins
(1925 — 29), selected by Weinhouse from Burk's tables
and averaging — 13.9 for ten types, are, in fact, excep-
tionally high when compared with most values for
mouse tumors obtained during the last 25 years by
others using improved manometric methods. In the
vvork of Dickens and Simer in 1930 — 31 (also cited in
Burk's tables) the Qo. values for the five mouse tumor
types reported on averaged only — 7.1 ! Three of these
types (sarcoma 37S, tar Carcinoma 2146, and spindle-
cell tar tumor 173) had an average Qo, of — 5.6, com-
pared with — 16.6 for the same tumor strains as meas-
ured by Crabtree and used by Weinhouse. Thus,
12
13
even the unadjusted average tumor Qo, value employed
by Weinhouse ( — 11.8) is, as the result of unwarranted
bias in selection and incomplete utilization of available
data, much too high.
1 1 Weinhouse's confusion is infectious, although mainly
among investigators who do not themselves perform
laboratory experiments on Cancer metabolism. One
may read, for example, "We hear about THE metab-
olism of THE cancer cell. Unfortunately, no such
phenomenon has been established. ... As Dr. Wein-
house said at the opening of the Symposium, the criti-
cal difference between metabolism in malignant tissues
and in normal tissues does not appear to reside in the
major ways in which they handle carbohydrate metabo-
lism." [Antimetabolites and Cancer (AAAS, Washing-
ton, D.C, 1955, pp. 305, 308)]. Such Statements could
scarcely be more incorrect or uninformed. They set the
clock back and encourage the empirical approach to
the problem of Cancer by a sheer and vicarious denial
of available fundamental Information.
Lewis, G. N., The Anatomy of Science (Yale Univ.
Press, New Haven, Conn., 1926), p. 171.
In paragraphs 4, 5, and 6 of his note in this issue of
Science, Weinhouse asks or raises several questions
that have been asked, discussed, and answered many
times in the literature of Cancer.
14 The mechanism of the cancer respiratory impairment
may indeed often involve lowered content of a parti-
cular respiratory enzyme, but this is not a necessary
general requirement, since internal cellular arrange-
ment and chemical or structural restraint of other cor-
related enzymes are, as in so many living phenomena,
often of more decisive importance. Thus, certain
ascites Cancer cells have been found [B. Chance and
L. N. Castor, Science 116 (1952), 200] to have un-
usually high contents of cy tochrome c ; but even in such
ascites cells, the paraphenylenediamine and succinate
oxidative responses are characteristically low or zero
(1, p. 314); this is clearly indicative of respiratory res-
traint in spite of abnormally high absoute content of
cytochrome c (compare 4, pp. 295 — 6). Oxidation-
reduction potential restraints may well be involved
here, as well as low contents of cytochrome b or
DPNH demonstrated.
15 Newton, L, Opticks (W. and J. Innys, London, ed. 2,
1718), pp. 344, 351.
Presented orally at the 1956 meeting of American Asso-
ciation for Cancer Research. [Proc. 2, 98 (Natl. Inst, of
Health Information Release, 13 Apr.)].
A description of these quantitative potentialities and
other qualitative aspects is in preparation.
16
17
36 b On Respiratory Impairment in Cancer Cells*
By Otto Warburg
In 1950 George Klein of the Karolinska Institute, Stockholm, was kind enough
to send to Dahlem a strain of mouse ascites Cancer that consists of nearly 100
percent Cancer cells, that can be transplanted with 100 percent takes, and that is
resistant to the shaking necessary in manometry.
Only since that time have we been able to determine quantitatively the metab-
olism of pure Cancer cells. All our previous experiments1 had been carried out
with solid tumors — that is, with various mixtures of Cancer cells and normal cells.
The more Cancer cells a tumor contained, the higher was the fermentation and the
lower was the respiration. But no absolute values could be obtained.
Thus, the year 1950 brought about the transition from the study of the metab-
olism of the mixed cells to the study of the metabolism of pure Cancer cells, a very
great progress in Cancer research-. Weinhouse3 is not appreciative of this progress,
or of many important discoveries made since 1925 — for example, the nonfermen-
tation of the rapidly regenerating liver; the structural difference between energy
production by respiration and by fermentation; the genetic autonomy of the
respiring grana and the role of grana in the pathology of neoplasms ; and carcino-
genesis by respiratory poisons. Most of the comment by Weinhouse might have
been written before 1925.
As expected, the fermentation of the pure Cancer cells was found to be much
higher than any previously observed fermentation of Cancer cell mixtures. Indeed,
mouse ascites Cancer cells produced anaerobically per hour nearly 30 percent of
their dry weight of lactic acid. In comparison with this enormous fermentation,
respiration of the pure Cancer cells was, as expected, very low.
Even more important were the results obtained in 1956 with Earle's in vitro
cultures of pure mouse Cancer cells. Such cells were available as two strains of high
and low "malignancy," both derived from one and the same single cell. When, in
the laboratory of Dean Burk, the respiration and the fermentation of these two
strains of different malignancy but the same genetic origin were measured, the
result was as follows : the higher the malignancy, the greater the fermentation and
the smaller the respiration (2 pp- 313-314) . The absolute fermentation values for the
high-malignancy cells were as high as the values for the mouse ascites Cancer cells.
These experiments with pure Cancer cells — the ascites cells and Earle's cells of
different malignancy — were decisive and conclusive. They correspond, in the
problem of relativity, to the observed red displacement in the gravitational field.
Among normal cells, the nearest equivalent to pure Cancer cells is the chorion
in the first days of embryonic development. The chorion grows rapidly. It is histo-
logically almost pure. It is so thin that it is not necessary to slice it for measure-
ments of metabolism. It is so hardy that it can be shaken many hours in mano-
Republished from Science 124 (1956): 269 by permission.
On Respiratory Impairment in Cancer Cells
345
metric vessels without disintegration. Anaerobically it produces 15 percent of its
dry weight of latcic acid per hour, but aerobically it produces no lactic acid at all.
Its respiration, in contrast to that of Cancer cells, is high— indeed, nearly three
times higher than the respiration of highly malignant, pure Cancer cells.
Unlike the chorion, the whole embryo itself is unsuitable for such in vitro ex-
periments, because it is disintegrated by the motion of the vessels if it is immersed
in salt Solutions or even in homologous serum. Yet the important question of
lactic acid production by the living embryo can easily be decided by lactic acid
determinations in the affluent and effluent blood vessels of an embryo in situ in a
pregnant animal. If an embryo produced as much lactic acid as Cancer cells, a very
great increase in the effluent vessels would be found. But no increase has been
found.
By these experiments — with chorion in vitro, and with the total embryo in vivo
— it has been shown that intact embryonic cells, in contrast to Cancer cells, pro-
duce no lactic acid aerobically.
Table 1 summarizes the average metabolic values obtained in serum with pure
Cancer cells of mice and with pure embryonic cells of mice. They constitute the
Cells
Qo,
Qm°2
Qmns
Ascites Cancer cells
Earle's Cancer cells (high malignancy)
Earle's Cancer cells (low malignancy)
Chorion of young embryos
7
30
70
7
30
70
13
10
25
17
0
35
Table 1. Average metabolic values obtained in serum with pure Cancer cells of mice and with pure
embryonic cells of mice. Qo2 means cubic millimeters of oxygen consumed, and Qm°2 and Qms2
mean cubic millimeters of lactic acid produced aerobically and anaerobically, respectively, per
milligram (dry weight), per hour.
main basic facts. QmN2 = 70 means that the high-malignancy Cancer cells produce
anaerobically per hour an amount of lactic acid equal to 29 percent of their dry
weight. The respiration, if normal, should be<2o2 == — 35, whereasOo2 == — 7 was
found. This means that the respiration of the high-malignancy Cancer cells is only
one-fifth ofthat of normal growing cells withO>iX2 = = 70, and only two-fifths ofthat
of growing chorion of young embryo with a<2MN~ = 35.
Obviously, nothing could be less enlightened than the opinion of Weinhouse
that the respiration of Cancer cells is as high, or even higher, than the respiration
of normal growing cells. "High" and "low" respiration have greatest significance,
of course, when compared with fermentation, as has been defined and emphasized
many times since 1923, not only by the early use of such specific quotients as
2m02/So23 and <2mN2/2o23 but in my words of 1924 cited by Weinhouse, "The
respiration of the Carcinoma tissue is too small comparison with its glycolytic
power." Without such specification, "high" and "low" can become meaningless;
thus, the absolute value of respiration of normal connective tissue is very low, and
yet it is no Cancer, because the fermentation too is very low.
346 On Respiratory Impairment in Cancer Cells
Many years before the respiratory enzymes and the fermentation enzymes of
oxidation-reduction were discovered at Dahlem, we reached the conclusion that
the biochemical mechanism of fermentation and respiration in Cancer cells is
qualitatively the same as in normal cells, the differences being only quantitative,
the one process being increased and the other decreased. Although later investi-
gators have confirmed this general conclusion, Weinhouse takes exception to the
phraseology "damaged respiration" of Cancer cells. But because the facts are so
clear and well defined, our abridged expression should not be objectionable. We
have here a perfect example of a dispute about words.
It is something deeper when Weinhouse dislikes the Statement that the shifting
of the energy production from the areobic to the anaerobic State is the cause of
Cancer. He feels that this is far too simple : How can Cancer, as mysterious as life
itself, be explained by such a simple physicochemical principle ?
Yet this feeling is not justified. The problem of Cancer is not to explain life,
but to discover the differences between Cancer cells and normal growing cells.
Fortunately this can be done without knowing what life really is. Imagine two
engines, the one being driven by complete and the other by incomplete com-
bustion of coal. A man who knows nothing at all about engines, their structure,
and their purpose, may discover the difference. He may, for example, smell it.
References
1 Warburg, O., Metabolism of Tumors translated by 3 Weinhouse, S., in Advances in Cancer Research 3
F. Dickens (Constable, London, 1930). (1955), 269; Science, this issue.
2 Warburg, O., Science 123 (1956), 309.
37 Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella*
Von Otto Warburg und Günther Krippahl
Die funktionelle CO2 der Chlorella ist die chemisch gebundene CO2, aus der bei der COo-Assimila-
tion das Licht den Sauerstoff entwickelt. Es wird in dieser Arbeit beschrieben., wie die funktionelle
COi entdeckt worden ist und wie man sie messen und ihre Eigenschaften untersuchen kann.
Sättigt man Chlorella mit COjfreiem Argon und fügt dann Fluorid hinzu1, so
wird in kurzer Zeit CO2 bis zu einem Endwert ausgetrieben, der gleich dem Chlo-
rophyllgehalt der Zellen ist, bei Variationen des Chlorophyllgehalts von 1% bis
8% des Zelltrockengewichts. ICh4-«. Blausäure verhindert die Austreibung der
CO2 durch Fluorid vollständig, ebenso 5 Min. Erwärmen auf 65°. Das Fluorid
wirkt also nicht direkt, sondern es setzt eine Fermentwirkung in Gang, bei der
Schwermetall CO2 aus einer Substanz abspaltet, die stöchiometrisch mit dem
Chlorophyll verbunden ist. — Die Fluoridwirkung ist reversibel. Bringt man die
mit Fluorid behandelten Zellen in reine Kulturlösung zurück, so vermehren sie
sich fast ebenso schnell wie nicht mit Fluorid behandelte Kontrollzellen.
Auch durch Zusatz eines Tropfens Octanol kann man aus 1 Mol Chlorophyll der
Chlorella 1 Mol CO> austreiben, doch ist die Octanolwirkung wegen der cytoly-
sierenden Eigenschaften des Octanols irreversibel. Die Octanolwirkung lehrt, daß
das mit organischen Lösungsmitteln isolierte Chlorophyll, also das Chlorophyll
Willstaetters und Hans Fischers, diese CO2 nicht enthält und daß sie des-
halb in der Chlorophyll formel von Hans Fischer nicht vorkommt.
Will man, daß nach der Austreibung der CO2 mit Fluorid die CO2 wieder ge-
bunden wird, so muß man der Chlorella nicht nur CO2, sondern auch O2 zur Ver-
fügung stellen. Zur Bindung der CO2 ist also Atmung oder, anders ausgedrückt,
Energie nötig.
Ist die CO2 gebunden, so kann das Licht O2 entwickeln. Ist aber die CO2 durch
Fluorid ausgetrieben, so kann das Licht keinen O2 entwickeln, soviel gelöste CO>
die Chlorella auch enthalten mag. Belichtet man andererseits Chlorella und gibt
dann Fluorid hinzu, so wird weniger CO2 ausgetrieben als aus nicht belichteten
Zellen. Aus alledem geht hervor, daß es die durch Fluorid austreibbare mit
Chlorophyll verbundene CO2 ist, aus der im Licht der O2 entwickelt wird, während
die gelöste CO> für das Licht nicht angreifbar ist. Die durch Fluorid austreibbare
CO> nennen wir deshalb die funktionelle CO2.
Unsere Auffassungen vom Mechanismus der C02-Assimilation werden hier-
* Aus Zeitschrift für Naturforschung IIb (1956): 718.
Zusatz 1961. Mit dieser Arbeit begann die Entwicklung, die zur Entdeckung
der „Glutaminsäure in Chlorella" und schließlich zur Entdeckung des Photolyten
der Kohlensäureassimilation geführt hat. Vergl. die Arbeiten 45 und 78 dieser
Sammlung. In dieser Arbeit ist der Begriff „funktionelle Kohlensäure" noch un-
klar, da die funktionelle Glutaminsäure noch nicht entdeckt war und also zwischen
Kohlensäure aus Glutaminsäure und aerober Kohlensäure noch nicht unterschie-
den werden konnte.
348
Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
durch bedeutend vereinfacht. Sensibilisierung und Radikale sind zur Erklärung
des Energieumsatzes nicht mehr notwendig, wissen wir doch nunmehr, daß die
CO-2 innerhalb desjenigen Moleküls reduziert wird, in dem das Licht absorbiert
wird. Daß aber Licht, das in dem einen Teil eines Moleküls absorbiert wird, in dem
andern Teil desselben Moleküls chemische Arbeit leisten kann, gehört zu den Grund-
tatsachen der Photochemie und ist von uns früher für den Fall eines Ferments in
besonders überzeugender Weise bewiesen worden2, für die Kohlenoxydverbindung
der Eisenoxygenase, deren Kohlenoxyd mit der Quantenausbeute 1 von dem Eisen
des Hämins abgespalten wird, wenn Licht in dem fernen Proteinteil, von dem Try-
ptophan und Tyrosin, absorbiert wird.
So kann man nunmehr in wenigen Worten und in der Sprache der Photochemie
zusammenfassen, was die CO-2-Assimilation ist. Es ist die Photolyse einer CO2-
Chlorophyllverbindung mit der Besonderheit, daß diese COo-Verbindung aus
energetischen Gründen nicht von selbst entstehen kann, sondern zu ihrer Ent-
stehung der Energie der Atmung bedarf, einer Atmung, deren Brennstoff das Licht
liefert :
3 (ChlCOo) + 3N0 ■ h ■ v = 3 Chi + 3 C + 3 02
2 C • 2 02 = 2 C02 - 2 • 100000 cal.
3 Chi + 3 COo == 3 (ChlCOo) — 2 ■ 100 000 cal.
Bilanz: 1 COo
3 N,
= 1 C - 1 O2
Alle in dieser Arbeit beschriebenen Versuche sind mit der einfachsten manome-
trischen Anordnung ausgeführt worden, mit den in Abb. 1 abgebildeten Kegeln.
Eine Erweiterung dieser einfachen Technik erlaubt es nunmehr, auch Reaktionen,
die bei höherer Temperatur ablaufen, manometrisch zu messen.
Argon
Fluorid
Suspension von
Chlorella
Abb. 1. Manometriegefäß
zur Bestimmung der funk-
tionellen Kohlensäure.
Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
349
1. Natriumfluorid, anaerob
Will man die funktionelle CO12, durch Fluorid austreiben, so muß die Suspen-
sionsflüssigkeit so sauer sein, daß ein erheblicher Teil des Fluorids als Fluorwas-
serstoffsäure vorliegt; denn nur die freie undissoziierte Säure dringt in die lebende
Chlorella ein. Wir suspendierten die Zellen in unserer Salzlösung „S" (Proto-
kolle), deren pH 3,8 war, während für Fluorwasserstoffsäure ein pk von etwa 3,5
angegeben wird. Zur Entfernung der Kulturlösung wurden die Zellen zunächst
mehrmals in der Salzlösung S gewaschen. Sie wurden dann in den Hauptraum
kegelförmiger Manometriegefäße (Abb. 1) gebracht.
Z. B. enthielt ein Kegel im Hauptraum 3,83 //Mole Chlorophyll, in 200 mm3
Zellen, in 3 cm3 Salzlösung „S" (pH 3,8, 20"), in der Birne 0,2 cm3 «/5-NaF
(pH 3,8), im Gasraum reines CO-'freies Argon. Wurde das Fluorid (im Dunkeln)
in den Hauptraum gegeben, so wurde in 20 Min. die funktionelle CO-2 ausgetrie-
ben, während ohne Fluorid-Zusatz nur wenig CO-2 im Gasraum erschien (Abb. 2).
Die Differenz der Druckänderungen mit und ohne Fluorid, multipliziert mit kco-z,
ergab die durch Fluorid ausgetriebene CO2. Im Versuch der Abbildung betrug
die so berechnete funktionelle CO2 85,8 mm3 == 3,83 //Mole CO2 (Protokoll 1).
Es war also das Verhältnis
Funktionelle CO? 3,83
Chlorophyll
3,83
1,0.
2. Variation des Chlorophyllgehalts
Für den Versuch der Abb. 2 waren die Zellen in 25 cm Abstand von einer 300-
Watt-Metallfadenlampe an einem
Südfenster gezüchtet worden, wo
sie sich in 2 Tagen in einer 250-cm3-
Flasche von 60 auf 800 mm3 ver-
mehrt hatten. Der Chlorophyllge-
halt in 200 mm3 Zellen betrug 3,83
//Mole, was etwa 7,7% des Zell-
trockengewichts entspricht.
Abb. 2. Anaerobe Austreibung der funk-
tionellen CO-: durch Fluorid aus 200 mm;!
Chlorella bei pH 3,8 und 20°. Dunkel. 3,83
//Mole Chlorophyll in 200 mm3 Chlorella
in Argon (&co2 = 1,732 mm2 bei 20°).
55
50
15
1
^ 35
t*
E
£20
15
10
5
i -
-
w
Vaf
1
-
-
ohne
NaF
1^
,_>
= 19,5 mm
= 85,8cmm
' = 3.83
Mikromole CO,
2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 22,5 25
Minuten (dunkel) *-
3,83 // Mole Chlorophyll in 200 mm3 Chlorella.
Um Zellen niedrigeren Chlorophyllgehalts zu gewinnen, züchteten wir bei
höherer Lichtintensität, indem wir die Kulturkolben nahe zwischen vier 200-Watt-
Metallfadenlampen brachten. Wurden in 250 cm3 Kulturlösung 15 mm3 Zellen
eingesät, so betrug nach 24 Stdn. die Ernte 178 mm3, die Zellen hatten sich also in
einem Tag auf das 12fache vermehrt. 160 mm3 dieser Zellen enthielten nur 0,433
//Mole Chlorophyll, entsprechend 1% des Zelltrockengewichts. Wurde für 160
mm3 dieser Zellen in der Anordnung der Abb. 1 die durch Fluorid austreibbare
350
Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
CO2 bestimmt, so wurden (Protokoll 2) 0,406 //Mole CO-2 erhalten. Es war also das
Verhältnis Funktionelle CO 0,406
= — = 0,94;
Chlorophyll 0,433
also wiederum nahezu gleich 1, bei nur x/s des Chlorophyllgehalts.
Methodisch ist zu dem Versuch zu bemerken, daß man die chlorophyllarmen
Zellen besonders sorgfältig in der sauren Salzlösung S waschen muß, um alles
Bicarbonat zu entfernen. Denn je weniger Chlorophyll die Zellen enthalten, um
so mehr fällt eine Verunreinigung mit Bicarbonat ins Gewicht.
3. Variation der Fluorid-Konzentration
In dem Versuch der Abb. 2 war die Außenkonzentration des Fluorids 1/80-normal.
Aber eine viel kleinere Fluorid-Konzentration, z. B. 1/3000-normal, kann die
Kohlensäure austreiben, eine Konzentration, bei der die Zellen weniger Fluorid als
Chlorophyll enthalten. Während also Kohlensäure- und Chlorophyllgehalt gleich
sind, besteht keine Äquivalenz zwischen Fluorid und Kohlensäure oder, was das-
selbe ist, zwischen Fluorid und Chlorophyll.
60
E
E
50
HO
30
20
10
IVo—^l
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^_____
— 0
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1
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1
1
i
I:
n
3200
II:
n
800
TT •
n
11 .
160
rv-
n
80
-NaF
-NaF
-NaF
-NaF
10 20 30 HO 50 SO 70 80 30 100 110 120
Minuten *-
Abb. 3. Anaerobe Austreibung der funktionellen CO2 aus 200 mm3
Chlorella durch verschiedene Fluorid-Konzentrationen bei pH 3,8 und
20°. Die CO-2-Entwicklung ohne Fluorid ist von den Kurven abge-
n n n „T n
liÖO "
zogen. Dunkel I :
II:
IV:
-Fluorid.
3200 ' 800 ' 160 J 80
Die Zellen enthielten 2,59 //Mole Chlorophyll, 2,58 Mole COo wur-
den ausgetrieben.
In Abb. 3 ist ein Versuch graphisch dargestellt, bei dem die Außenkonzentration
des Fluorids von 1/3200 bis 1 80-« variiert wurde. Die Chlorophyllmenge pro
Gefäß betrug etwa 2,59 Mole. 2,58 //Mole Kohlensäure waren durch 1/80-«.
Fluorid nach 15 Min. ausgetrieben, während 1/3200-« Fluorid die Kohlensäure
wesentlich langsamer austrieb.
4. Hemmung der Fluoridwirkung durch Blausäure
Für diese Versuche wurden kegelförmige Gefäße mit zwei im rechten Winkel zu-
einander angebrachten Birnen benutzt, so daß man zuerst die Blausäure und dann
das Fluorid zu den Zellen geben konnte.
Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella 351
Z. B. enthielt der Hauptraum eines derartigen Kegels 3,4 //Mole Chlorophyll in
200 mm3 Zellen in 3 cm3 Salzlösung „S" (pH 3,8, 20«), die Birne I 0,3 cm3
«/1000-KCN, die Birne II 0,2 cm3 «/5-NaF (pH 3,8), der Gasraum Argon. Wurde
zunächst das KCN in den Hauptraum gegeben, so entstand nur ein geringer Ein-
kippdruck. Wurde dann das Fluorid in den Hauptraum gegeben, so wurden nach
15 Minuten die folgenden Endwerte an CO2 erhalten:
ohne KCN
ohne KCN
+ KCN
ohne NaF
+ NaF
+ NaF
CO2
C02
CO2
(mm3)
(mm3)
(mm3)
5,2
85,2
5,8
— 5,2
-5,2
80,0
0,6
= 3,58 //Mole CO2
= 0,027 //Mole CO2
Bei Abwesenheit von Blausäure wurden also durch Fluorid aus 3,4 //Molen
Chlorophyll 3,6 //Mole CO> entwickelt, während bei Anwesenheit von 10 l-n
HCN keine CO2 entwickelt wurde. Sogar bei 10 5-n HCN fanden wir noch starke
Hemmung der Fluoridwirkung. Hiernach gehört die Fermentreaktion, die durch
das Fluorid in Gang gesetzt wird, zu den blausäure-empfindlichsten Lebensvor-
gängen und ist in dieser Hinsicht der Nitratreduktion3 vergleichbar.
Methodisch ist zu bemerken, daß man darauf achten muß, daß bei dem Sätti-
gen der Zellen mit Argon — wobei die Kegel 10 Minuten mit Argon durchströmt
werden — keine Blausäure ausgetrieben wird. Man gibt deshalb in Birne I nicht
HCN, sondern KCN, und man läßt deshalb das Gas durch diejenige der beiden
Birnen ausströmen, die das Fluorid enthält.
5. Nichthemmung der Fluoridwirkung durch Phenanthrolin und durch
Phenylurethan
a-a'-Phenanthrolin, ein Reagenz auf freie Schwermetallionen, hemmt in Konzen-
trationen von 1/100-normal die Lichtreaktionen4 in Chlorella, sowohl die Reduk-
tion der Kohlensäure als auch die Reduktion des Chinons. w/100-Phenanthrolin
hemmt nicht die Fluoridwirkung in Chlorella.
Z. B. enthielt ein Kegel im Hauptraum 3,98 //Mole Chlorophyll in 200 mm3
Zellen in 3 cm3 Salzlösung S (pH 3,8, 20°), in Birne I 0,2 cm3 «/10-Phenanthrolin
(pH 3,8), in Birne II 0,2 cm3 «/5-NaF (pH 3,8), im Gasraum Argon.
Wurde zunächst das Phenanthrolin in den Hauptraum gegeben, so entstand nur
ein geringer Einkippdruck. Wurde dann das Fluorid in den Hauptraum gegeben,
so wurden nach 15 Min. die folgenden End werte an CO2 erhalten:
Phenanthrolin
- Phenanthrolin
+
Phenanthrolin
- NaF
+ NaF
;-NaF
CO2
C02
C02
(mm3)
(mm3)
(mm3)
6,9
97,0
- 6,9
96,5
-6,9
= 90,1
= 89,6
4,03
//Mole
CO,
4,01 //Mole CO2
352 Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
Aus 4 //Molen Chlorophyll wurden also bei Abwesenheit wie bei Gegenwart von
Phenanthrolin 4 //Mole CO2 entwickelt, das heißt Phenanthrolin hemmte die
Fluoridwirkung nicht.
Keine Hemmung der Fluoridwirkung fanden wir ferner, wenn wir von dem
Narkotikum Phenylurethan (phenylcarbaminsaurem Äthyl) die hohe Konzentra-
tion von 6 • 10 3-n einwirken ließen, die die COj-Assimilation vollständig hemmt.
Z. B. enthielt der Hauptraum eines Kegels 3,83 //Mole Chlorophyll in 200 mm3
Zellen in 3 cm3 Salzlösung S (pH 3,8, 20°), die Birne I 0,2 cm3 0,1 prozent. Phenyl-
urethan, die Birne II 0,2 cm3 w/5-NaF (pH 3,8), der Gasraum Argon. Wurde zu-
nächst das Phenylurethan in den Hauptraum gegeben, so entstand nur ein ge-
ringer Einkippdruck. Wurde dann das NaF in den Hauptraum gegeben, so wurden
in 15 Minuten die folgenden Endwerte an CO2 erhalten:
- Phenylurethan
-NaF
C02
(mm3)
6,04
- Phenylurethan | Phenylurethan
+ NaF + NaF
CO2 CO2
(mm3) (mm3)
92,5 94,0
— 6,0 —6,0
= 86,5 = 88,0
-- 3,86 //Mol CO2 = 3,94 //Mol COo
Aus 3,83 //Molen Chlorophyll wurden also bei Abwesenheit wie bei Gegenwart
des Phenylurethans 3,9 //Mole CO2 entwickelt.
Im ganzen läßt sich aus den Hemmungen der Fluoridwirkung schließen, daß
das Ferment der COi-Entwicklung, das durch Fluorid in Aktion gebracht wird,
nicht an die Struktur gebunden ist, da es durch narkotische Struktur-Wirkungs-
stärken nicht gehemmt wird; daß es eine Schwermetallverbindung ist, da es spezi-
fisch durch Blausäure gehemmt wird; und daß es keine dissoziierende Schwer-
metallverbindung ist, da es durch Phenanthrolin nicht gehemmt wird.
6. Octanol, anaerob
Wie durch Fluorid, so kann man die funktionelle CO2 auch durch Octanol aus-
treiben. Da jedoch Octanol auf Zellen cytolysierend wirkt, kann die mit Octanol
ausgetriebene CO2 nach Entfernung des Octanols nicht mehr aufgenommen werden.
Z. B. enthielt ein Kegel im Hauptraum 3,4 //Mole Chlorophyll in 200 mm3
Zellen in 3 cm3 Kulturlösung K (pH 4,3), in der Birne 0,1 cm3 Octanol, im Gas-
raum Argon. Wir fanden bei 20° nach Zugabe des Octanols in den Hauptraum,
wenn wir den Einkippdruck des Octanols, der 9,5 mm betrug, abgezogen (v =
18,92 cm3, vF = 3,1 cm3):
Min.
(mm) CO2
5
+ 21
5
+ 14
20
+ 9
20
+ 2
10
0,5
60
46,5
81,5 mm3 CO2
3,63 //Mole CO2.
Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
353
Waren auf diese Weise aus 3,4 //Molen Chlorophyll 3,63 //Mole CO2 anaerob
ausgetrieben, so konnte durch Zusatz von Fluorid keine weitere CO_> ausgetrieben
werden. Die durch Octanol austreibbare CO2 ist also dieselbe wie die durch Fluorid
austreibbare CO2.
Der Versuch zeigt, daß das mit den üblichen chemischen Methoden isolierte
Chlorophyll die funktionelle CO> nicht enthalten kann.
7. Erwärmen, anaerob
Erwärmt man Chlorella in ihrer Kulturlösung (pH 4,3) 10 Minuten auf 46°, so
wird aus 1 Mol Chlorophyll 1 Mol CO2 ausgetrieben. Fluorid treibt nach dieser
Behandlung keine CO2 aus Chlorella aus, woraus hervorgeht, daß die durch Er-
wärmen und durch Fluorid austreibbare CO2 dieselbe CO2 ist.
Abb. 4.
Verschluß des offenen
Manometerschenkels
Erwärmt man aber die Chlorella schnell auf 65° und hält sie 5 Minuten auf 65°,
so wird keine CO2 ausgetrieben. Fluorid treibt nach dieser Behandlung keine CO2
aus Chlorella aus, wodurch bewiesen wird, daß die Entwicklung der CO2 aus Chlo-
rella — sei es durch Fluorid, sei es durch Erwärmen auf 46° — eine Ferment-
reaktion ist.
Für diese Versuche war es notwendig, das Erwärmen unter manometrischem
Verschluß vorzunehmen, da ja das Verhalten der Chlorella nicht nur nach dem
Erwärmen, sondern auch während des Erwärmens untersucht werden sollte. Wir
brachten zu dem Zweck an dem offenen Manometerschenkel eine drucksichere
Verschlußvorrichtung an (Abb. 4). War der Kegel mit seinem Manometer ver-
bunden, so wurde zunächst in der üblichen Weise bei 20° ausgeglichen und der
Manometerstand in der üblichen Weise bei 20° abgelesen. Dann wurde der offene
23 Warburg, Zellphysiologie
354 Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
Manometerschenkel verschlossen, der Kegel die gewünschte Zeit in heißes Wasser
getaucht und wieder in den 20°-Thermostaten zurückgebracht. Schließlich wurde
der Druckverschluß wieder entfernt und dann in der üblichen Weise der Mano-
meterstand abgelesen. Die Methode bedeutet eine erhebliche Erweiterung der
manometrischen Versuchsmöglichkeiten und wird vielfach benutzt werden. Man
achte darauf, daß der Kegel nicht zu tief in das heiße Wasser eingetaucht wird, da
sonst Wasser in die Kapillare destillieren könnte. Es kam niemals vor, daß die
3 Schliffe — der Schwanzhahn, der Tubusverschluß und der neue Verschluß —
den erhöhten Druck nicht standhielten.
Z. B. enthielt der Hauptraum von 2 Kegeln je 3,4//Mole Chlorophyll in 200 mm3
Zellen in 3,2 cm3 Kulturlösung „K" (pH 4,3), die Birne war leer, der Gasraum
enthielt Argon. Der Kegel II 5 Minuten auf 65°. Nach Zurückbringen der Mano-
meter auf 20° und nach 30 Minuten Ausgleich wurde gefunden (y = 18,68 cm3,
vf = 3,2 cm3, &co-2 = 1,73):
nach 10' 46° nach 5' 65"
C02 C02
(mm) (mm)
+ 46 + 3,5
= 79,6 mm3 CO2 = 6,1 mm3 C02
= 3,56 //Mole C02 = 0,27 //Mole C02
Bei 46° wurden also aus 3,4 //Molen Chlorophyll 3,56 //Mole CO_> ausgetrieben,
während bei 65° fast keine CO2 ausgetrieben wurde. Die hier gefundene geringe
Menge CO2 wurde wahrscheinlich vor der Erreichung der Abtötungs-Temperatur
entwickelt.
8. Fluorid, aerob
Alle bisher beschriebenen Versuche wurden unter anaeroben Bedingungen aus-
geführt. Was aber geschieht, wenn wir die CO2 unter aeroben Bedingungen aus-
treiben ?
Methodisch wird man hier zunächst das Bedenken haben, daß die Atmung die
Messungen stört. Es hat sich jedoch gezeigt, daß bei hohen Fluoridkonzentrationen
und hohen C02-Drucken die Atmung sehr stark gehemmt ist, so daß dann die
Atmung nicht stört. — Größere Komplikationen macht, daß aerob, bei Gegenwart
von CO2, die CO2 wieder gebunden wird, so daß aerob stationäre Zustände sich
herausbilden, bei denen ebensoviel CO2 entwickelt, als CO2 wiederaufgenommen
wird. Die Folge davon ist, daß man aerob mehr Fluorid braucht, um positive
Drucke zu erzielen, als anaerob. Während anaerob 1/3200-« Fluorid bereits
positive Drucke erzeugt, muß aerob die Fluoridkonzentration zur Erzeugung der
gleichen positiven Drucke etwa lOmal höher sein. Man wird also aerob, erstens um
die Atmung zu unterdrücken und zweitens wegen der Rückreaktion, möglichst
hohe Fluoridkonzentrationen anwenden.
Z. B. enthielt der Hauptraum von Kegeln 3,0 //Mole Chlorophyll in 200 mm3
Zellen in 3 cm3 Salzlösung „S" (pH 3,8, 20"), die Birne 0,2 cm3 w/5-Fluorid
(pH 3,8), der Gasraum verschiedene Gasmischungen. Wurde das Fluorid in den
Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
355
Hauptraum gegeben, so wurden die in Tab. 1 verzeichneten Druckänderungen
erhalten.
Der Versuch bestätigt zunächst, daß anaerob in CO-2-freiem Argon pro Mol
Chlorophyll 1 Mol COj gebunden ist. (Das Verhältnis ist hier etwas über 1, weil
die anaerobe CO^-Entwicklung ohne Fluoridzusatz nicht abgezogen ist; vgl. Proto-
koll 1.) Der Versuch zeigt ferner, daß anaerob mehr CO 2 gebunden wird, wenn ein
CO-2-Druck vorhanden ist, offenbar, weil dann CO2 als Bicarbonat, Carbamin-
säure usw. gebunden wird. Der Versuch zeigt drittens — und das ist das Haupt-
ergebnis — , daß bei sonst gleichen CO_>-Drucken aerob mehr CO2 gebunden wird
als anaerob. Der Unterschied ist erheblich. Er beträgt hier ein halbes Mol pro
Mol Chlorophyll und wäre bei höheren CO^-Drucken noch größer.
Tabelle 1
Gasgemisch
—
10 CO-
20 COo
10 CO2
20 CO2
(Vol.-%)
Argon
90 Ar
80 Ar
30 02
60 Ar
20 O2
60 Ar
&co2 (mm2)
1,59
1,611
1,571
1,747
1,732
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
5'
38,5
+
44
+ 46
+ 47,5
+ 63,5
5'
6,0
+
10
+ 7,5
+
8,5
+
6,5
5'
2,0
+
1,5
+ 1,5
+
4,0
+
3,0
5'
+ 0
0
0
0
0
20'
+ 46,5
-f
55,5
55,0
+
60,0
+
73,0
= 74 mm3
=
89,5 mm3
= 86,2 mm:i
=
105 mm3
=
127 mm3
= 3,3 //Mole
=
4,0 //Mole
3,85 //Mole
=
4,7 //Mole
=
5,65//Mole
COo
3,3
3
4,0
3
3,85
3
4,7
5,65
Chlorophyll
3
3
= 1,1
=
1,33
1,28
=
1,56
=
1,88
Es gibt also 3 Arten von gebundener CO2 in Chlorella : Die erste Art ist unab-
hängig vom COi-Druck, die zweite ist abhängig vom CO-2-Druck, die dritte ist
abhängig vom Druck der CO2 und von der Anwesenheit von Sauerstoff. Alle drei
Arten werden durch «/80-Fluoird ausgetrieben. 10^-n HCN hemmt die Aus-
treibung der ersten Art vollständig, der zweiten Art gar nicht, der dritten Art un-
vollständig.
Man muß annehmen, daß die erste und die dritte Art funktionelle Bedeutung
haben. Unter den Bedingungen, unter denen wir unsere Chlorella züchten, ent-
hält sie die ganze CO2 der ersten Art und einen Teil der dritten Art.
9. Reversibilität der Fluoridwirkung
Treibt man die CO2 aus Chlorella, aerob oder anaerob, durch Fluorid aus und
bringt dann die Zellen in reine Kulturlösung, so vermehren sie sich fast ebenso
schnell wie Kontrollen, die nicht mit Fluorid behandelt worden sind. Die Fluorid-
wirkung ist also reversibel. Um dies direkter zu zeigen, treibt man die CO2 mit
Fluorid aus, wäscht das Fluorid fort, regeneriert mit Kohlensäure bei Anwesenheit
von Sauerstoff und treibt die CO2 wieder mit Fluorid aus. Bei der Regeneration ist
die Anwesenheit von Sauerstoff notwendig.
356 Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
Z. B. enthielt der Hauptraum eines Kegels 3 //Mole Chlorophyll in 200 mm3
Zellen in 3 cm3 Salzlösung „S" (pH 3,8, 20°), die Birne 0,03 cm3 n/10-NaF (pH
3,8), der Gasraum Argon. Wurde dann das Fluorid in den Hauptraum gegeben, so
entstand eine Fluoridkonzentration von etwa 1/1000-«, und es wurden in 50
Minuten 67,4 mm3 CO2 = 3 //Mole CO2 entwickelt. Das Fluorid wurde dann mit
der Salzlösung „S" fortgewaschen, die Zellen wurden 30 Minuten in 10 Vol.-%
CO2; 30 Vol.-% O2; 60 Vol.-% Argon gehalten und dann wieder mit reinem
Argon gesättigt. Wurde dann aus der Birne 0,2 cm3 w/10-Fluorid (pH 3,8) in den
Hauptraum gegeben, so wurden in 20 Minuten die folgenden Endwerte an CO2
erhalten :
bei der ersten Austreibung mit Fluorid: 67,4 mm3 = 3,0 //Mole CO2,
bei der zweiten Austreibung mit Fluorid: 57,0 mm3 = 2,5 //Mole CO2.
Bei der ersten Austreibung mit Fluorid waren also aus 3 //Molen Chlorophyll
3 //Mole CO2 entwickelt worden, also die normale anaerobe Menge. Bei der zwei-
ten Austreibung mit Fluorid wurden 2,5 //Mole CO2 entwickelt, also 85% des
Anfangswerts, die in der Zeit der Regeneration wiederaufgenommen worden waren.
Wäscht man bei derartigen Versuchen nach der ersten Austreibung das Fluorid
nicht fort, sondern sättigt sofort mit 10 Vol.-",, CO2; 30 Vol.-% O2 und dann nach
30 Minuten wieder mit Argon, so zeigt, sich daß die gebundene CO2, trotz der An-
wesenheit des Fluorids, wieder zugenommen hat, falls die Fluoridkonzentration
nicht zu hoch war. So kann man den stationären Zustand zwischen Austreibung
und Bindung der CO2, von dem im vorigen Abschnitt die Rede war, nachweisen
und messen. Eine geeignete Fluoridkonzentration für diesen wichtigen Versuch
ist 1/1000-normal.
10. Lichtwirkung nach Austreibung der CO2 durch Fluorid
Setzt man aerob verschiedene Mengen Fluorid zu einer Chlorella-Suspension,
mißt die positiven Drucke der entwickelten CO2 und belichtet dann wie bei den
Messungen der Oi-Kapazität, so findet man, daß die Lichtwirkung um so kleiner
ist, je mehr CO2 durch das Fluorid ausgetrieben worden ist. Der Symmetrie und
der Einfachheit wegen sind auch diese Versuche mit Kegeln ausgeführt worden,
wobei y-Bestimmungen nicht möglich waren (mit der Hydrosulfitmethode be-
stimmt, ergaben sich die ) '-Werte zu — 0,9 bis — 0,5).
Z. B. enthielt der Hauptraum von Kegeln 200 mm3 Zellen in 3 cm3 Salzlösung
„S" (pH 3,8, 20°), die Birne variierte Mengen Fluorid (pH 3,8), der Gasraum
10Vol.-% CO>; 30Vol.-% O.; 60Vol.-% Argon. Wir fanden (Tab. 2):
Tabelle 2
;//10-NaF in der Birne
5' dunkel
5' dunkel
5' dunkel
J -- mm* 'Quanten pro' ] ^ = y = ^ = 41 ^ =
eingestrahlt |
5' hell
5' hell
0 cm3
0,03 cm3
0,10 cm3
0,20 cnr
(mm)
-5,0
3,5
3,0
(mm)
0
2,5
3,0
(mm)
23,0
1,0
3,5
(mm)
+ 45,0
+ 9,5
1,5
Jrot -- 41
Jrot == 41
Jrot == 41
Jrot == 4
13 » i- 12 5
0,5 f 12'5
+
10 1 9 5
0,5 f 9'5
i?;S} + 3,o
1,0 |
0 r
1,0
Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella 357
Aus dem Versuch geht hervor, daß eine niedrige Fluoridkonzentration, die nur
wenig CO2 austreibt, die Lichtwirkung nur wenig hemmt und daß eine Fluorid-
konzentration, die den größten Teil der CO2 austreibt, die Lichtwirkung fast voll-
ständig hemmt; daß also nur die gebundene, durch Fluorid austreibbare CO2 von
dem Licht unter Oi-Entwicklung reduziert wird, während die physikalisch ge-
löste CO2, von der bei diesem Versuch die Zellsuspension in jedem Kegel 280mm3
enthielt, für das Licht nicht angreifbar ist.
Zur Vervollständigung des Versuchs haben wir noch geprüft, ob die Chinon-
Lichtreaktion in Chlorella nach der Austreibung der CO2 durch Fluorid noch vor
sich geht und ob diese Reaktion durch Fluorid gehemmt wird. Zum Beispiel ent-
hielt der Hauptraum eines Kegels 3,3 //Mole Chlorophyll in 200 mm3 Zellen in
3 cm3 Kulturlösung „K" (pH 3,8, 20«), die Birne I 0,08 cm3 «/10-NaF (pH 3,8),
die Birne II 2 mg Chinon in 0,2 cm3 H2O, der Gasraum Argon. Wurde zunächst
das Fluorid in den Hauptraum gegeben, so wurden in 20 Minuten 66 mm3 CO2 =
2,94 //Mole CO2 entwickelt. Wurde dann das Chinon in den Hauptraum gegeben
und mit weißem überschüssigem Licht belichtet, so fanden wir :
ohne NaF
+ 0,08 cm3 NaF in 3 cm3
ko2 = 1,453
ko2 = 1,555
fcco2 = 1,725
&CO2 = 1,826
(mm)
(mm)
5'
dunkel - 2,0
+ 18,5
5'
dunkel + 2,0
+ 11,5
5'
dunkel + 1,5
+ 4,0
5
20
dunkel + 1,0
' dunkel — 6,5
+ 2,0
+ 36
= 11,2 mm3
CO>
66 mm3 = 2,94 //Mole CO
1
1
+ 2 mg Chinon
+ 2 mg Chinon
(mm)
(mm)
5' hell
+ 39,5
+ 41,5
5' hell
+ 36
+ 33,0
10' hell
+ 75,5
+ 74,5
= 110,5
mm3 Oo
= 115 mm3 O2
Der Versuch zeigt, daß durch Austreibung der CO2 mit Fluorid die Chinon-
Lichtreaktion in Chlorella nicht beeinträchtigt wird; und ferner, daß Fluorid in der
hier angewandten Konzentration von 1/420-normal die Wirkung des Lichts auf die
Chinon-Reaktion nicht hemmt.
11. Wirkung des Fluorids nach Belichtung
Treibt man die (^-Kapazität der Chlorella im Licht aus, verdunkelt dann und
fügt Fluorid hinzu, so könnte man zunächst erwarten, daß nach der Belichtung um
soviel weniger CO2 durch Fluorid entwickelt wird, als O2 ausgetrieben worden ist:
ChlCOo - h ■ v = Chi + C -f O2.
Doch muß man bedenken, daß bereits während der Belichtung CO2 wieder ge-
bunden wird. Wäre y während der Belichtung gleich --1, so würde die chemisch
gebundene CO2 bei der Belichtung gar nicht abnehmen. Da für die von uns ver-
358 Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
wendeten Zellen im Licht y etwa = --0,7 ist, so nahm durch die Belichtung die
chemisch gebundene CO> ab. Der Einfachheit halber begnügen wir uns hier damit,
qualitativ durch Versuche mit Kegeln zu zeigen, daß Fluorid nach der Belichtung
weniger CO2 austreibt und daß dieses Defizit bei der Erholung im Dunkeln, wenn
Sauerstoff und Kohlensäure zugegen sind, wieder verschwindet.
Z. B. enthielten Kegel im Hauptraum 1 //Mol Chlorophyll in 100 mm3 Zellen
in 3 cm3 Salzlösung „S" (pH 3,8, 20°), die Birne 0,2 cm3 ra/5-NaF (pH 3,8), der
Gasraum 10 Vol.-% C02; 30 Vol.-% 02; 60 Vol.-% Argon. Die Zellen stammten
aus ltägigen Kulturen, die mit fluktuierendem Licht gezüchtet worden waren und
sich in 250 cm3 Kulturlösung von 30 auf 125 mm3 vermehrt hatten. Belichtet
wurde mit grünem Licht der Intensität J = 60 mm3 Quanten pro Minute, wobei
ein positiver Druck von 6,5 mm auftrat. Wurde dann sofort oder nach einer ge-
wissen Dunkelzeit Fluorid in den Hauptraum gegeben, so fanden wir die folgenden
Endwerte an C02 (v = -- 18,92 cm3, v == 3,2 cm3 kÖ2 = 1,48, &co, == 1,752, KÖ2 =
3,65 für y = -0,7):
(mm)
Nach 30' dunkel + 44,2
Nach 30' dunkel 5' hell + 36,8
Nach 30' dunkel 5' hell 30' dunkel + 44,0
Somit ist nunmehr mit zwei unabhängigen Methoden gezeigt worden, daß es
die durch Fluorid austreibbare C02 ist, aus der im Licht 02 entwickelt wird. Treibt
man die C02 vorher mit Fluorid aus und belichtet dann, so wird im Licht kein
Sauerstoff entwickelt; und belichtet man vorher und gibt dann Fluorid zu den
Zellen, so wird nachher weniger C02 ausgetrieben als aus den nicht belichteten
Zellen.
12. Optische Veränderungen nach Zusatz von Fluorid
Wenn Fluorid, wie es wahrscheinlich ist, in zwei Phasen wirkt, indem es zuerst
die Vorstufe der CO-2, die eine Carbonsäure sein mag, von dem Chlorophyll ab-
trennt und indem dann aus dieser abgetrennten Säure das Schwermetall-Ferment
die CO-2 abspaltet, so könnte es sein, daß sich in der ersten Phase das Chlorophyll-
spektrum ändert. Von einer solchen möglichen Änderung ist von vorneherein zu
sagen, daß sie nur für „lebendes", nicht für extrahiertes Chlorophyll gefunden
werden könnte, da bei der Extraktion die CO-2 entwickelt wird und damit die Unter-
schiede verschwinden müßten.
Technisch ist es heute leicht, mit Hilfe unserer Ulbrichtschen Kugel5 die Chloro-
phyllbanden im Leben zu messen. Sie sind im Vergleich zu den Banden des extra-
hierten Chlorophylls verbreitert und unscharf. Änderungen bei Zusatz von Fluorid
haben wir bisher nicht gefunden. Dagegen haben wir gefunden, daß die rote durch
366 m.u erregte Fluoreszenz des lebenden Chlorophylls bei Zusatz von Fluorid
erheblich schwächer wird, und zwar gerade bei Zusatz solcher Fluoridmengen, die
C02 austreiben und gerade in denjenigen Zeiten, in denen die C02 ausgetrieben
wird. Diese Schwächung der Fluoreszenz ist vollständig reversibel.
Gegen die Bedeutung der Erscheinung spricht zunächst, daß 10 3-« Blausäure
die Schwächung der Fluoreszenz nicht verhindert, während 10~3-« Blausäure die
Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
359
Austreibung der CO2 vollständig hemmt. Bei näherer Überlegung jedoch liegt
hier kein Widerspruch vor, da auf das Chlorophyllspektrum nur die erste Phase
wirken kann. Blausäure aber mit Bestimmtheit nur auf die zweite Phase wirkt.
Es ist also durchaus möglich, aber nicht bewiesen, daß die Schwächung der
Fluoreszenz des lebenden Chlorophylls durch Fluorid mit der ersten Phase der
Fluoridwirkung zusammenhängt.
Protokolle
Kulturlösung „K": 10 g MgS04 ■ 7 H2O, 5 g KH2PO4, 4 g NaCl, 4 g KNO3, 1 g Ca(N03>2 •
4 H20 + 2 1 Wasser. pH ist 4,3.
Salzlösung „S": 10g MgS04 ■ 7 H20, 5 g KH2P04, 4 g NaCl, 0,4 g NH4C1 2 1 Wasser -
etwa 0,6 cm:! n. H2SO4. pH soll 3,8 sein.
«/5-NaF: 0,84 g NaF 3,3 cm:! 11. H2SO4 mit Wasser auf 100 cm:!. pH ist 3,8.
Die Zellen für die Arbeit wurden in der früher üblichen Weise gezüchtet. Gegenüber Fluorid
verhalten sich die auf verschiedene Weise gezüchteten Zellen ziemlich gleich — die großen Unter-
schiede zeigen sich erst bei der Entwicklung des Sauerstoffs.
Protokoll 1. Hoher Chlorophyllgehalt
Die Zellen wurden mit kontinuierlicher Intensität in der früher üblichen Weise an einem Süd-
fenster gezüchtet und vermehrten sich in 2 Tagen von 60 auf ca. 800 mm3 Zellen in 250 cm3
Kulturlösung. Der Chlorophyllgehalt in 200 mm:! Zellen betrug 3,83 //Mole, das ist bei 22,5%
Trockengewicht 7,7",', Chlorophyll.
Kegel ohne Einsätze mit 1 Birne. 20°. Dunkel.
Kegel I
Kegel II
v = 18,68 cm3
V
= 18,73 cm3
vf = 3,2 cm3
VE
= 3,2 cm3
fcC02 = 1,725 mm2
kcot
= 1,732 mm-
Hauptraum:
200 mm3 Zellen
200
mm3 Zellen
in 3,0 cm3 S, pH = 3,8
in 3,0
cm3 S, pH = 3,8
Birne:
0,2 cm3 H20
0,2 cm3 i
•j/5-NaF, pH 3,8
Gasraum:
Argon
Argon
Nach Einkippen
Nach Einkippen
(mm)
(mm)
In 2,5'
+ 0,5
+ 32
2,5'
0
+ 11,5
5'
+ 1,0
7,0
5'
+ 0,5
+ 1,0
10'
+ 1,0
+ 1,5
20'
+ 0,5
+ 3,5
0
45'
+ 53,0
= 6,0 mm3
= 91,7 mm3
6,0
85,7 mm3
= 3,83 /(Mole CO
CO2
3'83 1 0
Chlorophyll
J..U«
3,83
360
Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella
Protokoll 2. Niedriger Chlorophyllgehalt
Kegel I
Kegel II
v == 18,68 cm3
V
18,27 cm3
^f = 3,2 cm3
VF
= 3,2 cm3
&co2 == 1,725 mm2
&co2
= 1,687 mm-
Hauptraum:
160 mm3 Zellen
160
mm3 Zellen
in 3,0 cm3 S
ir
i 3,0 cm3 S
pH 3,8
pH 3,8
Birne :
0,2 cm3 H20
0,2
cm3 NaF
5
Gasraum :
Argon
Argon
Nach Einkippen
Nach Einkippen
(mm)
(mm)
In 6'
+ 2,5
+ 6,5
4'
+ 1,0
+ 2,5
5'
+ 0,5
+ 1,0
5'
+ 1,0
- 5,0
0,5
20'
+ 10,5
= 8,62 mm3
= 17,7 mm3
8,62
= 9,08 mm3
= 0,406 //M CO-,
CO;
►
- °'406 = 0,94.
0,433
Chlorophyll
Die Zellen wurden mit kontinuierlicher Intensität zwischen vier 200-Watt-Metallfadenlampen,
die nahe an den Kulturkolben herangebracht wurden, gezüchtet. Einsaat 15 mm3 Zellen in 250 cm3
Kulturlösung K, Ernte nach 24 Stdn. 178 mm3. pH war anfangs 4,3 und bei der Ernte 5,2. Die
Zellen wurden sorgfältig 3mal in Salzlösung S (pH 3,8) gewaschen, um alles Bicarbonat zu ent-
fernen. Man beachte, daß bei diesen chlorophyllarmen Zellen die Kontrolle ohne Fluorid sehr viel
mehr ausmachte als bei den Zellen des Protokolls 1. Chlorophyllgehalt im Gefäß in 160 mm3
Zellen 0,433 //Mole. Kegel ohne Einsätze mit 1 Birne. 20°. Dunkel.
Literatur
1 Warburg, O., und Krippahl, Günter, Z. Natur-
forschg. IIb (1956), 52 und 179; Warburg, O., Krip-
pahl, Günter und Schröder, Walter, Naturwissen-
schaften 43 (1956), 237.
2 Warburg, O., und Negelein, E., Biochem. Z. 214
(1929), 64; 255 (1932), 247; Warburg, O., Schwer-
metalle, Berlin 1946; Heavy Metals, Clarendon Press
Oxford 1949.
3 Warburg, O., und Negelein, E., Biochem. Z. 110
(1920), 66.
4 Warburg, O., Heavy Metals, Clarendon Press, Oxford
1949; Warburg, O., und Schröder, W., Z. Natur-
forschg. 10b (1955), 639.
5 Warburg, O., und Krippahl, Günter, Z. Natur-
forschg. 9b (1954). 181.
38 Züchtung der Chlorella mit fluktuierender Lichtintensität*
Von O. Warburg, W. Schröder und H.-W. Gattung
Untersuchung der Bedingungen, unter denen Zellen entstehen, die das Licht gut oder schlecht
ausnutzen. Das Ergebnis ist, daß gut ausnutzende Zellen nur dann entstehen, wenn die Licht-
intensität, bei der gezüchtet wird, nicht konstant, sondern wie in der freien Natur fluktuierend ist.
Ist die Lichtintensität konstant, so entstehen die Franck-Emersonschen Zellen, die 10 bis 12
Quanten benötigen, um 1 Mol. Sauerstoff zu entwickeln. Ist die Lichtintensität fluktuierend, so
entstehen Zellen, die 4 und noch weniger Quanten benötigen, um 1 Mol. Sauerstoff zu entwickeln.
Seit Jahren haben wir darauf hingewiesen1, daß heute, wo die physikalischen
Methoden zur Messung des Quantenbedarfs bis zur Vollkommenheit entwickelt
sind, die reproduzierbare Züchtung von Zellen bestimmter Eigenschaften das
Hauptproblem der Energetik der Photosynthese ist.
Wir haben nunmehr eine bisher übersehene Variable der Kulturbedingungen
gefunden. Schon lange wußten wir, daß die Zellen, die das Licht gut ausnutzen,
in Kulturen an Südfenstern, im Sommer bei schönem Wetter, entstehen. Die Ur-
sache war jedoch nicht, wie man zunächst denken sollte, die spektrale Zusammen-
setzung des Tageslichts, sondern es war die fluktuierende Intensität des Tageslichts,
die um so mehr gegen die konstante Intensität der Metallfadenlampe in Betracht
kam, je schöner das Wetter war.
Fluktuierende Lichtintensität
Um das fluktuierende Tageslicht auszuschalten, wurde in Räumen gezüchtet, die
gegen Tageslicht abgedunkelt waren. Als Lichtquelle dienten Metallfadenlampen,
die bei 220 V, 300 W verbrauchten, deren Betriebsspannung aber durch einen
automatisch sich ändernden Widerstand im Lauf von 24 Stunden von 50 auf 220 V
anstieg und wieder auf 50 V absank. Dabei änderte sich nicht nur die Intensität,
sondern auch, wie in der freien Natur, die spektrale Zusammensetzung des Lichtes.
Die den verschiedenen Betriebsspannungen entsprechenden Quantenintensitäten
| 80
%_60
-
220 V. 3L
IOW
£
CO
**>
e
' 50V
V , \
50 V
\ \
* t
1 2 H 6 8 10 1
? 1H 16 18 2
Tageszei
0 22 2
Whr
Abb. 1. Erster Modus der Fluktuation des Lichts.
* Aus Zeitschrift für Naturforschung IIb (1956): 654.
Zusatz 1961. Nach den Ergebnissen dieser Arbeit hat es kaum mehr Sinn, Quan-
tenausbeuten in beliebig gezüchteter Chlorella zu bestimmen. Die beste Bolome-
trie und Manometrie genügen nicht, wenn der Züchtung der Zellen keine Beach-
tung geschenkt wird.
362
Züchtung der Chlorella mit fluktuierender Lichtintensität
wurden mit dem Chlorophyll-Quantenaktinometer2 gemessen, das nur Licht mißt,
das von dem Chlorophyll absorbiert wird und deshalb hier ein unersetzliches
Hilfsmittel war, um ein Bild von den zeitlichen Änderungen der Quanteninten-
sitäten zu erhalten.
Oj
wo
^ 80
%_ so
c
-f: HO
? 20
50 V
L
220 V, 300 W
50 V
12 7V
16 18 20 22 2HUhr
Tageszeit »»
Abb. 2. Zweiter Modus der Fluktuation des Lichts.
Natürlich kann man die Lichtintensität in der verschiedensten Weise fluktuieren
lassen. Wir haben vorwiegend 2 Arten von Fluktuation angewendet, die in den
Abb. 1 und 2 graphisch dargestellt sind.
Züchtung der Zellen. Vgl. das Protokoll.
Messung des Quantenbedarfs
Der Quantenbedarf der (^-Entwicklung wurde in der normalen Kulturlösung ge-
messen, bei geringer Zelldichte, bei so starker Belichtung, daß die Atmung etwa
lOfach überkompensiert war; so daß es bei der Berechnung der Ausbeute wenig
ausmachte, ob man die Atmung berücksichtigte oder nicht.
Das Meßlicht war der Spektralbezirk um 646 m//, das katalytische Licht der
Spektralbezirk um 457 m/i. Im Ganzen war die Anordnung wie in der Arbeit über
das Wirkungsspektrum des blaugrünen Lichts3. Ein Versuch ist in dem folgenden
Protokoll genau beschrieben und in Abb. 3 graphisch dargestellt.
180
160
V40
^120
E
£100
80
60
W
20
-
■
Ä
-
f
-
ft
/t
~/t
6 l
I
i
•
3 V 5
t in Stunden -
Abb. 3. Durch rotes Licht (646 m//), ohne
Zusatz und mit Zusatz von blaugrünem
Licht (457 m//) entwickelter Sauerstoff.
- ohne Zusatz von Blaugrün,
mit Zusatz von Blaugrün. Die Zellen waren
mit fluktuierender Lichtintensität gezüchtet
worden. Der Quantenbedarf betrug in der
ersten Stunde Blaugrün 4,33 (einschl. At-
mung 3,84), in der ersten Stunde - - Blau-
grün 6,6, in der ganzen Zeit • Blaugrün 4,5
(einschl. Atmung 4,35), in der ganzen Zeit
- Blaugrün 14. Einzelheiten in Protokoll 1.
Läßt man das blaugrüne Licht längere Zeit einwirken, so nimmt die Wirkung
oft wieder ab, wahrscheinlich, weil das Luminoferment durch Überbelichtung
inaktiviert wird. Wir haben deshalb das Blaugrün in Perioden von 30 Min. fort-
genommen und wieder zugesetzt.
Züchtung der Chlorella mit fluktuierender Lichtintensität 363
Ergebnisse
Züchtet man an einem Südfenster in einem Gemisch von Tageslicht und konstan-
tem Metallfadenlicht, so erhält man je nach dem Wetter Zellen, die das Licht gut
oder schlecht ausnutzen. Auf diese Weise sind unsere Versuchszellen in den letzten
Jahren gezüchtet worden.
Züchtet man bei Ausschluß von Tageslicht mit konstantem Metallfadenlicht, so
erhält man Zellen, die eine schlechte Ausbeute geben. Um 1 Mol. Sauerstoff zu
entwickeln, benötigen diese Zellen 10 bis 12 und noch mehr Quanten.
Züchtet man bei Ausschluß von Tageslicht mit fluktuierendem Metallfadenlicht,
so erhält man Zellen, die im Mittel 4 bis 4,5 Quanten benötigen, um 1 Mol. Sauer-
stoff zu entwickeln, und zwar bei lOfacher Kompensation der Atmung (Tab. 1
und 2).
In den Tab. 1 und 2 ist das Ergebnis von 34 Versuchen verzeichnet, von denen
30 Versuche sich über 6 Stunden ausdehnten. Alle Versuche sind wie der Versuch
des folgenden Protokolls ausgeführt worden, und kein so ausgeführter ist in den
Tabellen ausgelassen worden. Da unter ihnen Versuche sind, die bei Berücksichti-
gung der Atmung sich dem Quantenbedarf 3 nähern, so sind wir der Meinung, daß
man noch Fluktuierungs-Bedingungen finden wird, unter denen man 3 als Mittel-
werte erhalten wird.
Was die Genauigkeit anbetrifft, so entnimmt man dem Protokoll, daß die Druck-
änderungen bei Zusatz von Blaugrün in der ersten Stunde — 11 für das kleine Ge-
fäß und — 4 mm für das große Gefäß betrugen; und daß die entsprechenden Druck-
änderungen in der Gesamtheit für das kleine Gefäß -\- 30,5 und für das große Ge-
fäß — 10,5 mm betrugen. Multipliziert man diese Werte mit 30, der Zahl der Ver-
suche, so erhält man die Druckänderungen, aus denen die Mittelwerte der Tabellen
berechnet worden sind, das sind so große Druckänderungen, daß die Ablesefehler
dagegen völlig verschwinden.
Wenn es auch nicht in den Zusammenhang dieser Arbeit gehört, sei hier doch
darauf hingewiesen, daß wir wiederum bei allen Versuchen, bei denen Blaugrün
zugesetzt wurde, 7- Werte erhielten, die sich 1,3 näherten, das ist der Wert, den man
bei Bildung von Glykolsäure aus Kohlensäure und Wasser finden muß.
Schließlich sei noch die Frage aufgeworfen, warum die sehr zahlreichen Bo-
taniker, die seit 37 Jahren nach unsern Vorschriften Chlorella für Photosynthese-
Versuche züchten, nicht darauf gekommen sind, daß die ununterbrochene kon-
stante hohe Belichtung unphysiologisch ist. Es ist darauf zu antworten, daß unter
den alten Zuchtbedingungen, unter denen für die ersten Tage das Licht im Über-
schuß ist, eine gute oder schlechte Ausbeute durch den Betrag der Ernten nicht
erkannt wird; und außerdem, daß es sehr wenig Institute gibt, in denen der Quan-
tenbedarf hätte bestimmt werden können.
Protokoll
Zellen: Raum gegen Tageslicht verdunkelt. 300-W-Metallfadenlampe, Intensität fluktuierend nach
Abb. 2. Abstand der Zuchtkolben von der Lampe 25 cm. In Kultursalzlösung - Mikroele-
menten4, unter Durchleitung von 5 Vol.-Proz. CO2, 30 Vol.-Proz. O2, 65 Vol.-Proz. Argon. pH
364
Züchtung der Chlorella mit fluktuierender Lichtintensität
Für die 1. Stde.
Für die Gesamtzeit (6 Stdn.)
Für die 1. Stde.
+ Blaugrün
Pos. Oo-Entwickl.
Atmung
Datum
— (+ Blaugrün)
— ( — Blaugrün)
— (+ Blaugrün)
— ( — Blaugrün)
27. 3.
5.67
16.8
5.22
[oo]
8.9
12. 4.
5.76
17.5
5.68
21
7.0
13. 4.
4.76
12.2
4.80
20
7.5
16. 4.
4.02
10.9
4.65
19
9.6
17. 4.
3.61
1 9.9
4.05
12
11
18. 4.
5.25
14.3
5.70
16
8.7
20. 4.
4.23
7.2
4.86
11
9.7
23. 4.
5.19
19.8
5.27
26
8.4
24. 4.
4.80
19.3
4.85
19
9.2
25. 4.
4.09
13.2
4.85
19
11
26. 4.
4.14
10.7
4.53
20
12
30. 4.
4.55
11.9
5.30
21
9.0
2. 5.
4.27
11.9
5.18
17
14
4. 5.
4.17
14.8
5.67
24
11
8. 5.
4.84
12.0
5.80
18
11
9. 5.
4.03
18.4
4.70
16
13
11. 5.
5.42
15.0
5.62
25
11
15. 5.
5.29
11.7
5.44
21
11
Mittel
4.67
13.8
5.12
18.0
10.2
+ Atmung
4.23
12.6
4.65
16.5
Tab. 1. -
1 mm3 Quanten absorbiert
mm3 Oo, positiv entwickelt '
Fluktuierend gezüchtet nach Abb. 1 oder 2.
Für die 1. Stde.
Für die Gesamtzeit (6 Stdn.)
Für die 1. Stde.
+ Blaugrün
Pos. O-2-Entwickl.
Atmung
Datum
— (+ Blaugrün)
— ( — Blaugrün)
— (+ Blaugrün)
— ( — Blaugrün)
7. 5.
4.52
22.7
5.87
35
9.1
8. 5.
4.52
17.8
5.07
39
9.0
14. 5.
4.25
10.4
4.57
19
8.4
16. 5.
5.27
37.3
5.62
30
7.3
17. 5.
4.32
7.7
4.48
14
10.3
22. 5.
5.12
19.5
5.40
40
7.0
24. 5.
3.80
7.4
11.0
24. 5.
3.64
27.6
11.0
28. 5.
4.30
26.3
9.8
31. 5.
4.62
22.1
5.04
30
8.9
31. 5.
5.06
36
5.50
41
8.1
1. 6.
5.13
36
5.14
45
8.9
7. 6.
4.95
21.0
4.55
8.3
7. 6.
4.60
17.0
4.62
29
8.9
18. 6.
4.41
15.4
4.37
20
11.0
19. 6.
4.95
11.0
5.01
12
11.6
Mittel
4.60
21
5.01
29.5
9.3
+ Atmung
4.15
19
4.5
27
Tab. 2.
1 mm3 Quanten absorbiert
~ 32; y — 0.81; J_ = 14.
g>
Literatur
1 Warburg, O., Biochim. biophysica Acta (Amsterdam) 3 Warburg, O., Krippahl, G., und Schröder, W., Z.
12 (1953), 356. Naturforschg. 10b (1955), 631.
2 Warburg, O., und Schocken, V., Arch. Biochemistry 4 Vorschriften diese Z. 10b (1955), 631. Die Lösung des
21 (1948), 363. NaVQ3 muß im Dunkeln aufbewahrt werden.
39 Ausbau der manometrischen Methoden*
Von Otto Warburg und Günter Krippahl
Adolf Windaus zu seinem 80. Geburtstag gezvidmet
Wir beschreiben im folgenden zwei neue manometrische Methoden, die wir für zellphysiologische
Untersuchungen ausgearbeitet haben, die aber auch für allgemein-chemische Arbeiten von Nutzen
sein werden.
I. Bestimmung des Sauerstoffs mit Dithionit
in Gegenwart von Kohlensäure
Das kegelförmige Gefäß, das in Abbildung 1 abgebildet ist, und das man sich mit
seinem Manometer verbunden im Thermostaten bei 20° denke, enthält im Haupt-
raum m/50 Phosphatlösung, die auf pH 3,8 angesäuert ist, in der Birne 20 mg
trockenes bicarbonatfreies** Natriumdithionit (Na-iS-jOa) und 20 mg trockenes
CaCl-2, im Gasraum 10 Vol.-",, CO-2 und 1 bis 3 Vol.-% Sauerstoff. Solange sich
10% co2
1-3% 02
in Argon
Suspension von
Chlorella
Abbildung 1. Gefäß zur manometrischen
Bestimmung des Sauerstoffs bei Gegenwart
von Kohlensäure
das Na^S-iOa in der Birne befindet, wird kein Sauerstoff absorbiert. Spült man aber
den Inhalt der Birne in den Hauptraum, so wird das Na-iS-zC^ gelöst, und der
Sauerstoff wird schnell und vollständig absorbiert.
Die Methode beruht auf zwei Voraussetzungen, die nicht selbstverständlich sind :
* Aus Justus Liebigs Annalen der Chemie 604 (1957): 94.
** NaoS^Oj, das frei von Bicarbonat ist, erhielten wir von der Badischen Anilin- & Soda-Fabrik,
Ludwigshafen, wofür wir auch hier danken.
Zusatz 1961. Dithionit als saures Absorptionsmittel für O2 hat den Nachteil, daß
sich bei Zugabe von Wasser schweflige Säure entwickelt. Wir haben deshalb das
Dithionit ersetzt durch trockenes Chromchlorür, wie in Beitrag 77 beschrieben.
Ausbau der manometrischen Methoden 367
erstens, daß das Dithionit, wenn es in der Birne durch CaCl-2 geschützt ist, trotz
erheblicher Wasserdampftension bei 20° keinen Sauerstoff verbraucht; zweitens,
daß das Dithionit trotz der sauren Reaktion von pH 3,8 den Sauerstoff schnell und
vollständig absorbiert. Ein Absorptionsmittel, das Sauerstoff nur bei alkalischer
Reaktion absorbieren würde, oder das schon vor der Benetzung Sauerstoff absor-
bieren würde, wäre für unsere Zwecke nicht brauchbar gewesen.
Prüfung der Methode
Zur Prüfung der Methode wurde in dem mit seinem Manometer verbundenen
Gefäß, dessen Gasraum 10 Vol.-",, CO-2-Argon, aber keinen Sauerstoff enthielt,
ein Sauerstoffdruck entwickelt und dann geprüft, ob dieser Sauerstoffdruck beim
Einkippen des Dithionits schnell und vollständig wieder verschwand.
Zur Ausführung verwendeten wir kegelförmige Manometrie-Gefäße mit zwei
Birnen. Der Hauptraum enthielt eine Lösung von H2O2, die Birne I Katalase, die
Birne II Dithionit + Calciumchlorid. Zunächst wurde die Katalase in den Haupt -
räum gegeben und dadurch SauerstofTin den Gasraum entwickelt. Dann wurde das
Dithionit in den Hauptraum gegeben und dadurch der entwickelte Sauerstoff
wieder absorbiert. Der „Einkippdruck" der Salze Na>S204 + CaCli wurde in
jedem Fall mitbestimmt und zu dem negativen Druck addiert. Wir fanden in mm
Brodie :
nach Zugabe der Katalase: -185 -187 -97,5 -185 +186,
nach Zugabe des Na2S204: ~ 184,5 - 188 99 - 184,5 185,5,
also eine sehr befriedigende Übereinstimmung zwischen entwickeltem und absor-
biertem Sauerstoff.
Experimentelle Einzelheiten. Volumen des Gefäßes 20,91 ccm. Bei 20° Gefäßkonstante für Sauerstoff
ko2 = 1,66 qmm. Hauptraum 3 ccm ;;//50 Phosphat pH 3,8 -- etwa 14 bis 28 Mikromole H2O2.
Birne I 50 y Katalase Boehringer. Birne II : 20 mg NaoS204 + 20 mg CaCl-2. Gasraum 10 Vol.-%
COo-Argon. Temperatur 20°. Nach Einkippen der Katalase zum Beispiel in 2' j 169 mm, in 3'
18 mm, in 5' 0 mm; Summe : 187 mm. — Nach Einkippen des Dithionits: in 2' - - 146 mm, in
3' — 13 mm, in 5'- - 2 mm, in 5' 0 mm; zusammen — 161 mm. Einkippdruck + 27 mm. Summe
— 188 mm.
Anwendung der Methode
Die Methode hat den Nachteil aller Differenzmethoden, daß sie um so ungenauer wird, je höher der
Druck des zu bestimmenden Gases ist; und daß sie, bei Benutzung der gebräuchlichen Apparatur
der biochemischen Manometrie, nur anwendbar ist bis zu Sauerstoffdrucken von etwa 300 mm
Wasser. Die Methode hat den weiteren Nachteil, daß bei der Oxydation des Dithionits
NaoSo04 + 02 + H2O -> NaHS04 J NaHSOs
schweflige Säure entsteht, deren Dampfdruck zwar bei pH 3,8 nicht stört, die aber aus Zellen
Kohlensäure austreibt, was bei Versuchen mit Chlorella berücksichtigt werden muß.
Die Methode ist also in keiner Weise der 2-Gefäßmethode ebenbürtig, die wegen ihrer Ein-
fachheit, Sicherheit und Genauigkeit die Standard-Methode der biochemischen Manometrie
bleiben wird. Trotzdem wird die neue Methode in manchen Fällen, insbesondere bei der mano-
metrischen Untersuchung rein chemischer Reaktionen, sich von Nutzen erweisen. Es sei dazu
bemerkt, daß eine andere Methode, an die man hätte denken können, die manometrische Be-
stimmung des Sauerstoffs durch Verbrennung zugesetzten Wasserstoffs oder Kohlenoxyds, wegen
der Boudouard'schcn Reaktion nicht möglich ist, wenn Kohlensäure und Wasser zugegen sind.
368
Ausbau der manometrischen Methoden
II. Manometrie bei höheren Temperaturen
Da viele Reaktionen bei der Temperatur unserer Meß-Thermostaten zu langsam
verlaufen, aber die Temperatur der manometrischen Meß-Thermostaten aus vielen
Gründen nicht beliebig gesteigert werden kann, so schlagen wir als Ausweg vor,
daß man bei Zimmertemperatur mißt, aber in einem andern Wasserbad erhitzt.
Dies ist auf folgende Art möglich :
In den Hauptraum eines Manometrie-Gefäßes wird die Lösung gegeben, die zur
Reaktion gebracht werden soll ; die Birne bleibt leer. Das Gefäß, mit seinem Mano-
meter verbunden, wird im Thermostaten bei 20° ausgeglichen, die Manometer-
stellung wird bei 20° abgelesen. Dann wird der offene Manometerschenkel durch
einen andrückbaren Schliff, wie in Abbildung 2 erläutert, verschlossen. Nachdem
dies geschehen, nimmt man Gefäß + verschlossenes Manometer heraus und
Abbildung 2. Vorrichtung zum Verschluß
des offenen Manometerschenkels.
taucht das Gefäß bis zu etwa l/$ seiner Höhe in heißes Wasser der gewünschten
Temperatur. Ist die Reaktion in der Hitze abgelaufen, so wird das Gefäß mit seinem
Manometer in den 20°-Thermostaten zurückgebracht. Hier wird dann der ver-
schlossene Manometerschenkel wieder geöffnet, und es wird die Manometer-
stellung wieder abgelesen. Die Differenz zwischen der ersten und der zweiten Ab-
lesung bei 20° ergibt die Reaktion, die in der Hitze vor sich gegangen ist. Hat man
reines Wasser in den Hauptraum eingefüllt, so ist nichts vor sich gegangen und die
Differenz ist Null. Diese Kontrolle, die eine Prüfung der Schliffe ist, sollte immer
gemacht werden.
40 Weiterentwicklung der manometrischen Methoden :
Von Otto Warburg und Günther Krippahl
Beschreibung von Manometriegefäßen mit verbessertem Absorptionseinsatz; mit sehr dünnem
Gefäßboden für Röntgenstrahlen-Dosimetrie; mit Birnen für die 2- Gefäßmethode.
Die hier beschriebenen Gefäße sind z. T. zum Patent, z. T. zum Musterschutz angemeldet. Der
alleinige Vertrieb für Deutschland ist der Firma Helmut Hanff, Berlin-Wittenau, Oranienburger
Straße 169, übertragen, für USA: American Instrument Company Silver Spring, Maryland.
I. Einsätze zur Absorption der Kohlensäure
Den zylindrischen Einsatz der Manometriegefäße, der zur Aufnahme der Gas-
absorptionsmittel dient, haben wir ersetzt durch eine in das Gefäß eingeschmol-
zene Wanne (Abb. 1 und 2). Wegen der zentralen Lage der Wanne, wegen der
Abb. 1. Kegelförmiges Gefäß mit Wanne. Der Abb. 2. Wie 1, aber Kastengefäß mit Wanne,
Wannenrand ist gewölbt, damit beim Neigen Volumen ca. 18 cm3,
des Gefäßes keine Flüssigkeit aus der Wanne in
den Hauptraum fließt. Die Kerbe in der Wanne
dient zur Einführung der Pipette.
Volumen ca. 20 cm3.
größeren Oberfläche der absorbierenden Lösungen in der Wanne und wegen der
Bewegung der absorbierenden Lösungen in der Wanne beim Schütteln werden die
Gase aus dem Gasraum schneller absorbiert als in den alten Gefäßen. In Abb. 3
ist der zeitliche Verlauf eines Versuches graphisch dargestellt, bei dem 150 mm3
* Aus Zeitschrift für Naturforschung Band 13b, Heft 7, 1958.
24 Warburg, Zellphysiologie
370
Weiterentwicklung der manometrischen Methoden
Kohlensäure in verschiedenen Gefäßen entwickelt und von Kalilauge absorbiert
wurden. Wie man sieht, dauert die vollständige Absorption der Kohlensäure in dem
Gefäß mit dem zylindrischen Einsatz etwa 30 Minuten, in dem Kegelgefäß mit
Wanne etwa 7 Minuten, in dem Kastengefäß mit Wanne etwa 5 Minuten.
wo
wo
§oo-
^B0
60
•iL1
20
T
•■ — •"■
~\\
-// \
f/\ n
X
T ^V
— x-
»
£ s
1 ii ;
10
15
20
25 30
Minuten -
35
Abb. 3. Zeitlicher Verlauf der C02-Ab-
sorption durch Kalilauge in verschiedenen
Gefäßen bei 20°. Volumen der Gefäße
etwa 20 cm3. In den Hauptraum wurden
3 cm3 Na-2C03-Lösung gegeben, die 150
mm3 CO-2 enthielten, in die Birne 0,2 cm3
W/I-H2SO4, in die Einsätze 0,2 cm3 20 proz.
Kalilauge. Der Gasraum enthielt Luft. Bei
to wurde die Säure in das Carbonat gegeben.
Kurve I : Kontrolle ohne KOH im Ein-
satz, zur Bestimmung der entwickelten
CO:. Kurve II : Altes Kegelgefäß, KOH
im Einsatz. Kurve III: Neues Kegelgefäß
wie Abb. 1, KOH im Einsatz. Kurve IV: Neues Kastengefäß wie Abb. 2, KOH im Einsatz.
Zur Eichung der Wannengefäße gibt man in den Hauptraum etwa 10 //Mole
H2O2, gelöst in 3 cm3 «/10-Schwefelsäure, in die Birne 0,2 cm3 w/l-KMnCh und
entwickelt bei to durch Einkippen des überschüssigen Permanganats den Sauer-
stoff des H2O2 (1 Mol. O2 aus 1 Mol. H2O2). Der Gasraum enthält dabei Luft. Der
Einkippdruck des Permanganats wird durch ein Gefäß ohne H2O2 ermittelt, der
genaue (>2-Wert des H2O2 mit Hilfe eines einsatzlosen Kegels, der vorher mit
Quecksilber geeicht worden ist. Es wird nicht empfohlen, die Wannengefäße mit
Quecksilber zu eichen.
II. Röntgenstrahlen-Dosimetrie
Zur Dosimetrie der Röntgenstrahlen mit Ferrosulfatlösungen1 benutzen wir Glas-
gefäße nach Abb. 4, deren Volumen etwa 10 cm3 beträgt und deren Besonderheit
darin besteht, daß ihr Boden nur etwa 0,2 mm stark ist. Die Durchlässigkeit dieses
dünnen Glasbodens ist hinreichend groß, auch für verhältnismäßig lange Wellen.
Zum Beispiel fanden wir für die Bremsstrahlung eines Müllerschen RT 100-
Geräts mit Wolframanode die in Tab. 1 angeführten Durchlässigkeiten durch die
Mitte des Bodens :
Tab. 1. Durchlässigkeit des Gefäßbodens
für Röntgenstrahlen verschiedener Wellenlängen.
Spannung
[KV]
Stromstärke
[mA]
Alumin.-
Filter
[mm]
Durch-
lässigkeit des
Glasbodens
100
8
1,7
0,92
70
10
1,25
0,90
55
10
0,78
0,83
45
10
0,55
0,72
30
10
0,3
0,50
20
10
0,15
0,32
Weiterentwicklung der manometrischen Methoden
371
Der Glasboden der Gefäße wird nach den Rändern zu etwas dicker. Doch ent-
stehen hierdurch keine Fehler, wenn für die Dosimetrie und den biologischen Ver-
such dasselbe Gefäß verwendet wird.
Abb. 4. Gefäß zur Röntgenstrahlen-Dosimetrie,
Bodendicke ca. 0,2 mm, Volumen ca. 10 cm3.
Wegen des dünnen Gefäßbodens eichen wir die Gefäße nicht mit Quecksilber,
sondern, wie oben beschrieben, mit H2O2 und Permanganat.
III. 2-Gefäßmethode
Da die 2-Gefäßmethode zur Zeit die einzige Methode ist, mit der die Energie-
probleme der Zellphysiologie gelöst werden können, so ist jede Verbesserung der
Methode von großer Bedeutung. In Abb. 5 ist ein altes Gefäßpaar, in Abb. 6 ein
neues Gefäßpaar abgebildet. Es war früher nicht möglich, das kleine Gefäß
Abb. 5. Altes Gefäßpaar.
während der Gasdurchleitung in der Ausgleichszeit hinreichend schnell zu schüt-
teln, da dann Flüssigkeit an den Kapillarstopfen anschlug und von dem strömenden
Gas durch den offenen Kapillarstopfen nach außen gedrückt wurde. Bringt man
aber Birnen wie in Abb. 6 an, so ist ein Herausdrücken von Flüssigkeit während
der Gasdurchleitung nicht möglich, falls die Birnen im richtigen Winkel angesetzt
sind. Dann läuft während des Schütteins niemals Flüssigkeit aus dem Hauptraum
in die Birnen, und es kann während der Gasdurchleitung hinreichend schnell ge-
schüttelt werden, d. h. mit einer Frequenz von 200 pro Minute mit einer Exkursion
von 0,5 cm nach jeder Seite.
372
Weiterentwicklung der manometrischen Methoden
Abb. 6. Neues Gefäßpaar.
Volumen ca. 30 und 18 cm3,
eingefüllteFlüssigkeit 7 cm3.
Man beachte den Ansatz-
winkel sowie den Durch-
messer des Verbindungs-
rohrs der Birnen.
IV. Retention der Kohlensäure
Da der Stoffwechsel der Körperzellen in Serum entscheidend verschieden ist von
dem Stoffwechsel der Körperzellen in Salzlösungen, wie Ringer-, Tyrode-, Krebs-
ringerlösung usw., so kann der normale Stoffwechsel der Körperzellen nur in
Abb. 7. Gefäß zur Bestimmung
der Retention der Kohlensäure.
Volumen ca. 25 cm3, einzu-
füllende Flüssigkeit 7 cm3.
Serum (das mit einigen Volumprozenten Kohlensäure gesättigt ist) gemessen
werden. Da ferner Serum Kohlensäure nicht nur physikalisch löst, sondern auch
dissoziierend chemisch bindet, gehört zu jeder Stoffwechselmessung von Körper-
zellen eine Bestimmung der „Retention" der Kohlensäure für denjenigen Kohlen-
Weiterentwicklung der manometrischen Methoden 373
säuredruck, bei dem der Stoffwechsel gemessen werden soll. Unsere früheren Vor-
schriften zur Bestimmung der Retention, insbesondere die damit verbundenen
etwas umständlichen Rechnungen haben bewirkt, daß der Mediziner im all-
gemeinen noch heute Salzlösungen und Kalilauge im Einsatz vorzieht und somit
nicht den normalen Stoffwechsel mißt, sondern nur Stoffwechsel-Artefakte.
Dem abzuhelfen, sind Gefäße nach Abb. 7 geeignet, die mit Doppelbirnen ver-
sehen sind, deren beide Teile einen Tubus tragen. Der Hauptraum enthält 7 cm3
Serum, die eine Birne enthält Bicarbonat, die andere überschüssige Schwefelsäure,
der Gasraum enthält den beim biologischen Versuch herrschenden CO-2-Druck,
in der Regel 2,5 bis 5 Vol. -Prozent. Die Zunahme des COj-Drucks im Gefäß,
nach Mischen des Bicarbonats mit der Schwefelsäure, ergibt dann, fast ohne Rech-
nung, die Retention der Kohlensäure'2.
V. Prüfung der 2-Gefäßmethode
Das in Abb. 6 dargestellte Gefäßpaar ist wegen der angesetzten Birnen auch zur
Prüfung der 2-Gefäßmethode besonders geeignet.
Sind bei gleicher Füllung der Gefäße die beobachteten Druckänderungen in den
beiden Gefäßen H und H ', so ergeben die Gasgesetze :
H = ho2 + hco2 in
H' = h'o2 + h'coo>
wo ho2 und hco2 die Änderungen der Partialdrucke des Sauerstoffs und der Koh-
lensäure sind.
Bedeuten ferner xo2 und jcco2 den Umsatz des O2 und der CO2 und ko2 und
&co-2 die einfachen Gefäßkonstanten für O2 und CO2, so ist
xo2 = ho2 ' £02 = ä'o2 " k'o2', r2]
*cc>2 = ^co2 • &CO2 = h'co2 ' k'co2
und durch Einsetzen von [2] in [1]
H
*02 XCO2
&O2 kco2
it, *02 *C02
M =-rr-
k'o2 k'co2
zwei Gleichungen, aus denen xo2 und jcco-2 berechnet werden können, da H und
H' durch Beobachtung und ko2 und &co-2 durch die Eichung der Gefäße, die ein-
gefüllten Volumina und die Temperatur gegeben sind.
Läßt man in dem Gefäßpaar nur ein Gas entstehen, z. B. Kohlensäure, indem
man aus den Birnen Säure in Bicarbonat einkippt, so muß der Versuch *<>> =r 0
ergeben; läßt man nur Sauerstoff entstehen, indem man aus den Birnen z. B.
Katalase in Wasserstoffperoxyd einkippt, so muß der Versuch xco2 = 0 ergeben.
Mit diesen beiden einfachen Kontrollen, bei denen immer die Einkippdrucke ab-
zuziehen sind, kann man sich überzeugen, daß die Eichung der Gefäße stimmt;
daß die Retention der Kohlensäure stimmt; daß man richtig gerechnet hat; und
daß die Methode, bei hinreichend großen Druckänderungen, genauer ist als die
meisten biologischen Probleme es erfordern.
Literatur
1 Warburg, O., Schröder, W., Gewitz, H., und Völ- 2 Warburg, O., Gawehn, K., und Geissler, A., Z. Na-
ker, W., Naturwissenschaften 45 (1958), 192. turforschg. Hb (1956), 657; 12b (1957), 115.
41 Weiterentwicklung1 der manometrischen Methoden*
Von Otto Warburg und Günther Krippahl
Das Prinzip der zentral eingebauten Wanne wird zur Weiterentwicklung der Manometrie ausgenutzt.
Wie in Abb. 1 veranschaulicht2, verbinden wir die Wanne mit einer Birne, geben
in den Hauptraum die Zellsuspension und in die Wanne und Birne je 0,2 cm3 neu-
traler Lösungen von KMn04 und K4Fe(CN)6, die beim Mischen KOH erzeugen:
KMn04 + 3 K4Fe(CN)6 = Mn02 + 3 K3Fe(CN)6 + 2 K20.
Abb. 1. Manometriegefäß
zur Bestimmung des Um-
satzes der CO2 und des Oo
in einem Gefäß. Volumen
20 cm3.
KMn04 ist bereits früher von Krebs3 für derartige Zwecke empfohlen worden
in Verbindung mit dem Reduktionsmittel NaJ, das jedoch wegen der Hypojodid-
Bildung Nachteile hat. Die in Abb. 1 abgebildeten Gefäße haben gegenüber Ge-
fäßen, die ich früher Dickens4 zur C02-Bestimmung vorgeschlagen habe, den
Vorzug, daß der ganze Boden des Hauptraums für die Zellsuspensionen zur Ver-
fügung steht und das Alkali nicht in einem Ring am Boden, sondern — viel wirk-
samer — zentral im Gefäß bewegt wird.
* Aus Zeitschrift für Naturforschung, Band 14b, Heft 8/9, 1959.
Weiterentwicklung der manometrischen Methoden 375
Mischt man die Lösungen in Birne und Wanne zur Zeit t, so erhält man den
Partialdruck der Kohlensäure in dem Gefäß zur Zeit t; und hat man auf die gleiche
Weise den Partialdruck der Kohlensäure zur Zeit t0 bestimmt, so hat man die
Änderung des CO-2-Partialdruckes hco2 in der Zeit t — 10 und kann daraus den
Umsatz der CO2 und des O2 für die Zeit t — 10 berechnen :
*C02 = ^C02 ' &C025
*02 = (H hcO-y) " ko2>
H = hco-z -f A02 in der Zeit t — fo,
wo ÄC02 und ^o2 die Gefäßkonstanten für CO2 und O2 bedeuten.
Die Mengen an Reagenzien, die wir einfüllen, betragen im allgemeinen 2,6 mg
KMn04 in 0,2 cm3 H20 = = 16,7 //Mole in der Wanne; und 21 mg K4Fe(CN)6 in
0,2 cm3 H2O = 50 //Mole in der Birne. Diese Mengen reichen zur Absorption von
mehr als 1000 mm3 CO2. Sind die C02-Mengen erheblich größer, so erhöht man
die Mengen der Reagenzien entsprechend.
Als manometrische Sperrflüssigkeit benutzen wir Brodiesche Lösung bis zu
C02-Drucken von 200 mm Brodie, für höhere C02-Drucke hat sich Quecksilber
bewährt, bei Kapillaren-Durchmessern von 0,8 bis 1 mm. Natürlich muß man den
Umsatz der CO2 und des O2 durch Variation der Zellmengen und der Versuchs-
zeiten immer so wählen, daß die Ausschläge an Millimetern Brodie oder an Milli-
metern Quecksilber hinreichend groß werden.
Sind aber die Partialdrucke der CO2 im Gefäß zu groß und sind die Partial-
drucke des Sauerstoffs klein, so ist es oft zweckmäßig, an Stelle der CO2 den O2
zu bestimmen1, indem man in die Wanne 0,4 cm3 Wasser gibt, in die Birne 20 mg
trockene Na^S^C^ und 20 mg trockenes CaCK* Gibt man dann die Salze in die
Wanne, so beginnt sofort die Ch-Absorption
O2 r Na2S204 = Na2S04 + SO2
und man erhält direkt /202s indirekt ÄCO2 = H — ho2.
Enthält der Hauptraum der Manometriegefäße atmende Zellen, so geht nach
dem Mischen von Wanne und Birne die Atmung weiter. Dabei wird die Atmungs-
CO2 in dem Maße, als sie von den Zellen in den Gasraum abgegeben wird, von der
KOH in der Wanne absorbiert und erzeugt also keinen Druck. Dagegen erzeugt
der O2- Verbrauch der Atmung einen negativen Druck, der als Korrektion bei der
C02-Bestimmung berücksichtigt werden muß.
Hat man z. B. im Hauptraum des Manometriegefäßes 50 mm3 Chlorella und im
Gasraum einen CO^-Partialdruck von 200 mm Brodie, so findet man :
Druckänderung nach dem Mischen von Wanne und Birne
[mm]
Endwert 10' nach dem Mischen — 206
Druckänderung in weiteren 5' infolge von Atmung 3
Druckänderung in weiteren 5' infolge von Atmung 3
Also COi-Partialdruck im Gefäß zur Zeit des Mischens 200
* Zusatz 1961. Statt Na-2So04 — CaCl-> benutzen wir heute trockenes &CI2 -
CaCl-2 und geben beide diese Salze in die Wanne, die 0,4 cm3 Wasser enthält.
Na2S2Ü4 hat den Nachteil, daß es SO2 entwickelt bei der Oxydation.
376
Weiterentwicklung der manometrischen Methoden
Bestimmung von gebundener und freier C02
Enthält die Zellsuspension Bicarbonat, so zerfällt nach dem Mischen des Inhalts
von Wanne und Birne durch die Fortnahme des CO-2-Drucks das Bicarbonat ge-
mäß der Gleichung : 2 NaHCQg = Na2COs HaQ + ^
das heißt, man hat nunmehr einen langsamen Strom von CO2 aus der Zellsuspen-
sion in die Wanne, mit der Folge, daß sich der manometrische Endwert nur „krie-
chend" einstellt. In solchen Fällen benutzen wir Gefäße nach Abb. 2, die außer der
mit der Wanne verbundenen Birne noch eine zweite Birne tragen, die mit dem
Hauptraum verbunden ist. Gibt man zur Zeit t aus der zweiten Birne über-
schüssige Schwefelsäure in den Hauptraum, so erhält man das Bicarbonat im Ge-
Abb. 2. Manometriegefäß
zur Messung der gebunde-
nen und der freien Koh-
lensäure. Volumen 20 cm3.
faß zur Zeit t\ und mischt man dann Wanne und Birne, so erhält man die gesamte
im Gefäß vorhandene CO2 und aus der Differenz von gesamter und gebundener
CO2 die im Gefäß vorhandene freie CO2.
Anmerkungen
1. Die Gefäße nach Abb. 1 eignen sich auch zur Bestimmung der „Retention" der Kohlensäure,
d. h. zur Bestimmung der Kohlensäure, die als Bicarbonat gebunden wird, wenn man den Druck
der Kohlensäure erhöht. Wir bringen zu dem Zweck in den Hauptraum 3 cm3 H2O oder 3 cm3
Weiterentwicklung der manometrischen Methoden 377
der retinierenden Flüssigkeit (z. B. Eiweißlösung, Phosphatlösung), in die Wanne etwa 10 //Mole
NaHCC>3, gelöst in 0,4 cm3 Wasser, in die Birne etwa 20 mg KHSO4 (= etwa 150 //Mole), in den
Gasraum so viel Kohlensäure, wie bei dem Versuch mit den Zellen vorhanden ist. Wird dann das
KHSO4 (das nicht in H2O gelöst ist, um Einkippdrucke zu vermeiden) in die Wanne gegeben, so
wird aus der Wanne CO2 entwickelt. Von dieser CO2 absorbiert das Wasser CO2 nur physikalisch,
die retinierende Flüssigkeit aber chemisch, die Differenz ist die chemiseh gebundene CO 2, die
dividiert durch den Druckzuwachs und das Flüc:-igkeitsvolumen die Retention R ergibt. Die
Methode ist der Anordnung mit der siamesischen Birne vorzuziehen, weil hier die CO-2-Entwicklung
im Hauptraum erfolgt und sich deshalb die Gleichgewichte schneller einstellen.
2. Enthält der Gasraum KoJilenoxyd, so werden unter unseren Versuchsbedingungen merkliche
Mengen CO von dem in der Wanne gelösten KMnCM oxydiert, wie Herr Detlev Kayser be-
obachtet hat. Man vermeidet den hierdurch bedingten Fehler, indem man das KMnCM nicht
gelöst, sondern in festem Zustand in die Wanne bringt und das K.4Fe(CN)e in der Birne nicht in 0,2,
sondern in 0,4 cm3 Wasser löst. Gibt man dann zur Zeit r das Ferrocyanid in die Wanne, so wird
das KMnÜ4 in dem Maße, als es gelöst wird, reduziert und kann also kein CO oxydieren.
3. Bei Versuchen mit Blausäure destilliert nach dem Mischen von Wanne und Birne Blausäure
aus der Zellsuspension in die Wanne, doch ist der sich dabei herausbildende Druck der Blausäure
so klein, daß die Manometrie nicht gestört wird.
4. Bei Versuchen mit Licht muß man wissen, daß Ferrocyanid im Licht zu Ferricyanid oxydiert
und dabei alkalisch wird. Wir geben deshalb das Ferrocyanid nicht in die Wanne, sondern in die
Birne, wo es im allgemeinen von dem Lichtstrahl nicht getroffen wird. Arbeitet man aber in
diffusem Licht, so umhüllt man die Birne mit Metallfolie. — Wird die KMn04-Lösung in der
Wanne von Licht getroffen, so wird sie infolge der Licht-Absorption warm, um so mehr, weil die
Wanne von Luft umgeben ist, die die Wärme langsam ableitet. Hier tritt also bei den Übergängen
dunkel — hell und hell — dunkel ein thermomanometrischer Effekt auf, den man eliminiert, indem
man die ersten 5 Min. nach dem Wechsel nicht abliest.
Literatur
1 Warburg, O., und Krippahl, G., Liebigs Ann. Chem. 3 Krebs, H. A., Biochem. Z. 220 (1929), 250.
604 (1957), 94; Z. Naturforschg. 13b (1958), 434. 4 Dickens, F , und Simer, Biochem. J. 24 (1930), 905 und
2 Zum Musterschutz angemeldet. 1301; 25 (1931), 973 und 985; 26 (1932), 90.
42 Weiterentwicklung der manometrischen Methoden
(Carbonatgemische) *
Von Otto Warburg und Günther Krippahl
Mit Hilfe neuer Manometriegefäße ist es möglich geworden, die Zellsuspensionen räumlich von
den Carbonatgemischen zu trennen und den Druckbereich der COo, den die Gemische konstant
halten, auszudehnen auf ein Gebiet von etwa 0,28 bis 600 mm Wasser. Unter den Anwendungen
ist eine sehr einfache 1-Gefäß-Methode zur Messung des Quantenbedarfs der Photosynthese be-
sonders hervorzuheben; ferner die Bestimmung des CO-2-Drucks, der zum Ablauf der Chinon- und
Ferricyanidreaktionen in den grünen Grana notwendig ist.
Die Bicarbonat-Carbonatgemische, die durch das Gleichgewicht
NaHCQ32
NaoCOa ■ COa
den Kohlensäuredruck konstant halten, sind bisher in der Weise angewendet
worden1, daß die Zellen, z. B. Chlorella, in den Gemischen suspendiert wurden.
Alle Druckänderungen in den Manometriegefäßen waren dann nur Änderungen
des O-2-Druckes und die Aufnahme oder Entwicklung von O2 konnte mit den
Abb. 1. Gesamtvolumen ca.
40 cm3. Anhängervolumen
ca. 15 cm3. Hauptraum:
3 cm3 Zellsuspension. An-
hänger : 3 cm3 Bicarb.-Carb.-
Gemisch 2 mg Cartase.
Gasraum : Argon oder Luft.
* Aus Zeitschrift für Naturforschung, Band 15b, (1960): 364.
Zusatz 1961. Die in dieser Arbeit angegebenen Kohlensäuredrucke über den
konzentrierten Carbonatgemischen waren nicht korrekt bestimmt, worauf uns
Dr. Dean Burk, Bethesda/Maryland, aufmerksam machte. In Beitrag 79 ist eine
neue und korrekte Methode zur Bestimmung der Kohlensäuredrucke beschrieben.
Weiterentwicklung der manometrischen Methoden (Carbonatgemische)
379
einfachen Gefäßkonstanten berechnet werden. Der Nachteil war, daß die Ge-
mische die Zellen schädigten.
Wir haben nunmehr diesen Nachteil dadurch behoben, daß wir die Zellen und
die Bicarbonat-Carbonatgemische räumlich voneinander trennen in Manometrie-
gefäßen, deren Form die Abb. 1 zeigt. Die Zellen befinden sich im Hauptraum in
ihrem physiologischen Medium, z. B. Chlorella in ihrem sauren Kulturmedium bei
pH 4,3; während die Gemische sich im Anhänger befinden und nunmehr beliebig
konzentriert und alkalisch sein dürfen.
Es ist ein wesentliches Erfordernis der neuen Methode, daß den Carbonat-
gemischen im Anhänger das Ferment zugesetzt wird, das die Hydratisierung und
Dehydratisierung der Kohlensäure katalysiert und das früher nicht zugesetzt wer-
den mußte, wenn die Zellen mit den Carbonatgemischen in Berührung waren.
Molarität
[Mole//]
Gemisch
cm3 Bicarbonat
cm3 Carbonat
Gleichgewichts-
druck der CO-2
bei 20« C
[mm Brodie]
Retention
mm3
mm • cm3
0,1
85/15
22,00
9,6
0,2
15/85
0,28
CO
0,2
25/75
0,88
CO
0,2
50/50
5,24
103
0,2
65/35
12,40
50,7
0,2
75/25
23,00
24,4
0,2
85/15
49,00
13,7
0,2
90/10
82,00
8,7
0,2
95/5
178,00
3,5
2,0
30/70
19,5
CO
2,0
50/50
55,0
71,3
2,0
65/35
114,0
35
2,0
75/25
231,0
13,5
2,0
85/15
448,0
6,2
3,0
75/25
306,0
24,7
3,0
85,15
612,0
9,86
Tab. 1. CO^-Druck und Retention in Bicarbonat-Carbonat-Gemischen.
2 mg „Cartase" der Schering A.G., zu 3 cm3 Carbonatgemisch zugesetzt, hat sich
dabei als eine ausreichende Menge erwiesen.
Die 0,1 und 0,2-m. Gemische waren Gemische der Natriumsalze; die 2,0 und
3,0-m. Gemische waren Kaliumsalze. Die CO-2-Gleichgewichtsdrucke für die 0,1
und 0,2-m. Gemische wurden nach Auerbach und Pick (Arbeiten aus dem Ge-
sundheitsamt 38, 274 [1911]) berechnet; die CO-2-Gleichgewichtsdrucke für die
2,0 und 3,0-w. Gemische wurden, wie im folgenden beschrieben, gemessen.
Tab. 1 gibt einen Überblick über die von uns verwendeten Carbonatgemische.
Wie man sieht, können wir nunmehr den Kohlensäuredruck von 0,28 bis 612 mm
Brodie (10000 mm Brodie = 1 Atmosphäre), also um das 2200fache variieren, mei-
stens mit ausreichender Retention, wie im folgenden näher begründet werden wird.
Wir haben die Gemische kleinen Kohlensäuredrucks benutzt, um die kleinen
Kohlensäuredrucke zu messen, deren die Chinon- und Ferricyanid-Reaktionen in
380
Weiterentwicklung der manometrischen Methoden (Carbonatgemische)
den grünen Grana bedürfen ; und wir haben das Gemisch, das die großen Kohlen-
säuredrucke von 300 bis 600 mm Brodie konstant hält, benutzt, um eine 1 -Gefäß-
methode zu entwickeln, mit der der Quantenbedarf der C02-Spaltung nunmehr
in einfachster Weise gemessen werden kann. Über beide Anwendungen werden
wir in folgenden Mitteilungen berichten.
Ferner hat Herr Arnold Lehmann die Carbonatgemische benutzt, um die
Photosynthese von Blättern bei variierten Kohlensäuredrucken zu messen. Das
Blatt, dessen Lichtabsorption in unsrer Ulbrichtschen Kugel2 gemessen war, stand
dabei in einem Manometriegefäß nach Abb. 2, mit dem Stengel in der „Vase",
während der Hauptraum 3 cm3 Carbonatgemische verschiedener Zusammen-
setzung enthielt. Man erhält dabei viele Stunden lang konstante Druckänderungen,
wobei der Kohlensäuredruck variiert werden kann, indem man, ohne das Blatt
herauszunehmen, hintereinander verschiedene Carbonatgemische in den Haupt-
raum einfüllt.
Abb. 2. Manometriegefäß
zur Messung der Photosyn-
these von Blättern. Volu-
men ca. 30 cm3. Eine Mes-
sung des Quantenbedarfs der
Blätter mit Hilfe dieser
Methode ist im Gange.
Messung der Kohlensäure-Gleichgewichtsdrucke
Zur Messung der Kohlensäure-Gleichgewichtsdrucke wurden Gefäße nach Abb. 1 benutzt, in
deren Hauptraum das Bicarbonat und in deren Anhänger das Carbonat fest eingewogen wurden
(Vorschlag von Krippahl), während die Birne 2 mg feste Cartase enthielt. Dann wurde auf das
Carbonat im Anhänger soviel Wasser gegeben, daß das Gesamtvolumen nach Herstellung des
Gemischs 3 cm3 betrug. Nach Temperaturausgleich im Thermostaten wurde die Carbonatlösung
auf das feste Bicarbonat in den Hauptraum gegeben, bis zur Lösung des Bicarbonats geschüttelt
und schließlich die Cartase aus der Birne in den Hauptraum gegeben, worauf sich in einigen Min.
der Gleichgewichtsdruck der Kohlensäure einstellte, der in der Tabelle angegeben ist.
Messung der Retention der Kohlensäure
Zur Messung der Retention benutzten wir Gefäße nach Abb. 1. In den Hauptraum gaben wir 5
/«Mole NaHC03, gelöst in 3 cm3 Wasser, in die Birne 0,2 cm3 1-«. H2S04, in den Anhänger 3 cm3
Weiterentwicklung der manometrischen Methoden (Carbonatgemische)
381
des zu prüfenden Bicarbonat-Carbonatgemischs und 2 mg Cartase, in den Gasraum Argon oder
Luft. War im Thermostaten die Temperatur ausgeglichen, so wurde die Schwefelsäure in den
Hauptraum gegeben, und es entwickelte sich ein positiver Druck, der bald konstant wurde, wenn
der Anhänger 3 cm3 Wasser enthielt, der aber schnell kleiner wurde, wenn der Anhänger das
Carbonat-Gemisch enthielt. Zum Beispiel fanden wir:
Gefäß mit Wasser
im Anhänger
v = 41,25 cm:!
&co2 = 3,814 mm2
Druckänderungen
nach Einkippen der Säure J
Gefäß mit 2,0-«;. Gemisch
65/35 im Anhänger
v = 41,65 cm3
&CO2 = 3,854 mm'2;
korr. 3,80 mm2 für Löslichkeit
im Anhänger
5' + 28,5
5' 0
5' 0
5' 0
- 3,85
3
5'
5'
5'
5'
= 35
+ 8,5
— 6,0
-1,5
0
+ 28,5
= 108, 7 mm3 CO-2
108,7-
Rfetention] =
1
+ 1 mm
= 3,85 mm3 CO2
mm3 CO-2
mm • cm3
das heißt, 1 cm3 des Gemischs bindet chemisch 35 mm3 CO2, wenn der C02-Druck um 1 mm steigt.
Auswirkung der Retention auf die Manometrie
Wenn in einem Manometriegefäß nur O2 entsteht oder verschwindet, so ist
xo2 = h ' ko-y,
wo h die beobachtete Druckänderung ist.
Wenn außerdem Kohlensäure entsteht oder verschwindet, so ist
^C02 ' £02
[1J
*o2 = h
&CO2
&o2
h • Kq2 ,
[2]
wo groß K()2 die Gefäßkonstante für O2 für den Fall ist, daß beide Gase entstehen oder ver-
schwinden; und klein &co2 die Gefäßkonstante für Kohlensäure für den Fall, daß nur CO2 ent-
steht oder verschwindet.
Durch die Retention wächst &CO2 der Gl. [2], und zwar um so mehr, je größer R und das Volumen
der retinierenden Flüssigkeit vf wird :
R
Äcos = (*co2 + *>F R),
wo &c0 die Gefäßkonstante für Kohlensäure ist, die der Retention Rechnung trägt.
[3]
Je größer op R wird, um so mehr nähert sich, gemäß Gl. [2], der Wert von groß Kq.2 dem Wert
von klein ko2. Ist wie in unserm obigen Beispiel
&CO2 = 3,85, &02 = 3,41, vf = 3 cm3 und R = 35,
so wird Gl. [2] mit y = — 1
)2 (3,85 + 3 • 35) • &02
xoo = h
^CO,. ' &o2
kR 4- v ' k
O2
(3,85 - 3- 35)— 1 • 3,41
108,9
*Oa = h • -TT7-r ' ko2 = h ■ 1,03 • ko2.
105,4
[4]
382 Weiterentwicklung der manometrischen Methoden (Carbonatgemische)
Der Korrektionsfaktor 1,03 für ko2 ändert sich, wenn wir y verschieden von — 1 annehmen. Aus
den Versuchen mit der 2-Gefäßmethode aber weiß man, daß bei der Atmung und Photosynthese
von Chlorella y nur zwischen - - 0,7 und - 1,3 liegen kann, so daß y ko2 nur sein kann
2,4 für y= -0,7 oder 3,4 für y = 1,0
oder 4,4 für y = — 1,3,
daß also der Korrektionsfaktor von ko2 in Gl. [4] nur die Werte haben kann
1,02 oder 1,03 oder 1,04
und daß man nur einen Fehler von 1",, machen kann, wenn man y = - 1,0 annimmt.
Für jeden Fall von v$ R und &co2 und ko$ wird man auf diese Weise berechnen, wie groß der
Fehler ist, wenn man xo2 mit ko2 statt mit Kq2 berechnet, und man wird nötigenfalls, wie in Gl.
[4], mit einem korrigierten ko-> rechnen.
Literatur
1 Warburg, O., Biochem. Z. 100 (1919), 230; Warburg, 2 Warburg, O., und Krippahl, G., Z. Naturforschg. 9b,
O., Geleick H., und Briese, K., Z. Naturforschg. 6b (1954), 181.
(1951), 285 und 7b (1952), 141.
42 a Glutaminsäure-Decarboxylase in Chlorella*
Von Otto Warburg, Helmut Klotzsch und Günther Krippahl
Wir haben gefunden, daß Chlorella eine sehr wirksame Glutaminsäure-Decarboxy-
lase enthält, ein Ferment, das Glutaminsäure anaerob in y-Amino-Buttersäure und
Kohlensäure spaltet. Diese Spaltungsreaktion in Chlorella verhält sich, z. B. gegen
Blausäure, so ähnlich der durch Fluorid in Chlorella bewirkten Kohlensäure-
abspaltung, daß in Betracht gezogen werden muß, daß die „Fluoridreaktion" eine
Decarboxylierung von Glutaminsäure ist; daß mit anderen Worten Glutaminsäure,
gebunden an Chlorophyll oder Chlorophylloproteid, funktionell im chemischen
Mechanismus der Photosynthese ist.
Aus Die Naturwissenschaften 44 (1957): 235.
43 Über das Verhalten einiger Aminosäuren in Chlorella
bei Zusatz von markierter Kohlensäure*
Von Otto Warburg, Helmut Klotzsch und Günter Krippahl
Die Entdeckung1, daß Glutaminsäure am Mechanismus der Kohlensäure-Assi-
milation in Chlorella als Katalysator beteiligt ist, veranlaßte uns zu untersuchen,
wie lange es dauert, bis bei Belichtung markierte Kohlensäure in denjenigen Ami-
nosäuren erscheint, die in größerer Menge im Hitzeextrakt von Chlorella vorkom-
men: Asparaginsäure, Glutaminsäure und Alanin (a + ß).
In einem kegelförmigen Manometriegefäß, in dem sich 100 cm3 Chlorella be-
fanden**, wurde mit Hilfe einer siamesischen Birne in Luft ein Druck von 150 mm
Wasser an Kohlensäure erzeugt, von der 50 mm 14CO-2 war. Nachdem 5 Min. im
Dunkeln bei Zimmertemperatur bewegt worden war, wurde 0,5 oder 1,0 oder 5,0
Min. mit weißem Licht belichtet. Die absorbierte Lichtintensität war klein; in
5 Min. reagierte das Chlorophyll der Chlorella nur zweimal. Ein sonst gleich ge-
fülltes, aber nicht belichtetes Gefäß ergab das Verhalten der Chlorella im Dunkeln
gegen markierte Kohlensäure.
Sofort nach dem Belichten des einen Gefäßes wurden beide Gefäße 5 Min. in
ein Wasserbad von 75° versenkt, um alle Fermentreaktionen zu hemmen. Dann
wurde zentrifugiert. Die überstehende Lösung, der „Hitzeextrakt", wurde einge-
trocknet, ein aliquoter Teil des Dunkel- und Heil-Extrakts wurde der zweidimen-
sionalen Papierchromatographie mit Phenol-Citrat-Phosphat und mit Butanol-
Propionsäure unterworfen. Die aus Tab. 1. ersichtlichen Impulszahlen pro Min.
wurden mit dem Geiger-Zähler in den Hitzeextrakten von je 10 mm3 Chlorella ge-
funden.
Das Ergebnis ist, daß bereits nach einer halben Min. schwacher Belichtung in
Asparaginsäure und Alanin mehr Aktivität gefunden wird als in den Phosphor-
säureestern. Was die absoluten Werte anbetrifft, so sei angegeben, daß 1 //Mol
unseres Kohlensäure-Präparates, eingetrocknet auf Papier, 1,7 Millionen Impulse
pro Min. ergab sowie daß die Mengen an Aminosäuren im Hitzeextrakt aus 10 mm3
Chlorella von der Größenordnung waren :
(//Mol)
Asparaginsäure einige 1/100
Alanin einige 1/10
Glutaminsäure zwei 1/10
woraus man berechnen kann, daß in 1 //Mol Asparaginsäure sehr bald nach der
Belichtung 1 //Mol 14CO-2 aufgenommen worden war.
Die Aktivität der Glutaminsäure bleibt bei dieser Versuchsanordnung hinter
der Aktivität der Asparaginsäure und des Alanins zurück. Es ist möglich, daß in
Chlorella eine Kette von Aminosäuren katalytisch wirkt, in der die Glutaminsäure
* Aus Zeitschrift für Naturforschung 12b (1957): 481.
** Suspendiert in 0,05% MgSQ4 ■ 7 H2Q + 0,025 % KH2P04, mit H2S04 auf pH 3,8.
Über das Verhalten einiger Aminosäuren in Chlorella usw. 385
Tab. 1. Impulszahlen pro Minute der Hitzeextrakte pro mm3 Chlorella.
Aminosäuren
dunkel
hell
dunkel
hell
dunkel
hell
10'd
10'd
5'd
5'd
5'd
5'd
0,5' d
0,5' h
l'd
l'h
5'd
5'h
Asparaginsäure
8 520
18 750
9 320
14 205
8 000
30 100
Glutaminsäure
1 136
1 614
1 096
1 900
3 350
17 000
Alanin
710
6 950
940
19 000
817
37 500
Phosphorylierte Zucker
und Glycerinsäure
95
3 451
147
9 800
523
23 800
Nicht phosphorylierte
nicht
nicht
Zucker
bestimmt
bestimmt
143
113
857
2 726
nicht an erster Stelle steht. Auch muß man bedenken, daß der chemische Mechanis-
mus der Glutaminsäure-Katalyse noch unbekannt ist und daß wir bisher nur
wissen, daß die Lichtwirkung beim Verschwinden und Entstehen der Glutamin-
säure in lebender Chlorella verschwindet und wieder erscheint.
Die für diese Versuche verwendeten Chlorella-Kulturen waren 2tägige Süd-
fensterkulturen unter Zusatz von 200 W Metallfadenlicht. Die Einsaat betrug
60 mm3 Zellen in 250 cm3 Kulturlösung, die Ernte ca. 700 mm3 Zellen.
Herrn Arthur L. Schade (National Institute of Health, Bethesda) danken wir für die Unter-
weisung in den Methoden der Arbeiten mit 14C.
Literatur
1 Warburg, O., Klotzsch, H., u. Krippahl, G., Naturwissenschaften 44 (1957), 235; Z.Naturforschg. 12b, (1957). 266.
25 Warburg, Zellphysiologie
44 Photosynthesis*
Von Otto Warburg
Ever since Chlorella has been an object of photosynthetic study, it has been known
that there are cells that use light efficiently and cells that use light inefficiently. In
recent years we have sought to discover and control the conditions that give rise
to efficient cells. It has been found that one of the most important conditions is the
light intensity at which the cells are cultured. If one employs artifkial light sources
without interruption, as has been the almost universal practice, the Chlorella are
then too far removed from their natural living conditions of the past half billion
years. The cells are forced to produce organic matter continuously, and more
material than they need for their own synthesis. As a consequence, the energy yield
of the cells is reduced to a small fraction of the optimum yield.
Cells that use light efficiently result, on the other hand, when one allows the
intensity of the light to fluctuate so as to imitate day and night, with dimming late
evening and early morning1. We attain this by varying the operating voltage
automatically from 50 up to 220 volts and back to 50 volts again over a period of
24 hours. The relative quantum intensities of radiation were measured with the
chemical quantum actinometer'2, with results indicated by the ordinate values in
Fig. 1. Cells so cultured use the light best when they are placed in the manometric
vessels in the morning and their photosynthetic efficiency is measured thereafter
during the artificial day.
Equally as important as the culturing of the cells are the conditions under which
the utilization of the light is measured. For example, it was found with monochro-
matic light that the utilization of light in the green or yellow or red was the poorer
the purer the spectral composition. However, good utilization was immediatly
restored when a relatively small amount of blue-green light was added to the main
beam of very pure monochromatic light. One can thus obtain good or poor yields
at will, simply by adding or removing the blue-green light during the measure-
ments of efficiency. If each such test period is made 30 minutes long, one can ob-
serve in an experimental day of 8 hours, with one and the same Suspension, good
yields eight times and poor yields eight times !
The different parts of the blue-green spectrum are not equally effective. The
action spectrum of the blue-green light shows a sharp maximum in the region of
460 m/>, as is shown in Fig. 2. This action spectrum is probably a Carotinoid spec-
trum. An inactive Carotinoid proenzyme is probably converted by the blue-
green light into an active lumino enzyme. As possible analogs, there may be
mentioned light-sensitive visual purple, and ooverdin, a Carotinoid protein dis-
covered by Richard Kuhn.
Both examples — the fluctuating light during culture and the blue-green light
during yield measurement — suffice to make it understandable why, in the last
Aus: Science, 128, (1958): 68—73.
Photosynthesis 387
40 years, in different institutes throughout the world, very different photosynthetic
yields have been found— different not in percentages, but in hundreds of percent.
Even if the manometry and the light measurements had been correct everywhere,
not even approximate agreement would have been possible, owing to ignorance of
the essential conditions of culture and measurement. Thus, in the United States,
during the years 1938 to 1948, an average quantum requirement of 16 per mole-
cule of oxygen gas produced was found, corresponding to an energy yield of 18
percent in red light. This value is removed from the optimal value1 by several
hundred percent.
If one maintains the now-established conditions of good yield, one will obtain
good yields from now on, everywhere and always. Figure 3 shows an example of
oxygen evolution during constant illumination in a 5-hour experiment in which the
quantum requirement per molecule of 0-2 produced was approximately 3 for the
entire period. Any deviation from linearity with time was within the experimental
error. Figure 4 shows oxygen development in a 6-hour experiment in which the
quantum requirement per molecule of O2 produced was approximately 4. Table 1
contains the results of 23 six-hour experiments conducted on 23 days of the months
March to May, 1957, in which only a single instance of a poor yield, namely a
quantum requirement of 7.5, was obtained3.
The quantum requirement of 3 per molecule of O2 signines that in red light
about 90 percent of the incident light energy can be converted into chemical
energy. Since light energy is freely transformable energy, this energy efficiency is
completely compatible with both the first and second laws of thermodynamics.
Thermodynamically incompatible with good yields were only those theories con-
cerning the chemical mechanism of photosynthesis that are today at long last
recognized as incorrect.
In summary, one can say that, with the fixing of the conditions of culture and
measurement, the dispute concerning the efficiency of utilization of sunlight is
finally decided. It is a decision in favor of nature. The reaction by which nature
transforms the energy of sunlight into chemical energy, and upon which the
existence of the organic world is based, is not so imperfect that the greater part
of the applied light energy is lost; on the contrary, the reaction is, like the world
itself, nearly perfect.
The Multiquanta Problem
But how is it possible that carbonic acid can be split by the light quanta of visible
light, which are so deficient in energy that several quanta are necessary? In the
photochemistry of the inanimate world, no reactions are known in which several
quanta react with one molecule at one time, and, moreover, several-quanta reac-
tions are theoretically scarcely conceivable.
The problem was solved several years ago at Dahlem by Dean Burk and us4.
By measuring photosynthesis under special conditions, a Splitting of photosynthesis
into two reactions was observed : a light reaction and a dark reaction. Normally these
two reactions overlap each other so that one cannot observe each one separately.
388
Photosynthesis
100
80
w
\60
t
•40
20
-
/
1
,220V, 300 W
\
- 50V
/
X
/
X
\
\sov
,.v
0 2
I 10 12 14
HOUR OF OAY
16 18 20 22 24
Fig. 1. Fluctuating light intensity
in the culturing of Chlorella.
In the light reaction, one molecule of O2 will develop per molecule of Chloro-
phyll, with, however, a quantum requirement, not of 3, but of 1. This at first
appears to contradict the laws of energy. However, during the dark period follow-
ing the end of illumination it can be observed manometrically, under suitable con-
ditions, that two-thirds of the oxygen gas develop during the light period undergoes
flC 1 1 1 1 1 3
¥00 ¥20 WO ¥60 ¥80 500rap.520
Fig. 2. Action spectrum of blue-green light.
HOURS ILLUMINATED
Fig. 3. Oxygen gas produced at constant
illumination with green light with a small
quantity of blue-green light added (nve-hour
experiment).
a back reaction, with restoration of the original condition wherein light can again
produce O2 as before5. Thus, if the light reaction is not considered by itself, but
together with the dark reaction, all is in order energetically.
Closer study showed that in the dark reaction the oxygen of carbonic acid was
so loosened that, with the help of the energy of respiration, one quantum then
sufficed to produce one molecule of O2. The carbonic acid derivative with the
loosened oxygen is probably a peroxide. In order not to go beyond the facts, we
may call it the "photolyte" of photosynthesis.
If we write the light and dark reactions of photosynthesis one after the other, we
obtain (Chi, Chlorophyll) :
(Light) 3(ChlCO-j*) + 3N0hr - 3C02 -> 3(ChlCO-2) 3C 3(>
(Dark) 2C 202 -■ 2C02 200,000 cal
(Dark) 3(ChlCO-2) - - 3(ChlC02*) — 200,000 cal
(Balance) ICO2 3N„hr - - IC + 102
[1]
[2]
[3]
Photosynthesis
389
Fig. 4. Oxygen gas produced at constant
illumination with green light with a
small quantity of blue-green light added
(six-hour experiment).
7 2 3 4
HOURS ILLUMINATED -
The photolyte derivative of carbonic acid is designated by an asterisk, in order
to distinguish it from the untransformed carbonic acid. Nothing in this reaction
sequence is theory. All has been found experimentally and measured in living
Table 1. Quantum requirement in 23 consecutive experiments
(mole quanta absorbed by Chlorophyll mole O2 developed).
Date
Quantum
Date
Quantum
(1957)
requirement
(1957)
requirement
Mar. 1
4.10
Apr. 1
3.49
3
3.68
3
4.75
5
3.65
9
4.26
6
3.58
10
4.65
7
4.30
11
4.30
14
3.65
15
7.51*
21
4.10
17
3.92
22
3.22
23
3.54
25
4.61
24
2.92
27
3.90
25
3.20
29
3.56
26
4.62
May 1
3.90
* This was the Single instance of a poor yield.
Chlorella. Reaction 1, the light reaction, is measured by the 02 development and
CO2 consumption in the light. Reaction 2 is measured by the 0> consumption and
C02 production in the dark. Reaction 3, in which the bound, inactive carbonic
acid is transformed into the photolyte, is measured by the time that elapses until
the light is again able to develop as much 0> as in reaction 1. In our expenmental
arrangement this recovery period for füll light action lasted about 20 minutes, and
could therefore be followed very accurately in its time course.
The photolyte is written as a Chlorophyll Compound because the quantity of
Oi that the light can develop from the photolyte is equivalent to the Chlorophyll
content of the cells'\ This is important. We now no longer have any need to wonder
how it is possible that the light energy is transferred without loss from the chloro-
390
Photosynthesis
phyll molecule to the photolyte molecule, since we now know that the light acts
within the same molecule that absorbs it. The light reaction of photosynthesis is
thus nothing eise than the photodissociation of a pigment, comparable to the photo-
dissociation of carbon monoxide-hemin Compounds, and the quantum yield of 1
is almost self-evident.
Upon adding the three equations of the reaction sequence, the photolyte is
eliminated, and the net result is the Splitting of carbonic acid by 3 quanta of light,
which is what one finds experimentally in the balance of photosynthesis.
Nothing seems to be simpler than this Solution of the quantum problem. Of the
110,000 calories that are necessary for the Splitting of 1 mole of carbonic acid,
Fig. 5. Vessel for demon-
stration of the necessity
of respiration for photo-
synthesis.
100
90
J0
ho
Z60
.. - i
/«
\
<
V
/
/
i
/
x PHOTOSYNTHESIS
/
QRESPIf
NATION
LZ
/
50
.40
30
20
10
4 8 12 16 20 24
MM02 PRESSURE (MMOF WATER)
Fig. 6. Respiration and photosynthesis at
low pressures of CK
70,000 are provided by a respiratory process. The remaining 40,000 calories that
the light provides is exactly the amount of energy of 1 mole quanta of red light. All
quantum difficulties are thus eliminated.
In order fully to appreciate this Solution, one must reflect that in photosynthesis
no energy would be gained, but rather lost, if the energy of the respiratory process
were taken from the energy störe of the cells. Only because the respiratory energy
of reaction 2 is directly supplied by light is a net gain of energy attained. All detail
is simple physics and chemistry. But the whole is a higher kind of physics and
chemistry, devised by the genius of living nature.
To conclude the discussion of energetics, I would like to describe an experiment
that ought to be demonstra'ced to all students of biochemistry, because it confirms
in the simplest possible way the requirement of our equations that there is no
photosynthesis without respiration.
Figure 5 shows the experi mental vessel that is to be attached to a manometer.
Photosynthesis 391
The vessel contains Chlorella suspended in a carbonate-bicarbonate mixture that
maintains the CO2 pressure constant, so that pressure changes registered by the
manometer can only be changes in O2 pressure. The gas space contains argon and
a very little oxygen.
The essence of our experimental arrangement is that we employ the cells them-
selves to attain the desired low O2 pressures. When we darken the cells the O2
pressure sinks at once on account of the respiration; and when we illuminate the
cells the O2 pressure rises at once on account of the photosynthesis. This cycle can
be repeated as often as desired without opening the vessel. The manometer shows
us at any time the prevailing O2 pressure, and the change in manometer fluid level
shows us for any time period of pressure change the respective respiration or
photosynthesis. We thus learn whether, and in what manner, respiration or photo-
synthesis changes as a function of O2 pressure.
The result is shown graphically in Fig. 6, in which the changes of respiration
and photosynthesis are plotted against O2 pressure. As one sees, both respiration
and photosynthesis change with O2 pressure, and indeed identically. An O2 pres-
sure of 3 mm of water is the half-saturation value for both processes, and 20 mm
yields Virtual Saturation for both processes. Below an O2 pressure of 1 mm of
water, respiration and photosynthesis are both very small.
The experiment shows much more than that oxygen gas is necessary for photo-
synthesis. It shows that not merely traces of oxygen are necessary, but definite and
easily measurable pressures of oxygen, and that these pressures are necessary
because they are necessary for the respiration. All is precisely as our equations
demand. Without respiration, no photosynthesis!
Chemistry of Photosynthesis
We now leave energetics and turn to the chemistry of photosynthesis. The Prob-
lems posed here are clearly given by the results of the energetics. What happens
chemically to carbonic acid in the dark reaction of photosynthesis ? Or, expressed
otherwise, what is the photolyte chemically ? The gates to this field were opened by
the following experiment7.
The main compartment of a conical manometric vessel (Fig. 7) contains a Sus-
pension of Chlorella, the side arm contains fluoride, and the gas Space contains
argon free of CO2 and ö2. The pH of the Suspension and of the fluoride is 3.8.
Upon tipping the fluoride from the sidearm into the main compartment, a vig-
orous evolution of C02 from the cells takes place. From 100 mm3 of Chlorella cells,
30 to 40 mm3 of CO2 will be developed in a few minutes. The content of this labile
CO2 in Chlorella is thus very great — greater, for example, than the content of
oxyhemoglobin-02 in red blood cells. A trace of Cyanide diminishes the develop-
ment of the CO2, from which one must conclude that it is an enzymic reaction that
is activated by the fluoride.
There are two facts of special interest about the fluoride reaction. First, if one
expels the CO2 with N 1000 fluoride anaerobically, and then passes O2 into the
392 Photosynthesis
Suspension, the expelled CO> will for the most part be taken iip again. The energy
of the respiration induced by the added O2 is necessary for this rebinding of COo.
Obviously, the analogy here to the dark reaction in photosynthesis is very far-
reaching.
Second, and equally important : if one expels the labile CO> from the Chlorella
with low concentrations of fluoride, and then illuminates, photosynthesis is found
to be inhibited; but if one removes the fluoride from the cells by washing, and
Fig. 7.
Vessel for measuring labile COj
Suspension
of Chlorella
waits until the CO2 is again aerobically bound, the photosynthetic capacity is
found to be restored. Labile CO2 and photosynthesis are thus mutually depen-
dent.
We have spared no pains to discover what the chemical source of the labile CO 2
is. We have found that it is L-glutamic acid8, which occurs in Chlorella in loosely
bound form to the extent of 0.5 to 1 percent of the dry weight. This glutamic acid
goes into the external medium when a Chlorella Suspension is heated at 90° C for
several minutes. If one determines the glutamic acid content of the centrifuged
external medium before and after a treatment with fluoride, one finds that as much
glutamic acid has disappeared as CO2 has been developed by the fluoride !
7-Aminobutyric acid is formed along with the CO2 in the fluoride reaction.
Aerobically, y-aminobutyric acid and CO2 react in the cells to yield glutamic acid
again, so that aerobically a stationary State is set up between decomposition and
resynthesis of glutamic acid :
L-Glutamic acid ^z ;'-aminobutyric acid -; COo
The '/.-decarboxylation of glutamic acid was discovered in bacteria in 1910 by
Ackermann and in green plant cells in 1937 by the Japanese Okonuki. Both the
Photosynthesis
393
decomposition and resynthesis of glutamic acid can be demonstrated when one
transfers the heated extracts of Chlorella onto Chromatograph filter paper, develops
with phenol-citrate Solution, and sprays with ninhydrin in the Standard way.
;'-amino
butvric acid
• • *
Alanine
Fig. 8. Action of N 80 fluoride:
no difference aerobically and
anaerobically (phenol-citrate-
phosphate ; Whatman filter No. 1
unidimensional).
«*
m
Glutamii
acid
m/80
NaF
Aspartic
acid
Standard -
m 80
NaF
20' aerobic
20' anaerobic
As known test substances for the chromatogram, we have employed aspartic
acid, glutamic acid, alanine, and y-aminobutyric acid. The experimental runs in
Fig. 8 show that under its normal living conditions Chlorella contains little aspartic
acid, much glutamic acid, much alanine, and and no y-aminobutyric acid. We pre-
#
;-amino
butvric acid
* • # * •
Alanine
Fig. 9. Action of N 1000 fluo-
ride; large difference aerobi-
cally and anaerobically (phenol-
citrate - phosphate ; Whatman
filter No. 1 unidimensional).
•
Ü
*
m ***
Glutamic
acid
Aspartic
acid
Standard -
m 1000
NaF
- m/1000 m 1000
NaF NaF
aerobic
anaerobic anaerobic
then aerobic
sume that the glutamic acid is combined with the Chlorophyll, since normally
cultured cells contain one to two molecules of glutamic acid per molecule of Chloro-
phyll. In N 80 fluoride the glutamic acid decreases and appears as y-aminobutyric
acid. This result is obtained both anaerobically and aerobically, since at this high
concentration of fluoride no glutamic acid will be resynthesized.
394
Photosynthesis
In the experiment of Fig. 9 the fluoride concentration was only 7V/1000, and
here one sees a great difference anaerobically and aerobically. Anaerobically the
decomposition is very extensive, but aerobically it is small.
The more the glutamic acid is destroyed, just so much the more is the photo-
synthesis inhibited. For example, two different concentrations of fluoride were
added to aliquot Chlorella suspensions under aerobic conditions, and the glutamic
acid content and photosynthesis measured. Table 2 shows how closely decompo-
sition of glutamic acid and inhibition of photosynthesis parallel each other.
Wo,
Suspension
of Chlorella
2N I actio acid
Fig. 10.
Manometric vessel for
experiments with radioactive
C02.
Continuation of these experiments brought forth a further connection between
glutamic acid and CO 2. A study of the binding of CO2 by Chlorella at different
pressures of CO2 showed that the labile CO2 is not only bound as the a-carboxyl of
glutamic acid but in addition an equal quantity of CO2 is dissociably bound under
aerobic conditions. This dissociable CO2 is also given off when the glutamic acid
in the cells is decomposed. The Saturation value of the dissociating CO2 is very
nearly equal to the glutamic acid content of the cells. The formation of carbamino-
glutamic acid is perhaps involved in the dissociable complex.
In conclusion I may mention further that we have begun to study the behavicr
of amino acids in photosynthesis with the help of radioactive CO2. The main com-
partment of a manometric vessel (Fig. 10) is filled with a Suspension of Chlorella,
the Siamese side arm in one part with C14-carbonate and the other part with excess
lactic acid. Upon tipping the acid onto the carbonate, a pressure of radioactive CO2
Photosynthesis 395
is obtained in the gas phase. Vessels so prepared were illuminated * 2, 1, or 5
minutes and then, along with dark control vessels, immersed in hot water in order
to stop all enzymatic reactions and at the same time extract the soluble materials
from the cells. After centrifugation, the heated extracts were chromatographed in
two dimensions, and measurements were made with a Geiger counter.
It can be seen from Table 3, first, that the amino acids, alanine and aspartic
acid, rapidly became radioactive— indeed, more rapidly than the phosphorylated
glyceric acid, contrary to previous reports in the literature for experiments of this
general type. Second, the table shows that aspartic acid and alanine become ra-
dioactive more quickly than glutamic acid, so that one can think that an alanine-
aspartic acid system enters before the glutamic acid System. Manometric experi-
ments alone have not as yet given any such indication, and one must wait until
combined radiometry, manometry, and bolometry have become so far developed
quantitatively that one can draw more certain conclusions. Radiometry alone has
already led to a multiplicity of errors.
Summary
With the establishment of conditions for optimum cukuring and measurement,
there is now final proof that in photosynthesis at high as well as low light intensities
Table 2. Comparative action of fluoride on decomposition
of glutamic acid and on inhibition of photosynthesis.
Fluoride
concentration
Decomposition
of glutamic acid
(%)
Inhibition of
photosynthesis
(%)
2V/640
N/320
21
64
18
64
the light energy can be almost completely converted into chemical energy. There
is thus drawn to a close an investigation that was initiated many years ago in Berlin
in the Imperial Institute of Physics9.
The second result is the establishment of a general physical mechanism of photo-
synthesis, involving an interplay between light energy and respiratory energy, and
therewith the Solution of the quantum problem in photosynthesis.
The third result is the establishment of the function of Chlorophyll as a stoichio-
metric, chemically reacting component in photosynthesis.
There remains the special chemistry of photosynthesis. In this still-unfinished
field of investigation, the latest discovery is the labile carbon dioxide of Chlorella,
connected with the decomposition and resynthesis of glutamic acid in living Chlo-
rella, and connected with the possible function of the amino acids, aspartic and
glutamic, in the binding and reduction of carbonic acid. The dissociating CO? is
bound by Chlorella only in the presence of O2 and of cellular glutamic acid. This
CO '2 is released if the oxygen pressure is lowered below 2 mm of water or if — in the
presence of oxygen — the glutamic acid is split in the living Chlorella, for example,
396 Photosynthesis
Table 3. Geiger counter impulses per minute by chromatographed heated
extracts of 10 mm:! of Chlorella cells.
Geiger counter impulses per minute
Amino acid or other material
10 min
dark,
10 min
dark,
5 min
dark,
5 min
dark,
5 min
dark,
5 min
dark,
0.5 min
0.5 min
1 min
1 min
5 min
5 min
dark
light
dark
light
dark
light
Aspartic acid
8 520
18 750
9 320
14 205
8 000
30 100
Glutamic acid
1 136
1 614
1 096
1 900
3 350
17 000
Alanine
710
6 950
940
19 000
817
37 500
Phosphorylated sugar and
glyceric acid
95
3451
147
9 800
523
23 800
Nonphosphorylated sugar
Not determined
143
113
857
2 726
by A//10,000 benzoquinone. This is the CO2 that is used in light and taken up in
the dark8.
Remarks
1) Quantum requirement in the United States. In the years 1938 to 1948 the quantum
requirement of photosynthesis was measured in various institutes in the United
States with the result that 12 to 20 quanta were found to be required by Chlorella
for the development of one molecule of O2. The average value was 16. The value of
12 was regarded as the optimum value. A few, including Dean Burk and van
Niel, dissented, but the Interpreters and advocates of the high quantum numbers,
James Franck and Eugene Rabinowitch, maintained the upper hand. In 1941
Franck and Gaffron10 wrote, " We know novo that the high efficiency is only apparent
and that the true efficiency is probably only a third of it, namely 12 quanta per mole-
cule CO-2 reduced" (italics added). The "photosynthesic unit" in Urbana, Emerson
and Rabinowitch, stayed with the high quantum numbers until at least 195211.
Later, under the influence of the Dahlem investigations, the quantum numbers
reported in the United States sank, and today approach the Dahlem number of
4 to 312.
2) Light reaction and dark reaction. According to the equations of the light and
dark reactions, which can be separated in point of time, CO> is taken up anew in
the light reaction, so that the ratio CO2/O2 is about — 1 in the light reaction per se
(although the CO? from which the oxygen is developed may not be the CO2 that
is taken up). However, this holds only for optimally cultured cells whose quantum
requirement in the balance is 3 to 4. Other cells, for example those grown at a
south window with added constant artificial illumination, may take up CO2 more
slowly, so that the ratio CO2/O2 in the light reaction is not — 1 but lies between
— 1 and 0. In the latter extreme the new CO2 is first taken up in the dark reaction
following cessation of illumination. Thus there are two reactions of CO2 to be
distinguished : the binding of CO2, and the transformation of bound CO2 into the
photolyte. In the case of optimally cultured cells, these two reactions of COj may
be completely separated, whereas the O2 development and the binding of CO2
take place simultaneously and equally. In the less active cells the two reactions of
Photosynthesis 397
CO ■» are not separated in time, whereas 02 development and C02-binding are
separated. The unraveling of these relations has cost many experiments.
3) The unit of 2500 Chlorophyll molecules. In 1932 Emerson and Arnold13 at-
tempted to apply our methods of intermittent illumination14 to photosynthesis.
For example, with very short, very bright light flashes and relatively long dark
periods, they determined the maximum quantity of 02 that appeared to be devel-
oped in one light flash. Comparison of this quantity of 02 with the Chlorophyll
content of the cells showed that 2500 molecules of Chlorophyll could develop one
molecule of 02. In contrast, we find, without intermittent light, and with direct
measurement of the light reaction during inhibition of the dark reaction, that one
molecule of Chlorophyll can develop one molecule of 02. There is thus a discrepany
of three powers of 10, depending upon whether the ratio ch!orophyll/oxygen is
measured with intermittent light or directly. As Dean Burk15, 16 has shown, how-
ever, the intensity of the light flash in the experiments of Emerson and Arnold
was several Orders of magnitude too low— that is, entirely insufficient— to decom-
pose all the photolyte in the very short time of the light flash (~ 10~5 second).
4) Burst of carbon dioxide. According to Emerson and Lewis17, photosynthesis
begins with a burst of C02 evolution. This phenomenon was discovered mano-
metrically with the twovessel method, without, however, maintaining the essential
requirement of the method. Instead of both vessels being illuminated simultane-
ously, an interval of 8 to 24 hours took place between illumination of one vessel
and the other. This procedure removed the essential condition of the two-vessel
method, namely, that in the two unequal vessels the same chemical change must
occur. If one properly measures, as nowadays prescribed, the 02 deve!opment in
both vessels simultaneously with a divided light beam, one never finds at the be-
ginning of the illumination a burst of CO-2 out of the living cells, but always and
only a burst of 02 corresponding to true photosynthesis.
5) The experiments of Rüben and Kamen. When Chlorella were illuminated in a
bicarbonate Solution in which the oxygen of the water, but not that of the carbon
dioxide, was isotopically marked, the 02 developed was marked. Rüben and
Kamen18 concluded that the light decomposed primarily the H20 but not the CO-2.
Obviously this conclusion would have been correct only if one could have brought
forth the improbable argument that in light not the hydrate but only the anhy-
dride of carbon dioxide reacted.
6) "Hill" reactions. If one suspends Chlorella cells in nitrate-nitric acid mixture,
the cells develop 02 for many hours when illuminated in the absence of CO-2,
according to the equation
HN03 + H20 = NH3 + 202,
a reaction that was discovered in 192019. The mechanism of this reaction has been
clarified as follows : the nitric acid oxidizes in a dark reaction the carbon of cell
organic matter to carbon dioxide, and then, in light, Splitting of the carbon dioxide
into C and 02 occurs, as in ordinary photosynthesis :
(Dark) HNO;3 2C + HoO = NH3 - 2C02
(Light) 2CO2 = 2C + 2O2
(Balance) HNO3 H20 = NH3 i 202.
398 Photosynthesis
In 1955 we found20 that one can replace the nitric acid by ferricyanide :
(Dark) 4Fe3+ -f C + 2H20 = 4Fe2+ - 4H- - C02
(Light) CO-2 = C + 02
(Balance) 4Fe3+ - 2H20 = 4Fe2+ + 4H+ 02.
Both reactions, with living Chlorella, appear in the balance as though water
were decomposed by light, and as though the oxidizing agent acted only as a hy-
drogen acceptor, whereas in reality the light reaction is ordinary photosynthesis.
If, in the experiments with living Chlorella, one Substitutes quinone for the
nitric acid or the ferricyanide, CO2 cannot participate in the development of O2,
since quinone completely inhibits the Splitting of CCK Likewise, with green grana,
CO2 cannot participate in the development of O2 since illuminated green grana
are unable to reduce CCK
One must therefore either postulate two different mechanisms of photochemical
O2 development in green grana and in intact cells, which is improbable, or one
must attempt to find a common explanation for the two phenomena: for water
decomposition with intermediate photosynthesis, and for water decomposition
without intermediate photosynthesis6.
7) The experiments ofF. W. Allen. In order to test whether photosynthesis without
O2 is possible, Allen21, at the Suggestion of James Franck, made use of the fact
that the phosphorescence of many dyes is diminished by traces of O2. A stream of
nitrogen containing CO2 was conducted over glowing copper, from there over
water, then over a Suspension of Chlorella, over liquid nitrogen, and finally over
the dye acriflavin adsorbed on silica gel. Allen still found detectable photosyn-
thesis at an O2 pressure of 10~6 mm-Hg; whereas our manometry in closed vessels
showed, without possiblility of error, that below 10 ^ mm-Hg photosynthesis in
Chlorella is very small. What is the meaning of this discrepancy of five powers of 10 ?
The method of James Franck must be calibrated empirically — that is, each O2
pressure yielding a given phosphorescence must be analytically determined.
Furthermore, O2 pressures of the order of magnitude of ICH' mm-Hg must be
produced, maintained, and analytically measured in a rapidly flowing gas. Anyone
who is accustomed to performing experiments himself knows that this is an almost
insoluble task. In any event, the analytical determination of traces of O2 is the key
aspect to the Franck method, and since Allen himself remained silent about this
point, one must seek the mistake here. The calibration was obviously false by five
powers of 10.
On the other hand, experiments of Hill and Whittingham22 agree very well
with our results. These workers added reduced hemoglobin to a Suspension of
Chlorella and determined the 02-development upon illumination by optical
measurements of the resulting oxyhemoglobin. They found that photosynthesis
already began to fall off at an O2 pressure of about 2 mm-Hg.
8) The experiments of Allan Brown on „light-respiration.'n When the light reaction
and the dark reaction oberlap in photosynthesis under normal conditions, two-
thirds of the O2 developing in the light will be reabsorbed so rapidly that. one can
think of the oxygen as oscillating between the free State and a binding with carbon.
If the molecular O2 provided the Chlorella is isotopically marked, whereas the CO2
Photosynthesis
399
provided is not marked, one cannot expect that more marked O2 will be consumed
in light than in darkness, since in light, on spatial grounds, the unmarked O2
photosynthetically produced within the cells will be consumed more rapidly than
the externally available marked O2 that must diffuse into the cells. Brown23 found,
in fact, that in light there was no increase in marked respiration, but often even
a decrease of marked respiration; that is, not only the light respiration but also the
dark respiration favored the unmarked oxygen produced within the cells photo-
synthetically from unmarked photolyte. This is a beautiful example of "isotopic
discrimination."
The light respiration during illumination has also been the object of attempted
measurement elsewhere, for example by Weigl, Warrington and Calvin24, who
illuminated green cells in marked CO2 and expected that in light unmarked CO2
would be given off in increasing quantity. They found, however, no increase in
unmarked CO2, quite in agreement with our equations, from which it follows that
the light respiration must be marked when the CO2 is marked.
In fact, the light respiration can only be measured as it was first discovered4 :
when it is separated in time from O2 development25, 26.
References and Notes
1 Warburg, O., Schröder, W., Gattung, H., Z. Natur-
forsch. IIb (1956), 654.
2 Warburg, O., Krippahl, G., Schröder, W., Z. Natur-
forsch. 10b (1955), 631.
3 Warburg, O., and Schröder, W., Z. Naturforsch. 12b
(1957), 716.
4 Burk, D., and Warburg, O., Naturwissenschaften 37
(1950), 560; Z. Naturforsch. 6b (1951), 12.
5 Warburg, O., et al., Z. Naturforsch. 9b (1954), 769.
6 Warburg, O., and Krippahl, G., Svensk Kern. Tidskr.
69 (1957), 143.
7 Warburg, O., and Krippahl, G, Z. Naturforsch. IIb
(1956), 718; 13b (1958), 63.
8 Warburg, O., Klotzsch, H., Krippahl, G., Natur-
wissenschaften 44 (1957), 235; Z. Naturforsch. 12b
(1957), 266; 12b (1957), 481; 12b (1957), 622.
9 Here bolometry, introduced by the American physicist
S. P. Langley, was developed and adapted to photo-
chemistry by Lummer and Kurlbaum. It was Lum-
mer's bolometer that played a decisive role in the dis-
covery of light quanta. It was the bolometer of Lum-
mer and Kurlbaum that was used to measure light en-
ergy in the experiments of Emil Warburg that laid the
foundation of quantitative photochemistry. It is the
same bolometer that has now solved the problem of the
energetics of photosynthesis [F. Kurlbaum, Wiede-
mann's Ann. Physik 65 (1898), 746; O. Lummer and
E. Pringsheim, Verhandl. deut. physikal. Ges. 1
(1899), 23; 2 (1900), 163; M. Planck, ibid. 2 (1900),
237; E. Warburg et al., Ann. Physik 40 (1913), 609;
E. Warburg and C. Müller, ibid. 18 (1916), 245;
E. Warburg, Z. Elektrochem. 27 (1921), 135].
10 Franck, J., and Gaffron, H., Advances in Enzymol.
1 (1941), 200.
11 Ehrmantraut, H., and Rabinowitch, E., Arch. Bio-
chem. 38 (1952), 67.
12 Warburg, O., Biochim. et Biophys. Acta 18 (1955),
163.
13 Emerson, R., and Arnold, W., J. Gen. Physiol. 16
(1932), 191.
14 Warburg, O., Biochem. Z. 100 (1919), 230; O. War-
burg and Negelein, E., Biochem. Z. 202 (1928), 202;
214 (1929), 64.
15 Burk, D., Cornfield, J., Schwartz, M.; Sei. Monthly
73 (1951), 213.
16 Burk, D., Federation Proc. 12 (1953), 611.
17 Emerson, R., and Lewis, C, Am. J. Botany 26 (1939),
808; 28 (1941), 789.
18 Rüben, S., and Kamen, M., J. Am. Chem. Soc. 62
(1940), 3451.
19 Warburg, O., and Negelein, E., Biochem. Z. 110
(1920), 66.
20 Warburg, O., and Krippahl, G., Z. Naturforsch. 10 b
(1955), 301.
21 Allen, F., Arch. Biochem. 55 (1955), 38.
22 Hill, R., and Whittingham, C, New Phytologist 52
(1953), 133.
23 Brown, A., Am. J. Botany 40 (1953), 719.
24 Weigl, J., Warrington, P., Calvin, M., J. Am.
Chem. Soc. 73 (1951), 5058.
25 Reprints of this article may be obtained from the
translators. A general review monograph, "Problems
in Photosynthesis", by W. Bladergroen, will appear
later in the year (Thomas, Springneid, 111.).
26 Note added in proof. Further studies clarifying the
mechanism of Hill reactions are in press: O. Warburg
and G. Krippahl, "Hillreactionen" and "Weiterent-
wicklung der manometrischen Methoden"; O. War-
burg et al., "Oxygenase in Chlorella", Z. Naturforsch.
45 Glutaminsäure in Chlorella*
Von Otto Warburg, Helmut Klotzsch und Günther Krippahl
Versuche über Zerfall und Wiederaufbau der Glutaminsäure in lebender Chlorella und über den
Zusammenhang zwischen Glutaminsäure und Photosynthese.
Wie bereits kurz mitgeteilt1, stammt die Kohlensäure, die Fluorid aus lebender
Chlorella entwickelt-, aus der «-Decarboxylierung der Glutaminsäure:
Glutaminsäure = y-Aminobuttersäure - CO2
eine Reaktion, die Ackermann3 1910 in Bakterien entdeckte und die seitdem weit-
verbreitet in Tier- und Pflanzenreich gefunden worden ist4-7.
Auch gefroren-getrocknete Chlorella ist als Ferment dieser Reaktion wirksam,
jedoch wesentlich schwächer als lebende Chlorella. Bei 20° ist die Halbwertzeit
für 100 mm3 lebende Chlorella 5 Minuten, für die daraus gewonnene Trockensub-
stanz 50 Minuten.
Daß die erhebliche und schnelle Kohlensäure-Entwicklung, die bei Zusatz
von Fluorid zu lebender Chlorella gefunden wird, von einer Decarboxylierung der
Glutaminsäure herrührt, ist durch Manometrie gefunden und durch Papier-
chromatographie bestätigt worden. Immer, wenn Fluorid Kohlensäure aus Chlo-
rella entwickelt, nimmt die Glutaminsäure ab und die y-Aminobuttersäure nimmt
zu; und immer, wenn die Fluoridwirkung gehemmt wird, z. B. durch Blausäure
oder durch Sauerstoff, wird auch die Zersetzung der Glutaminsäure gehemmt.
Chlorella enthält je nach der Züchtung 0,5 bis 1,3% ihrer Trockensubstanz an
Glutaminsäure, und zwar um so mehr Glutaminsäure, als sie Chlorophyll enthält.
Beträgt der Chlorophyllgehalt 5 bis 8%, so kommt 1 Mol. bis 2 Mole. Glutamin-
säure auf 1 Mol. Chlorophyll. Wahrscheinlich ist in diesen Zellen alle Glutamin-
säure an Chlorophyll gebunden. Sehr chlorophyllarme Zellen enthalten mehr
Glutaminsäure als Chlorophyll. Wahrscheinlich ist in diesen Zellen ein Teil der
Glutaminsäure frei, ein Teil an Chlorophyll gebunden.
Es ist eine sehr wichtige Tatsache, daß Sauerstoff die Zersetzung der Glutamin-
säure durch Fluorid hemmt. Die Erklärung ist, daß bei Zusatz von Fluorid die
Atmung steigt und daß durch die Energie der gesteigerten Atmung die zersetzte
Glutaminsäure wieder so weit aufgebaut wird, bis Zersetzung durch Fluorid und
Wiederaufbau durch die Atmung sich die Waage halten. Zum Beispiel zersetzt
n/1000-Fluorid anaerob die Glutaminsäure vollständig, aerob aber, wegen des
Wiederaufbaus, nur zu einem kleinen Teil.
Zersetzung und Wiederaufbau der Glutaminsäure in lebender Chlorella, die
durch Fluoridzusatz manifest werden, sind Reaktionen, die einen Umsatz von der
Größenordnung des Energie-Stoffwechsels haben. Die Idee, daß sie im Mechanis-
mus der Photosynthese eine Rolle spielen, wird nahegelegt durch die Analogie der
durch Licht und durch Fluorid induzierten Atmung, deren Energie in beiden
Fällen zu Reaktionen benutzt wird, an denen die Kohlensäure beteiligt ist.
* Aus Zeitschrift für Naturforschung, Band 12b, (1957): 622.
Glutaminsäure in Chlorella 401
Man kann diese Idee prüfen, indem man die Glutaminsäure zersetzt und dann
die Lichtwirkung mißt. Es zeigt sich dann, daß die Lichtwirkung in dem Maß
sinkt, als die Glutaminsäure zersetzt wird; und daß die Lichtwirkung in dem Maße
wieder steigt, in dem die Glutaminsäure wieder aufgebaut wird.
Die Beteiligung der Glutaminsäure an der Wirkung des Lichts scheint uns durch
derartige Versuche bewiesen zu sein, doch ist auf Grund von Versuchen8 mit radio-
aktiver Kohlensäure daran zu denken, daß ein System Asparaginsäure — Alanin
der Glutaminsäure vorgeschaltet ist, da bei Belichtung die Radioaktivität früher in
Asparaginsäure als in Glutaminsäure erscheint.
Asparagin kommt in sehr kleinen Mengen, Alanin in größeren Mengen in Chlo-
rella vor. Eine Asparaginsäure-Decarboxylase haben wir bisher in Chlorella nicht
nachweisen können.
Die beiden letzten Abschnitte dieser Arbeit betreffen die dissoziierende Kohlen-
säure der Chlorella, insbesondere diejenige dissoziierende Kohlensäure, die nur bei
Gegenwart von Sauerstoff gefunden wird und die Beziehungen zur Glutaminsäure
zu haben scheint. Während wir bei Belichtung keine Abnahme der Glutaminsäure
in Chlorella gefunden haben, zeigte es sich, daß die dissoziierende Kohlensäure,
wenn im Licht Sauerstorf entwickelt wird, erheblich abnimmt und in stark be-
lichteten Zellen völlig verschwindet. Verdunkelt man dann wieder, so steigt die
aerobe dissoziierende Kohlensäure im Verlauf von 20 Minuten — das ist gerade
die Zeit, in der die lichtinduzierte Atmung abklingt9 — wieder auf ihren Dunkel-
wert.
1. Die Versuchszellen und Versuchsmedien
Chlorella wurde in dem früher angegebenen Salzmedium10, unter Zusatz der Mikroelemente, in
250-cm3-Kolben, unter Durchleitung von 5 Vol.-Proz. COo 30 Vol.-Proz. O-i 65 Vol.-Proz. Argon,
bei 25° gezüchtet. Belichtet wurde mit Tageslicht - Metallfadenlicht, oder nur mit Metallfadenlicht,
kontinuierlich oder fluktuierend11. Der Chlorophyllgehalt der Zellen hängt von der Lichtintensität
bei der Zucht ab und wurde von 1% bis 8U,, der Trockensubstanz variiert. Wir bezeichnen in dieser
Arbeit die verschiedenen Kulturen folgendermaßen:
Südzellen. Sie wurden an einem Südfenster unter Zusatz von 300 W Metallfadenlicht am Tage und
200 W Metallfadenlicht nachts gezüchtet. Sie vermehrten sich in 24 Stdn. von 60 auf 350 mm3 und
in 48 Stdn. auf 650 mm3. Die 2tägigen Südzellen enthalten 7 bis 8% ihres Trockengewichtes an
Chlorophyll. Auf 1 Mol. Chlorophyll kommt in diesen Zellen fast genau 1 Mol. Glutaminsäure.
Nordzellen. Sie wurden ohne Zusatz vonTageslicht, in einem gegen außen verdunkelten Raum, mit
2 • 200 W Metallfadenlicht gezüchtet und vermehrten sich in 48 Stdn. von 60 auf 1500 mm3. Sie
enthalten 5 bis 6% ihres Trockengewichts an Chlorophyll. Auf 1 Mol. Chlorophyll kommt in
diesen Zellen 1 Mol. bis 2 Mol. Glutaminsäure.
A -Zellen. Sie wurden ohne Tageslicht mit fluktuierendem Metallfadenlicht (300-W-Lampe,
Spannung 3 Stdn. ansteigend von 50 auf 220 V, 9 Stdn. 220 V, 3 Stdn. absteigend, 9 Stdn. 50 V)
gezüchtet und vermehrten sich in 24 Stdn. von 60 auf 160 mm3, in 48 Stdn. auf 350 mm3. Die
ltägigen A-Zellen haben 4% ihres Trockengewichts an Chlorophyll, die 2tägigen haben 6%
Chlorophyll. In diesen Zellen kommen etwa 1,5 Mole Glutaminsäure auf 1 Mol Chlorophyll.
x-Zellen. Sie entstehen, wenn die Kulturen sehr stark, ohneTageslicht, mit 4 ■ 200-W-Metallfaden-
lampen belichtet werden, die von zwei Seiten nahe an die Kulturkolben herangebracht werden. Sie
vermehren sich in 24 Stdn. von 60 auf 200 mm3. Sie enthalten etwa 1,2% Chlorophyll und 3- bis
5mal soviel Mole Glutaminsäure als Chlorophyll.
Die x-Zellen verhalten sich auch sonst atypisch. Bringt man sie unter anaerobe Bedingungen, so
bilden sie viel mehr und viel schneller Milchsäure als die andern Zellen. Die Folge davon ist, daß
wegen der Säuerung anaerob bald eine Decarboxylierung der Glutaminsäure einsetzt, deren Kohlen-
26 Warburg, Zellphysiologie
402 Glutaminsäure in Chlorella
säure von früheren Autoren irrtümlicherweise auf alkoholische Gärung zurückgeführt worden ist.
Tatsächlich ist die Gärung der Chlorella eine reine Milchsäuregärung. Merkwürdigerweise aber ist
diese Milchsäure nicht L-, sondern D-Milchsäure, wie in einer Arbeit mit Gewitz und Voelker ge-
zeigt werden wird. Was die Wirkung des Lichts in diesen Zellen anbetrifft, so ist sie mindestens
lOmal geringer als in den andern Zellen, offenbar als Folge einer Gegenreaktion der Zellen gegen
die Überbelichtung bei der Zucht. — Die x-Zellen sind als Versuchsmaterial nützlich, wenn man
die Glutaminsäure in Chlorella ohne Zusatz von Fluorid zersetzen will. Wegen der Milchsäure-
bildung wird in diesen Zellen anaerob, ohne Fluorid, Glutaminsäure zersetzt, aerob wird die
Glutaminsäure wieder aufgebaut.
Versuchsmedien. Für die Versuche wurden die Zellen aus der Kulturlösung in einfachere Medien
übertragen, in die Salzlösungen S oder S*.
Salzlösung S. 10 g MgS04 ■ 7 H20 + 5 g KH2PO4 -4g NaCl 0,4 g NH4C1 2 / Wasser
0,6 cm3 »-H2SO4 . pH 3,8.
Salzlösung S*. 10 g MgS04 ■ 7 HjO + 5 g KH2PO4 + 2 / Wasser 0,6 cm3 W-H2SO4 • pH 3,8.
Salzlösungen 1 10 S oder 1/10 S*. Dies waren die Salzlösungen S oder S*, mit Wasser auf das 10-
fache verdünnt. 1 10 S* wurde vielfach für papierchromatographische Versuche verwendet, bei
denen ein höherer Salzgehalt stört. Dest. Wasser schädigt Chlorella und darf als Suspensionsmittel
bei biologischen Reaktionen nicht verwendet werden. Wurden die stärkeren Salzlösungen S und
S* bei papierchromatographischen Versuchen verwendet, so wurde nach Ablauf der biologischen
Reaktion zentrifugiert, die Salzlösung durch Wasser ersetzt, und 10 Min. auf 90° erhitzt und die
überstehende Lösung eingetrocknet.
2. Glutaminsäure, manometrisch mit Zell-Trockenpulver
Chlorella, suspendiert in dest. Wasser, wurde in gefrorenem Zustand getrocknet.
In dem Trockenpulver sind die Formen der Zellen erhalten, jedcch sind die Zellen
nicht mehr teilungsfähig und nicht mehr imstande, im Licht Kohlensäure zu
reduzieren. Das Trockenpulver, suspendiert in Wasser oder Salzlösungen, decar-
boxyliert L-Glutaminsäure, nach unsern bisherigen Erfahrungen keine andern
Aminosäuren, insbesondere nicht Asparaginsäure; und auch nicht Brenztrauben-
säure. Es eignet sich deshalb zur Bestimmung von L-Glutaminsäure in Zellextrak-
ten. Indem wir aus Zellextrakten mit Trockenpulver Kohlensäure entwickelten
und mit Hilfe dieser Tests die Substanz isolierten, aus denen die Kohlensäure
stammte, fanden wir, daß die Quelle der Kohlensäure Glutaminsäure ist. — Die
Suspension des Trockenpulvers in Wasser wird durch 10 3-w. Blausäure inaktiviert,
durch Erwärmen auf 70° schnell unwirksam.
Zur Bestimmung der Glutaminsäure brachten wir 20 mg Trockenpulver in die
Birne eines kegelförmigen Manometriegefäßes. Der Hauptraum enthielt 3 cm3
der zu bestimmenden Lösung. pH nach Zugabe des Trockenpulvers war 5,0, die
Temperatur war 20°, der Gasraum enthielt Argon. Abb. 1 zeigt das Ergebnis eines
Versuchs, bei dem die zugesetzten 4,8 //Mole Glutaminsäure nach 50 Minuten zur
Hälfte zersetzt worden waren.
Einer Erläuterung bedarf, warum ohne Zusatz von Glutaminsäure Kohlensäure
entwickelt wird. Diese Kohlensäure stammt aus der Glutaminsäure des Trocken-
pulvers. Die Glutaminsäure ist in dem Trockenpulver fest gebunden und kann
durch Wasser, sogar bei 100(), nur schwer extrahiert werden. Die so bestimmte
Glutaminsäure betrug in 20 mg Trockenpulver 1 bis 1,5 //Mole.
Beim Erhitzen frischer Zellen jedoch, die in Wasser oder Salzlösung suspendiert
sind, wird die Glutaminsäure extrahiert und kann in solchen Extrakten mit Chlo-
n?//<2-Trockenpulver bestimmt werden. Gibt man vor dem Erhitzen Fluorid zu den
Glutaminsäure in Chlorella
403
Abb. 1. Decarboxylierung der L-Glutamin-
säure durch 20 mg CWor-o 1.00
2 ^ § <2 <■?
Abb. 2. Spaltung der Glutaminsäure in y-Aminobuttersäure + CO> anaerob durch ;//1600- und
»/80-Fluorid. Aerob durch ///80-Fluorid, aber nicht durch ;;/1600-Fluorid.
M •
/-Aminobuttersäure
Alanin
ü
I
Glutaminsäure
Asparaginsäure
20" 45° 52'' 60» Standard
Abb. 3. Spaltung der Glutaminsäure in /-Aminobuttersäure + CO-2 durch Erwärmen auf 45°. Bei
52° und 60" ist nichts zu sehen, weil die Aminosäuren bereits durch die Salzlösung extrahiert
worden sind.
Glutaminsäure in Chlorella 405
••-Aminobuttersäure
Alanin
Glutaminsäure
Asparaginsäure
<
c/3
Abb. 4. /z 80-Fluorid in Argon oder Luft ± Blausäure. Die große Fluoridkonzentration »,80 zer-
setzt in Argon wie in Luft alle Glutaminsäure. 10~3 n-Blausäure verhindert die Zersetzung anaerob
wie aerob.
4. Glutaminsäure, manometrisch
Auf Grund der beschriebenen Versuche ist es unzweifelhaft, daß die labile Kohlen-
säure2 der Chlorella, die sich bei Zusatz von Fluorid oder durch andere Maß-
nahmen entwickelt, aus der a-Decarboxylierung der Glutaminsäure stammt, so daß
man die Glutaminsäure in Chlorella manometrisch bestimmen kann, indem man
Fluorid zu lebender Chlorella gibt und die Entwicklung der Kohlensäure mißt.
Dies ist eine große Vereinfachung gegenüber den Versuchen mit Zellextrakten und
Trockenferment und auch gegenüber den chromatographischen Versuchen. Durch
Zusatz von Fluorid zu lebenden Zellen haben wir die Möglichkeit, Zerfall und
Wiederaufbau der Glutaminsäure im Leben hervorzurufen und dadurch über die
Funktion der Glutaminsäure im Leben Auskunft zu erhalten.
Man muß dabei unterscheiden zwischen hohen und niedrigen Fluoridkonzen-
trationen. «/80-Fluorid ist eine hohe Konzentration, es zersetzt die Glutaminsäure
irreversibel und zersetzt deshalb anaerob und aerob die Glutaminsäure vollständig.
Ordnet man dabei die Manometrie so an, daß v-p klein gegen vo ist, so stört die
Atmung in der kurzen Zeit der Glutaminsäurezersetzung nicht, und man erhält
dieselben Drucke an entwickelter Kohlensäure, ob der Gasraum Argon oder Luft
enthält.
Kleinere Fluoridkonzentrationen, n 1000 bis n 300, zersetzen die Glutaminsäure
reversibel und steigern außerdem die Atmung. Wenn die Bedingungen aerob sind,
wird deshalb der Druck der entwickelten Kohlensäure in nicht übersehbarer Weise
406 Glutaminsäure in Chlorella
vermindert, so daß aerob die Glutaminsäure aus dem entwickelten Druck nicht be-
stimmt werden kann. Um trotzdem die aerobe Glutaminsäure-Zersetzung mano-
metrisch zu messen, lassen wir zunächst die kleine Fluorid-Konzentration ein-
wirken und zersetzen dann den Rest der Glutaminsäure durch viel Fluorid. Wenn
z. B. «80-Fluorid aus 100 mm3 Zellen, die mit Luft gesättigt sind, direkt 40 mm3
Kohlensäure entwickelt, aber nach Einwirkung von rc/1000-Fluorid nur 30 mm3,
so hat w/1000-Fluorid x/4 der Glutaminsäure zersetzt. Man beachte, daß bei dieser
Anordnung alles aerob geschieht und somit alle Einwände, die mit der anaeroben
Milchsäurebildung zusammenhängen, fortfallen.
Bei der „aeroben" Methode ist bei Sättigung mit Luft darauf zu achten, daß
nach Schließen der Hähne nicht zu lange mit der Zugabe des Fluorids gewartet
wird. Andernfalls könnte es sein, daß infolge der Atmung der Kohlensäuredruck
so weit steigt, daß sich merkliche Mengen an dissoziierender Kohlensäure in der
Chlorella bilden (vgl. Abschnitt 6).
5. Zersetzung und Wiederaufbau der Glutaminsäure
Während die Glutaminsäure anaerob durch sehr kleine Konzentrationen an Fluorid
vollständig zersetzt wird, findet aerob eine Rückbildung von Glutaminsäure statt :
Glutaminsäure ^i ;r-Aminobuttersäure -f- COo.
Indessen ist die Reaktion von rechts nach links keine einfache Rückreaktion, da
die Reaktion anaerob vollständig in der Richtung der Zersetzung verläuft. Zur
Rückreaktion, zum Wiederaufbau der Glutaminsäure, ist Sauerstoff, d. h. ist
Atmung nötig und tatsächlich steigt die Atmung, wenn man aerob kleine Mengen
Fluorid zu Chlorella hinzufügt. Zum Beispiel verbrauchten in 5 Minuten 100 mm3
Chlorella, suspendiert in 3 cm3 Salzlösung S, bei 20° in Luft die folgenden Mengen
an Sauerstoff, wenn sich im Einsatz der Manometriegefäße Kalilauge befand:
2täg
ige Südzellen
[mm3]
ltägige A-Zellen
[mm3]
ohne F
10'
10
5,2
in ra/640-F
10'
-12,5
9,4
10'
18,4
-11,4
1
10'
17,9
12,7
Die gleiche Konzentration an Fluorid, in der gleichen Salzlösung, die diese
Steigerung der Atmung bewirkte, entwickelte aus Chlorella anaerob oder aerob die
folgenden Mengen an Kohlensäure aus Glutaminsäure (Endwerte nach 20 Minuten
bei 20»):
[mm3]
| ra/72-F
42
anaerob durch
K/640-F
| w/72-F nach n/640-F
42
0
| w/72-F
42
aerob durch
n/640-F
nicht gemessen
1 h/72-F nach w/640-F
32,9
also aerob durch
«/640-F
42-31,9 = 9,1
Das Ergebnis ist, daß w/640 Fluorid die Glutaminsäure anaerob zu 100 °(), aber
aerob nur zu 21 ",, zersetzt. Aus dem so gefundenen stationären Zustand zwischen
Glutaminsäure in Chlorella 407
Zersetzung und Wiederaufbau der Glutaminsäure und aus der Geschwindigkeit
der anaeroben Zersetzung der Glutaminsäure kann man berechnen, daß aerob (in
w/640-Fluorid) pro Stunde das 21/>fache Zellvolumen an Kohlensäure gebunden
wird.
6. Dissoziierende Kohlensäure
Sättigt man Chlorella mit verschiedenen Kohlensäuredrucken und gibt dann
Fluorid hinzu, so wird nicht nur Kohlensäure aus der Glutaminsäure entwickelt,
sondern auch aus Bicarbonat, das durch Umsetzung mit Salzen schwacher Säuren
entstanden ist, vielleicht auch aus Carbaminsäuren, die durch die Siegfriedsche
Reaktion in Chlorella entstanden sind. Diese Kohlensäure ist abhängig vom Koh-
lensäuredruck, während die aus Glutaminsäure entwickelte Kohlensäure unab-
hängig vom Kohlensäuredruck ist.
Bei diesen Versuchen haben wir die bisher chemisch noch nicht erklärte Tat-
sache gefunden, daß aerob viel mehr Kohlensäure dissoziierend gebunden wird
als anaerob. Wurden z. B. 100 mm3 2tägige Südzellen, die 1,84 //Mole Chlorophyll
enthielten und in 3 cm3 Salzlösung (pH 3,8) suspendiert waren, mit Kohlensäure-
drucken von V20 bis V-2 Atmosphäre gesättigt, so trieb «80-Fluorid bei 20° in
20 Minuten die folgenden Mengen an Kohlensäure aus (Endwerte) :
CO-2-Druck [Atm]
Anaerob CO2 [mm3] (CO-2-Argon)
Aerob CO2 [mm3] (25 Vol.-Proz. Ö2)
Zieht man hier von den anaeroben Werten die aus Glutaminsäure beim CO2-
Druck Null entwickelte Kohlensäure ab, so erhält man die „anaerobe dissoziierende
CO2"; und zieht man von den aeroben Werten die anaeroben Werte ab, so erhält
man diejenige CO2, die nur unter dem Einfluß des Sauerstoffs gebunden wird und die
wir die nur „aerob dissoziierende CO2" nennen wollen. Die beiden Subtraktionen
ergeben :
0
1/20
1/10
1/5
1/2
38,8
44,7
48,2
51,8
56,3
38,0
51,5
63,0
79,5
97
CO-2-Druck [Atm]
1/20
1/10
1/5
1/2
Anaerob CO2 [mm3]
5,9
9,4
13
17,5
Aerob CO? [mm3]
6,8
14,8
27,7
40,7
Das Ergebnis ist in Abb. 5 graphisch dargestellt. Man sieht, daß anaerob wie
aerob der Sättigungswert bei einem COi-Druck von einer halben Atmosphäre er-
reicht wird; er ist für die nur aerob dissoziierende CO2 21/omal so groß wie für die
anaerobe dissoziierende CO2.
Vergleicht man die Dissoziationskurven der nur aerob dissoziierenden CO2 für
verschieden gezüchtete Chlorella, so findet man große Unterschiede, ltägige
A-Zellen — die die besten Quantenausbeuten geben — binden die aerobe CO-j
fester, als 2tägige Südzellen, die eine schlechtere Quantenausbeute geben. Zum Bei-
spiel fanden wir die folgenden Sättigungsgrade der nur aerob dissozierenden CO2 :
COo Druck [Atm] 1/20 1/10 15 1/2
% Sättigung in ltäg. A-Zellen 65 72 84 100
°0 Sättigung in 2täg. Südzellen 17 36 68 100
408
Glutaminsäure in Chlorella
Eine weitere interessante Eigenschaft der nur aerob dissozierenden Kohlensäure
ist, daß der Sättigungswert gleich dem Glutaminsäuregehalt der Zellen ist. In dem
Versuch der Abb. 5 betrug der Gehalt an Glutaminsäure 38,4 mm3, der Sättigungs-
wert der nur aerob dissozierenden CO2 41 mm3 CO2, der Chlorophyllgehalt
41,2 mm3. Glutaminsäuregehalt, Chlorophyllgehalt und Sättigungswert der nur
aerob dissozierenden CO2 waren also innerhalb der Fehlergrenzen gleich.
-5
1
I
35
__
-
" n
32
28
-
2>4
20
76
1
12
8
V
i
i
i
Abb. 5. Disoziierende CO2, durch re/80-
Fluorid bei pH 3,8 und 20° aus Chlorella
entwickelt. I : anaerob dissoziierende CO2.
II: nur aerob dissoziierende CO2 .
5 W 75 20 25 30 35 W V5 50
Vol.- % CO,
Dieselben 3 Größen bestimmten wir für x-Zellen, die 5mal soviel Glutaminsäure
als Chlorophyll enthielten. Wir fanden in 100 mm3 x-Zellen:
Sättigungswert der nur aerob dissoziierenden CO-2
Glutaminsäure:
Chlorophyll:
[//Mole]
1,9
1,9
0,418
In solchen Zellen also, in denen Chlorophyll- und Glutaminsäuregehalt ver-
schieden sind, ist der Sättigungswert der nur aerob dissozierenden CO2 gleich
dem Glutaminsäure- und nicht gleich Chlorophyllgehalt.
Anmerkung. Als wir den Einfluß des Sauerstoffs auf die dissoziierende CO2 fanden, dachten wir
zunächst, daß der anaerobe Wert der dissoziiertenden CO2 kleiner gefunden wird, weil anaerob in
der Sättigungszeit die gebildete Milchsäure bereits einen Teil der CO2 austreibt. Durch Versuche
mit 2tägigen Südz eilen, die anaerob nur sehr langsam Milchsäure bilden und durch Variation der
Sättigungszeiten konnte dieser Einwand ausgeschlossen werden.
7. Glutaminsäure und Lichtwirkung
Bereits in unsrer vorigen Mitteilung2 haben wir beschrieben, wie man durch
steigende Konzentrationen von Fluorid die Lichtwirkung in Chlorella in zuneh-
mendem Maß hemmen kann. Wir können dieses Ergebnis heute so ausdrücken,
daß mit zunehmendem Zerfall der Glutaminsäure die Lichtwirkung mehr und mehr
gehemmt wird. Den Zusammenhang zwischen Glutaminsäure und Lichtwirkung
haben wir jetzt quantitativ untersucht, indem nach der Messung der Lichtwirkung
der Rest an Glutaminsäure durch Zusatz von viel Fluorid gemessen wurde. So
konnten wir für verschiedene (kleine) Konzentrationen an Fluorid Glutaminsäure-
gehalt und Lichtwirkung quantitativ vergleichen. Zum Beispiel fanden wir, wenn
Glutaminsäure in Chlorella 409
aerob mit «640- und n 320-Fluorid der stationäre Zustand zwischen Zerfall und
Wiederaufbau der Glutaminsäure hergestellt worden war :
Konzentration Glutaminsäure- Rest der
des Fluorids Rest Lichtwirkung
[%] [%]
«640 79 82
n/320 36 36
wobei die Lichtwirkung, in 10 Vol.-Proz. C02 30 Vol.-Proz. Oi, mit den Inten-
sitäten J == 430 oder J =-- 57 mm3 Quanten pro Minute bestimmt wurde.
Den Einwand, das Fluorid hemme die Lichtwirkung nicht wegen der Zersetzung
der Glutaminsäure, sondern aus anderen Gründen, kann man ausschließen, in-
dem man die Hemmung der Lichtwirkung durch ein und dieselbe Fluoridkonzen-
tration anaerob und aerob vergleicht, z. B. durch w/1000-Fruorid, das anaerob alle
Glutaminsäure, aber aerob nur wenig Glutaminsäure zersetzt. Dann findet man —
bei der gleichen Fluoridkonzentration — anaerob eine sehr große und aerob eine
sehr kleine Hemmung der Lichtwirkung.
Es lag daraufhin nahe zu prüfen, ob die Glutaminsäure beim Belichten von
Chlorettaabmmmt. Wir haben in keinem Fall eine Abnahme gefunden in Versuchen,
in denen die Glutaminsäure nach langer Verdunklung oder nach Belichtung sowohl
manometrisch mit Fluorid als auch chromatographisch bestimmt wurde.
8. Dissoziierende Kohlensäure und Lichtwirkung
Während die Glutaminsäure im Licht nicht abnimmt, fanden wir, daß die aerobe
dissoziierende Kohlensäure im Licht sehr stark abnimmt. Die Versuche wurden
mit ltägigen A-Zellen ausgeführt, von denen 100 mm3 in 3 cm3 Salzlösung S
(pH 3,8) suspendiert waren und die mit 20 oder 30 Vol.-Proz. C02 25 Vol.-Proz.
O2 gesättigt waren. Zum Beispiel entwickelte « 80-Fluorid die folgenden Mengen
an Kohlensäure: „ „ ,. „ ...
aus Zellen, die 2 Min. mit
aus verdunkelten Zellen J = 30 mm3 Quanten, Min.
belichtet worden waren
90 mm3 C02 73 mm3 CÖ2
oder, wenn mit sehr hoher Intensität belichtet wurde
aus verdunkelten nach 1 Min. nach 5 Min.
Zellen J = 800 J - 800
77 mm3 C02 62 mm3 C02 49 mm3 C02
Die dissoziierende Kohlensäure nahm also bei Belichtung sehr erheblich ab.
Wurden die im 2. Versuch verwendeten Zellen, nachdem sie 5 Minuten mit der
hohen Intensität J =-- 800 Quanten Minuten belichtet worden waren, verdunkelt
und wurde dann nach verschiedenen Dunkelzeiten das Fluorid zu den Zellen ge-
geben, so entwickelte w/80-Fluorid nach wachsenden Dunkelzeiten die folgenden
Mengen an Kohlensäure :
Min.: 0 1 5 10 20 dunkel
C02 [mm3] : 49 46 62 72 75
410
Glutaminsäure in Chlorella
Der Hellwert an dissoziierender CO2 stieg also im Lauf von 20 Dunkelminuten
wieder auf den ursprünglichen Dunkelwert.
Zusammengefaßt ist das Ergebnis der Versuche: Entwickelt man durch Be-
lichtung vorher verdunkelter Zellen die Sauerstoffkapazität11 der Chlorella, so
nimmt während der stöchiometrischen Sauerstoffentwicklung die dissoziierende
Kohlensäure sehr stark ab. Im Dunkeln, in der Zeit, in der die induzierte Atmung
die Sauerstoffkapazität wieder herstellt, steigt die dissoziierende Kohlensäure
wieder auf ihren Anfangswert.
Literatur
1 Warburg, O., Klotzsch, H., und Krippahl, G., Z.
Naturforschg. 12b (1957), 266.
2 Warburg, O., und Krippahl, G., Z. Naturforschg.
IIb (1956), 718.
3 Ackermann, D., Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 69
(1910), 279.
4 Okonuki, K., Botan. Mag. (Tokio) 51 (1937), 270.
5 Taylor, E. S., und Gale, E. F., Bioch. J. 39 (1945),
52.
6 Schales, O., Mims, V., und Schales, S., Arch. Bio-
chemistry 10, 455; 11 (1946), 155.
7 Roberts, E., und Frankel, S., J. biol. Chemistry 190
(1951), 505.
8 Warburg, O., Klotzsch, H., und Krippahl, G., Z.
Naturforschg. 12b (1957), 481.
9 Warburg, O., Krippahl, G., Schröder, W., und
Buchholz, W., Z. Naturforschg. 9b (1954), 769; O.
Warburg und W. Schröder, Z. Naturforschg. 10b
(1955), 639.
10 Vorschrift siehe Z. Naturforschg. 10b (1955), 631.
11 Warburg, O., Schröder, W., und Gattung, H. W.,
Z. Naturforschg. IIb (1956), 654.
46 Beweis der Notwendigkeit der Glutaminsäure
für die Photosynthese*
Von Otto Warburg und Günther Krippahl
Durch Messung der Photosynthese nach anaerobem Zerfall und aerobem Wiederaufbau der
Glutaminsäure unter sonst identischen Bedingungen wird bewiesen, daß die Glutaminsäure in
einem quantitativen Verhältnis zur Photosynthese steht.
Daß die Glutaminsäure, von der Chlorella etwa 1% ihres Trockengewichts in
loser Bindung enthält, mit der Photosynthese der Chlorella zusammenhängt, ist
nach früheren Versuchen1 bereits sehr wahrscheinlich gewesen. Der Beweis ist
nunmehr folgendermaßen erbracht worden :
Gibt man zu Chlorella soviel Fluorid, daß die Fluorid-Konzentration in der
Suspensionsflüssigkeit «1000 ist, so wird die Glutaminsäure unter anaeroben Be-
dingungen in Kohlensäure und y-Aminobuttersäure gespalten; leitet man dann
Sauerstoff ein, so wird die Glutaminsäure wieder aufgebaut. So kann man, durch
Wechsel von anaeroben und aeroben Bedingungen, lebender Chlorella ihre Gluta-
minsäure in kurzen Zeiten fortnehmen und wiedergeben. Verbindet man damit
Messungen der Photosynthese, so findet man, daß «/1000-Fluorid die Photo-
synthese anaerob, aber nicht aerob hemmt. Zerfall der Glutaminsäure und Hem-
mung der Photosynthese, Wiederaufbau der Glutaminsäure und Wiederanstieg
der Photosynthese sind also Vorgänge, die gleichzeitig und in gleichem Maß auf-
treten.
In Abb. 1 ist ein aerober Versuch ohne Fluorid und mit n/1000-Fluorid graphisch
dargestellt, und man sieht, daß die Photosynthese durch das «/1000-Fluorid aerob
kaum gehemmt wird. Nach Beendigung des Versuchs wurden mit 10 Vol.-%
Kohlensäure, 90 Vol.-0 0 Argon anaerobe Bedingungen in den beiden Gefäßen her-
gestellt, und es wurde zunächst 1 Stunde anaerob geschüttelt, um die Glutamin-
säure in w/1000-Fluorid vollständig zu zersetzen. Dann wurde mit der gleichen
Intensität wie vorher bei dem aeroben Versuch belichtet (Abb. 2).
Abb. 2 zeigt, wie erheblich die Photosynthese in «/1000-Fluorid unter den
anaeroben Bedingungen zunächst gehemmt ist. Im Lauf der autokatalytischen Ent-
wicklung des Sauerstoffs im Licht verschwindet jedoch allmählich die Hemmung
der Photosynthese, weil die anaeroben Bedingungen allmählich, mit wachsendem
Sauerstoffdruck, in aerobe Bedingungen übergehen. Die Atmung der Zellen steigt,
durch die Energie der Atmung wird in Kurve II die Glutaminsäure aus ihren
Spaltungsprodukten wieder aufgebaut und gleichzeitig steigt die Photosynthese.
Die quantitativen Verhältnisse sind bei dem anaeroben Versuch bemerkenswert.
Wurde die Glutaminsäure am Anfang und Ende des Versuchs bestimmt, so wurde
in der fluoridfreien Kontrolle anfangs und am Ende die gleiche Menge Glutamin-
säure gefunden, nämlich 1,7 //Mole in den eingesetzten 100 mm3 Zellen. In
rc/1000-Fluorid jedoch wurden anfangs 0 //Mole und am Ende 1,47 //Mole Glu-
Aus Zeitschrift für Naturforschung 13b (1958): 63.
412
Beweis der Notwendigkeit der Glutaminsäure für die Photosynthese
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J20
200
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V
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Abb. 1. Aerober Versuch. In jedem Gefäß
100 mm:! Zellen, suspendiert in Salzlösung
pH 3,8 ohne Fluorid oder in »/1000-Fluorid.
20°. Gasraum 10 Vol.-% CO-2, 30 Vol.-%
0-2, 60 Vol.-",, Argon. Manometriegefäß für
I: v =-- 1 7,808 ; vF = 7. &o2 == 1,031; fcco2 =
1,624; K0z = k°°2 ' k°- 2,83. Mano-
&C02 koz
metriegefäß für II: © 17,624; vf = 7.
&co2 ' &O2
Äo2= 1,016; ÄCOi!= 1.609 ;JCo2
«CO2 — "O2
= 2,75. Grünes Licht. Eingestrahlte Intensität
200 mm:J Quanten pro Minute. Ergebnis:
Fast keine Hemmung der Photosynthese.
10 15 20 25 30 35 HO 15 50
Minuten hell (3=200) *-
taminsäure gefunden. Infolge der autokatalytischen Entwicklung des Sauerstoffs2
war also die Glutaminsäure im Lauf des Versuchs von 0 auf 86",, des Normalweits
gestiegen. In der gleichen Zeit war die Photosynthese von einem sehr kleinen
Wert auf 82% des Nojmalwerts gestiegen, wie man sieht, wenn man die Neigun-
gen der beiden Kurven am Ende des Versuchs der Abb. 2 vergleicht. Diese quan-
titative Übereinstimmung zwischen Wiederaufbau der Glutaminsäure und Anstieg
der Photosynthese — in derselben Zellsuspension, in demselben Gefäß, also unter
identischen Bedingungen — ist ein Beweis für den Zusammenhang zwischen Gluta-
minsäure und Photosynthese, wie man ihn vollkommener sich nicht denken kann.
Indessen sind die chemischen Reaktionen der Glutaminsäure im Mechanismus
der Photosynthese noch unbekannt. Keinesfalls kann die Reaktion
CO2 + y-Aminobuttersäure = Glutaminsäure
die Bindungsreaktion der CO2 bei der Photosynthese sein, da ja, wie wir von An-
fang an fanden, die Photosynthese um so mehr gehemmt wird, je mehr die y-
I
3W
11 320
300
280
260
210
^220
^200
I 180
\160
"§ 1W
^ 120
WO
80
60
W
20
i/h
-
-
-
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&
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-
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-
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* —
^•-^
-.1
m157mm
' Brodie
10 20 30 10 50 60 70
Minuten hell (0-200 cmm Quanten pro Minute) -*■
80
Abb. 2. Anaerober Versuch, allmäh-
lich in aerobenVersuch übergehend. Ist
Fortsetzung von Versuch der Abb. 1,
nach dessen Beendigung 10 Vol.-%
CO2, 90 Vol.-",, Argon eingeleitet.
Dann 50 Min. Anaerobiose im Dunkeln
zur vollständigen Zersetzung der Glu-
taminsäure. Dann bei t == 0 Belichtung
mit J == 200 wie im aeroben Versuch.
Gefäßvolumina, Temperatur, pH wie
im vorigen Versuch. Ergebnis : Anfangs
sehr starke Photosynthese-Hemmung,
die bei wachsendem Sauerstoffdruck
und Wiederaufbau der Glutaminsäure
kleiner und kleiner wird. Glutamin-
säuregehalt am Anfang und Ende vgl.
oben im Text.
Beweis der Notwendigkeit der Glutaminsäure für die Photosynthese 413
Aminob uttersäure sich anhäuft. Dagegen tritt die aerobe dissoziierende CO2 mehr
und mehr in den Vordergrund des Interesses, jene große Menge dissoziierender
CO_>, die bei Gegenwart von Sauerstoff aufgenommen und bei Entfernung des
Sauerstoffs wieder abgespalten wird; und die in einem quantitativen Verhältnis
zur Glutaminsäure steht. Denn läßt man die Glutaminsäure durch Fluorid oder
durch Spuren von Chinon zur Hälfte zerfallen, so verschwindet mit der halben
Glutaminsäure und mit der halben Photosynthese auch die Hälfte der aeroben
dissoziierenden CO2.
Methodisch ist zu den Versuchen zu bemerken, daß es zweckmäßig ist, so stark zu belichten, daß
in der fluoridfreien Kontrolle der Sauerstoff-Sättigungsdruck in 10 Min. erreicht ist. Würde man so
schwach belichten, daß die Erreichung des Sättigungsdrucks in der fluoridfreien Kontrolle 1 Stunde
dauern würde, so würde in n 1000-Fluorid die Induktionszeit etwa 6 Stunden betragen, weil durch
den Wiederaufbau der Glutaminsäure die Induktionszeit auf etwas das 6fache hinausgezogen
wird. — Die Glutaminsäure wurde bestimmt durch Einkippen von 0,2 cm3 0,4 normal Fluorid
in 7 cm3 Zellsuspension, nach Sättigung mit Argon am Anfang und nach Sättigung mit Luft am
Ende der Versuche. Die COj-Entwicklung, die in 15 Min. beendet war, betrug ca. 35 mm3 CO2
(aus den eingesetzten 100 mm3 Zellen), so daß die Genauigkeit der Bestimmung mehr als aus-
reichend war. — Alle notwendigen Daten zur Berechnung der manometrischen Versuche sind in
den Legenden der Abbildungen angegeben.
Berechnung der manometrischen Versuche
Will man aus den Druckänderungen im Licht die Sauerstoffentwicklung berechnen — was über-
flüssig ist, da es nur auf das Verhältnis der Druckänderungen in Fluorid gegen die Kontrolle an-
kommt — so kann man ohne wesentlichen Fehler bei den hohen Lichtintensitäten y = - - 1 setzen
und also .xo2 nach der Gleichung
*o2 == H • Ko* = H ■ *c°2 ' k°* = H • 2,8 [mm3]
«co-2 — £02
berechnen.
Was das Verhältnis der Drucke anbetrifft, so ist in dem Versuch der Abb. 2 zu bedenken, daß
beim Wiederaufbau der Glutaminsäure Kohlensäure gebunden wird. Der Betrag dieser Kohlen-
säure kann aus der Glutaminsäurezunahme während des Versuchs berechnet werden und ist, da
1,47 /*Mole Glutaminsäure neugebildet sind
*co2 = (1,47 • 22,4) • 1,5 = 49 mm3.
Die hierdurch in Gefäß Fluorid bewirkte negative Druckänderung beträgt
— 49 — 49
— 30,5 mm
&CO2 1>61
während die Differenz der Druckänderungen der beiden Kurven in der ganzen Versuchszeit 157 mm
beträgt. 80"o der Differenz der Druckänderungen ist also durch die Hemmung der Photo-
synthese verursacht.
Literatur
1 Warburg, O., Klotzsch, H., und Krippahl, G., Z. 2 Warburg, O., und Krippahl, G., Z. Naturfoischg. 13b
Naturforschg. 12b (1957), 622. (1958), 66.
47 Quantenbedarf der Photosynthese*
Von Otto Warburg und Walter Schröder
Bestimmt man den Quantenbedarf der Sauerstoffentwicklung mit der 2-Gefäßmethode und mit
der Dithionitmethode, so findet man dieselben Quantenzahlen. Die Bedingungen, die den Quanten-
bedarf bestimmen, sind nunmehr festgelegt und werden beschrieben.
Wir haben unsere Bemühungen1 fortgesetzt, die Bedingungen festzulegen, unter
denen Chlorella das Licht gut oder schlecht ausnutzt. Die vorliegende Arbeit zeigt,
wieweit diese Aufgabe nunmehr gelöst ist. Wir können jetzt immer und mit Sicher-
heit den Quantenbedarf 4 erzeugen; und wir finden häufig den Quantenbedarf 3,
der bedeutet, daß im Rot etwa 90 % der vom Chlorophyll absorbierten Licht-
energie in chemische Energie verwandelt wird.
Da Licht freiverwandelbare Energie ist, kann thermodynamisch nichts gegen
die Möglichkeit niederer Quantenzahlen eingewendet werden, wie es in den ver-
gangenen Jahrzehnten oft geschehen ist. Offenbar war es ein irreführender Zufall2,
daß in den Vereinigten Staaten, in den Jahren 1939 bis 1947, gerade diejenigen
hohen Quantenzahlen — 12 bis 20 — experimentell gefunden wurden, die von den
dort aufgestellten Theorien über den Mechanismus der Photosynthese verlangt
wurden. Mit diesen Theorien sind heute alle Einwände gegen die niederen Quan-
tenzahlen zusammengebrochen.
Die Bedingungen der Zucht und Messungen, auf die es ankommt, sind im
wesentlichen die folgenden :
1. Züchtet man Chlorella mit Metallfadenlicht und läßt man die Lampen dauernd
brennen, so zwingt man die Zellen zu einer dauernden Nahrungsproduktion. Als
Gegenmaßnahme senkt die Zelle die Ausnutzung des Lichts. Zellen, die gute Aus-
beuten geben, entstehen nur dann, wenn das Licht wie in der freien Natur in seiner
Intensität fluktuiert. Wir lassen deshalb bei der Züchtung das Licht durch auto-
matische Änderung der Betriebsspannung der Lampe fluktuieren, und zwar so,
daß wir 9 Stunden Tag, 9 Stunden Nacht und 2mal 3 Stunden Dämmerung haben.
Es ist dabei nicht gleichgültig, in welcher Phase der 24stündigen Periode man die
Zellen erntet. Morgens geerntete Zellen geben die besten Ausbeuten.
2. Zu einer Zeit, als wir die spektrale Reinheit des Meßlichts mehr und mehr
steigerten, wurden die Ausbeuten schlechter und schlechter. Die Erklärung wurde
in der Tatsache gefunden, daß Chlorella in ganz reinem rotem, gelbem oder
grünem Licht fast keine Ausbeuten gibt, daß aber die guten Ausbeuten in wenigen
Minuten erscheinen, wenn man zu dem Meßlicht eine kleine Menge blaugrünes
Licht hinzufügt. Früher war es dabei notwendig3, das blaugrüne Licht in Inter-
vallen von 30 Minuten hinzuzufügen und wieder fortzunehmen. Die nach den
heutigen Vorschriften gezüchteten Zellen verlangen dieses Intermittieren, das
unverständlich war, nicht, vielmehr können wir heute bei der Messung des Quan-
tenbedarfs 6 Stunden kontinuierlich mit konstanter Intensität belichten und er
halten dann eine fast gradlinige Sauerstoffentwicklung (Abb. 1 und 2).
* Aus Zeitschrift für Naturforschung Band 12b, (1957): 716.
Quantenbedarf der Photosynthese
415
3. Mißt man den Quantenbedarf für dichte Zellsuspensionen, so erhalten die
Zellen, die sich an der Eintrittsstelle des Lichtstrahls befinden, das meiste Licht,
während die Zellen an der Austrittsstelle des Strahls fast kein Licht erhalten. Da
die Manometriegefäße schnell geschüttelt werden müssen, so werden die Zellen
in den dichten Suspensionen dauernd vom Licht in die Dunkelheit und umgekehrt
getrieben. Die Folge davon sind photochemische Induktionen, bei denen immer
Energie verloren werden kann. Es gehört deshalb zu unseren optimalen Bedin-
gungen, daß das Licht beim Durchgang durch die Manometriegefäße an Intensität
nur sehr wenig abnehmen darf, was bedeutet, daß man mit sehr dünnen Zell-
suspensionen arbeiten muß. Wir lassen heute nur 3 bis 4% des eingestrahlten Lichts
in den Manometriegefäßen absorbieren. Das Problem, geringe Lichtabsorptionen
Datum
1 MoleQuanten
Mole O2
1. 3.
4,10
3. 4.
4,75
4. 3.
3,68
9. 4.
4,26
5. 3.
3,65
10. 4.
4,65
6. 3.
3,58
11. 4.
4,30
7. 3.
4,30
15. 4.
7,51
14. 3.
3,65
17. 4.
3,92
21. 3.
4,10
23. 4.
3,54
22. 3.
3,22
24. 4.
2,92
25. 3.
4,61
25. 4.
3,20
27. 3.
3,90
26. 4.
4,62
29. 3.
3,56
2. 5.
3,70
1. 4.
3,48
Tab. 1. Serie von 23 ^-Bestimmungen.
in trüben Medien zu messen, ist deshalb in den letzten Jahren vordringlich gewor-
den. Mit Hilfe der Ulbrichtschen Kugel4 und eingebautem Zeiss'schen Elektronen-
Multiplier ist es heute vollständig gelöst. Lichtabsorptionen in Chlorella, die nur
3 bis 4% des eingestrahlten Lichts betragen, können wir heute mit einer Genauig-
keit von 3°0 des Absorptionswerts messen.
Von weiteren Bedingungen sei das Vanadium erwähnt, dessen Notwendigkeit
Arnon5 entdeckt hat. Wir fanden, daß das zugesetzte Vanadium öwertig sein muß
und daß sich im Licht aus dem öwertigen leicht das 4wertige unwirksame Vana-
dium bilden kann. Wir setzen deshalb öwertiges Vanadium (als NaVOß) nicht nur
bei der Kultur zu, sondern außerdem immer vor der Messung des Quantenbedarfs.
Im übrigen sollen die Zellen jung, die Kulturen ltägig sein und sie sollen nicht
zuviel Chlorophyll enthalten, da in älteren chlorophyllreichen Zellen ein Teil des
Chlorophylls photochemisch inaktiv ist. Die Zellen sollen bei der Übertragung aus
den Kulturgefäßen in die Manometriegefäße nicht zentrifugiert werden. Die Zell-
suspensionen der Kultur werden also direkt, nur nach Zusatz von Vanadium, in
die Manometriegefäße überpipettiert.
Tab. 1 zeigt, wie regelmäßig die Ergebnisse sind, wenn man nach unseren Vor-
schriften züchtet und mißt. Für die Zellen eines unserer Kulturbecken wurde in
416
Quantenbedarf der Photosynthese
23 Versuchen, bei denen jedesmal 5 bis 5 Stunden kontinuierlich belichtet wurde,
der Quantenbedarf gemessen. Alle Versuche sind in der Tabelle angeführt. Die
Meßmethode war die 2-Gefäßmethode. Die Summe der manometrischen Aus-
schläge betrug +492 mm in dem kleinen Gefäß und +132 mm in dem großen
Gefäß; bei der Berechnung des Mittelwerts waren demnach die Ablesefehler so
gut wie eliminiert. Wir fanden, wenn die Ruheatmung addiert wurde, die aus
Tab. 1 ersichtlichen Werte.
Der Mittelwert ist 4,06. Nur ein Versuch, dessen 1/r/ = 7,5 ist, fällt aus der
Reihe heraus. In 13 Versuchen ist der Quantenbedarf kleiner als 4.
In den Abb. 1 und 2 sind 2 Versuche beschrieben. Der Versuch der Abb. 1
wurde gewählt als Beispiel eines methodisch einwandfreien Versuchs, bei dem der
1 2 3 v 5
Stunden kontinuierlich hell — +■
Abb. 1. (Protokoll 1). Zeitlicher Verlauf der
Sauerstoffentwicklung aus 3,5 mm:! Chlorella
(2-Gefäßmethode).
Stunden kontinuierlich hell — *■
Abb. 2. (Protokoll 2). Zeitlicher Verlauf der
Sauerstoffentwicklung aus 3,5 mm3 steril ge-
züchteter Chlorella (2-Gefäßmethode).
Quantenbedarf 3 ist. Die Besonderheit des Versuchs der Abb. 2 ist, daß die Chlo-
rella aus einer einzelnen Zelle unter sterilen Bedingungen herangezüchtet worden
war. Beide Versuche zeigen die fast geradlinige Sauerstoffentwicklung im Verlauf
von 5 bis 6 Stunden.
Die 2-Gefäßmethode, mit der bisher die Sauerstoffentwicklung gemessen worden
ist, setzt voraus, daß in den beiden Gefäßen chemisch dasselbe vor sich geht. Alles,
bis auf die Volumina, muß in den beiden Gefäßen gleich sein. Gleich müssen die
eingestrahlten Lichtintensitäten sein und gleich müssen auch die Absorptionen,
d. h. die Zelldichten und die Grundflächen der Gefäße sein. Dies erfordert die
Teilung sowohl des Meßlichts als auch des blaugrünen Lichts und die bolometri-
sche Justierung von vier Lichtstrahlen, und damit Einrichtungen, die unsres
Wissens zur Zeit nur in Dahlem vorhanden sind. Emersons irrtümliche Ent-
deckung des C02-Ausstoßes zu Beginn der Photosynthese ist ein Beispiel dafür,
wohin die unsachgemäße Handhabung der Methode führen kann. Statt zwei Ge-
fäße gleichzeitig zu belichten, belichtete Emerson beide Gefäße in Zeitintervallen,
die 8 bis 24 Stunden auseinanderlagen.
Quantenbedarf der Photosynthese
417
Man benötigt nur ein belichtetes Gefäß, wenn man den im Licht entwickelten
Sauerstoff mit Dithionit6 bestimmt. Der Hauptraum (Abb. 3) enthält die Zellen,
die Birne das Dithionit, das zur Zeit Null in ein Dunkelgefäß und nach der Be-
lichtung in ein Hellgefäß eingekippt wird.
Abb. 3. Gefäß zur Bestimmung des Quantenbedarfs mit Dithionit. Volumen etwa 33 cm3. Haupt-
raum: 3 bis 4 mm3 Zellen, suspendiert in 7 cm3 Kulturlösung, auf pH 3,8 angesäuert. Birne: 20 mg
Na-2S-204 : 20 mg CaCK Gasraum: 10 Vol.
CO-2, 2,5 Vol.-% 0-2, 87,5 Vol.-% Argon.
Wir fanden in 6 1 stündigen Versuchen (Protokoll 4) die folgenden Druck-
zunahmen des Sauerstoff-Partialdrucks und damit den Quantenverbrauch :
Versuch
Druckzunahme
in 60' Belichtung
[mm]
1 Mole Quanten
in den Gasraum getrieben die den durch Sauer-
stoffabsorption erzeugten negativen Druck verkleinert. Sind die Gefäße gleich groß, so hebt sich
dieser Gegendruck in der Differenz (ho—h) heraus.
Quantenbedarf der Photosynthese
421
Enthält der Hauptraum Zellen, so wird auch aus den Zellen COj beim Einkippen der Salze
ausgetrieben*. Der Gegendruck, der hierdurch entsteht, hebt sich in ho — h nur dann heraus, wenn
beim Einkippen beide Gefäße dunkel oder beide Gefäße hell waren. Andernfalls ist der Gegen-
druck verschieden, weil im Licht die aerobe dissoziierende CO-: kleiner ist, als im Dunkeln. Hat
man nur einige Zellen im Hauptraum und ist die Lichtintensität niedrig, so ist der hierdurch
entstehende Fehler von der Größenordnung einiger 1/10 mm3 und kann in der Regel vernach-
lässigt werden. In anderen Fällen z. B. wenn man 100 mm3 Zellen im Hauptraum hat, muß die
Korrektur berücksichtigt werden. Sie wird dann mit Hilfe von n /80-Fluorid — ohne Na^S-iOi —
bestimmt.
Enthalten die Manometrie-Kästchen zuviel Flüssigkeit, so können beim Schütteln Flüssig-
keitsstäubchen in die Birne einspritzen, die bewirken, daß das Dithionit in der Birne Sauerstoff
absorbiert. Wir benutzen deshalb große Manometriekästchen von 33 cm3 Inhalt. In Versuchs-
dauern von 1 Stde. haben wir dann keine Fehler durch Einspritzen beobachtet. Doch ist dies
der schwache Punkt der Methode und man muß für jede neue räumliche und zeitliche Anordnung
durch Kontrollen ohne Zellen prüfen, daß ho h gleich Null ist.
Manometrie.
Gefäß I
Gefäß II
Beispiele
v = 33,212
v = 33,025
vF = 7,00 cm3
vF = 7,00 cm3
*o, = 2>46
- 20°
?02
2,45
Zellen
[mm3]
Grün
Blaugrün
[mm]
h
[mm]
(ho—h)
[mm]
(Äo — h) ko2
[mm3]
1 Mole Quanten
Nr.
absorbiert
[%]
'/ Mole 02
(Nach Addition
der Atmung)
1
3,5
3,3
19
-215,5
-220
4,5
11,0
3,80
2
4,0
4,5
25
-215,5
-220
4,5
11,0
4,96
3
4,0
4,2
24
-218,0
-223
5,0
12,3
4,27
4
4,0
4,2
24
-220,5
-226,5
6,0
14,7
3,72
5
4,0
4,2
24
-219,5
-225
5,5
13,5
3,98
6
4,0
4,0
23
-218,0
-223
5,0
12,3
4,00
-30,5
Mittel 4,13
Tab. 3. Versuche mit der Dithionitmethode, 7 -Berechnung wie in den Protokollen 1, 2 und 3
Licht. 60 Min. Grün eingestrahlt 24,8 mm3 Quanten pro Min., davon absorbiert vgl. Tab. 3.
Blaugrün (470 m/0 eingestrahlt 1,0 mm3 Quanten pro Min., davon absorbiert vgl. Tab. 3.
Protokoll 5 (mit G. Krippahl)
Die Zellen wurden mit fluktuierender Lichtintensität gezüchtet und vermehrten sich in 20 Stdn.
von 60 auf 178 mm3. 100 mm3 Zellen enthielten 1 Mikromol Chlorophyll. Die Zellen wurden
2mal in Salzlösung ,,S" gewaschen und dann in der Salzlösung „S" suspendiert. Die Zelldichte
betrug 100 mm3 Zellen in 7 cm3 Salzlösung.
Salzlösung „S". 5 g MgSO.i • 7 H20; 2,5 g KH2P04; 2,0 g NaCl; 0,2 g NH4C1; mit Wasser
auf 1000 cm3; mit Schwefelsäure auf pH 3,8 angesäuert.
Manometrie. 2-Gefäßmethode. Kästchen. 20°. Gasraum 10 Vol.-",, CO_>, 30 Vol.-",, O?, 6OV0I.-",
Argon.
vF' = 7,00 cm3.
&'co2 = 1,519 mm*2.
vF = 7,00 cm3.
&co2 = 2,944 mm2.
3,94 — H- 7,61,
4,92 H ■ 12,48.
v' == 16,759;
k'o2 = 0,931;
v = 32,08;
&O2 = 2,356;
Xo2 = H' ■
XC02 = - H'
Licht. Grün aus Kinolampe 500 W wie in Protokoll 1. Eingestrahlt 30,6 mm3 Quanten pro
Min., davon absorbiert 81,03 Prozent. Blaugrün 60 W Metallfandenlampe mit Blaufilter in 45 cm
422
Quantenbedarf der Photosynthese
Entfernung von den Gefäßen. Eingestrahlt 1 mm3 Quanten pro Min., davon absorbiert 100 Prozent.
Vorbehandlung. Die Zellen wurden zunächst 2 Stdn. im Thermostaten geschüttelt, um die
Ruheatmung zu verkleinern.
Wir fanden (bg == blaugrün, h = grün + blaugrün, Berechnung nach Z. Naturforschg. 9b, 769
(1954).
Großes Gefäß
Kleines Gefäß
[mm]
[mm]
5'bg
-0,5
-2,0
H
H'
0,1
0,4
xq2 + 15,6
- =
/
— 1,015
3 = 4,86
1/9» =
3,59
Kompensations-
10
— 1,0
—2,0
licht allein
i
Tab. 3. Messung des Quantenbedarfs für ein grünes Lichtinkrement. Je 200 mm3 Zellen: 7 cm3
Kulturlösung. Gasraum 10% C02-Luft. 20°. J = = eingestrahlte Quantenintensität pro Minute.
Absorbierter Bruchteil 93,9 Prozent.
Neubestimmung des Quantenbedarfs der Photosynthese mit der Kompensationsmethode 457
Trägt man die nach Tab. 3 erhaltenen 1/r/: -Werte als Funktion der eingestrahlten Quanten-
intensität auf, so erhält man eine fast gerade Linie (Kurve in Einleitung), die bei I/93 = 2,8 die
Ordinatenachse schneidet. Der Grenzwert von I/93 für J = 0 ist also 2,8. Wie in der Einleitung
erläutert, ist dies nahezu der energetisch mögliche Wert. Eine Korrektur für Chlorophyllabsorption
war hier nicht anzubringen, da der Spektralbezirk des Inkrements nur vom Chlorophyll absorbiert
wurde.
Im Rot (610 — 675 m/0 wurden die gleichen Ausbeuten erhalten.
Literatur
1 Warburg, O., Burk, Dean, Schocken, V., und Hen-
dricks, St., Biochim. biophysica Acta (Amsterdam) 4
(1950), 335; O. Warburg und Dean Burk, Arch. Bio-
chemistry 25 (1950), 410.
2 Warburg, O., Burk, Dean, Schocken, V., und Hen-
dricks, St., Biochim. biophysica Acta (Amsterdam) 4
(1950), 335; O. Warburg und Dean Burk, Arch. Bio-
chemistry 25 (1950), 410.
3 Burk, Dean, Hendricks, St., Korzenovsky, M.,
Schocken, V., und Warburg, O., „A Rediscovery."
Science 110 (1949), 225.
4 Warburg, O., und Krippahl, G., Z. Naturforschg. 9 b
(1954), 181.
5 Warburg, O., und Schröder, W., Z. Naturforschg.
12b (1957), 716.
5a Warburg, O., und Schocken, V., Arch. Biochemistry
21 (1949), 2.
6a Burk, Dean, und Warburg, O., Z. Naturforschg. 6b
(1951), 12.
6 Warburg, O., Schröder, W., und Gattung, H. W.,
Z. Naturforschg. IIb (1956), 654.
7 Warburg, O., Krippahl, G., Schröder, W., Buch-
holz, W., und Theel, E., Z. Naturforschg. 9b (1954),
164; O. Warburg, G. Krippahl und W. Schröder,
Z. Naturforschg. 9b (1954), 667; O. Warburg, G.
Krippal und W. Schröder, Z. Naturforschg. 10b
(1955), 631.
8 Ununterbrochene maximale Photosynthese würde bei
nichtgrünen Zellen ununterbrochener maximaler Nah-
rungsaufnahme entsprechen.
9 Warburg, O., und Negelein, E., Z. physik. Chem. 106
(1923), 191.
10 Burk, Dean, und Warburg, O., Z. Naturforschg. 6b
(1951), 12; O. Warburg, G. Krippahl, W. Schröder
und W. Buchholz, Z. Naturforschg. 9b (1954), 769;
O. Warburg und W. Schröder, Z Naturforschg 10b
(1955), 639; O. Warburg und W. Schröder, Z. Na-
turforschg. 12b (1957), 716; O. Warburg, G. Krip-
pahl, H. S. Gewitz und W. Völker, Z. Naturforschg.
146 (1959), 712.
11 Warburg, O., Biochem. Z. 100 (1919), 230; vgl. auch
O. Warburg und Mitarbb., Z. Naturforschg. 6 b
(1951), 285; 7b (1952), 141. Diese beiden Arbeiten
sind nunmehr durch die räumliche Trennung aus Zel-
len und Carbonatgemischen überholt.
12 Emerson, R., und Lewis, C. M., Amer. J. Bot. 26
(1939), 808; 28 (1941), 789.
13 Franck, J., und Gaffron, H., Advances in Enzymol. 1
(1941), 199.
14 Warburg, O., Schröder, W., und Gattung, H. W.,
Z. Naturforschg. IIb (1956), 654.
15 Warburg, O., und Krippahl, G., Z. Naturforschg.
13b (1958), 434.
16 Warburg, O., Krippahl, G, und Schröder, W., Z.
Naturforschg. 9b (1954), 667; 10b (1955), 631.
17 Warburg, O., und Schocken, V., Arch. Biochemistry
21 (1949), 2.
18 Warburg, O., und Negelein, E., Z. physik. Chem. 106
(1923), 191.
19 Burk, Dean, und Warburg, O., Z. Naturforschg. 6 b
(1951), 12.
20 Warburg, O., Krippahl, G., Buchholz, W., und
Schröder, W., Z. Naturforschg. 8b (1953), 675.
21 Warburg, O., Burk, Dean, Schocken, V., Kocze-
novsky, M., und Hendricks, St., Arch. Biochemistry
23 (1949), 2.
22 Warburg, O., und Krippahl G. Z. Naturforschg.
13b (1958), 434.
54 Glykolsäurebildung in Chlorella
Von Otto Warburg und Günther Krippahl
Unter geeigneten Bedingungen erhält man bei der Photosynthese von Chlorella eine dem Kohlen-
säureverbrauch äquivalente Menge an Glykolsäure.
Glykolsäurebildung bei der Photosynthese von Chlorella ergab sich zuerst aus
assimilatorischen Quotienten, die vielfach den Wert 1,33 erreichten1. Später wurde
diese Glykolsäurebildung durch analytischen Nachweis von Tolbert2 bestätigt.
Im folgenden wird gezeigt, daß bei der Photosynthese von Chlorella unter geeig-
neten Versuchsbedingungen die dem Kohlensäureverbrauch äquivalente Menge an
Glykolsäure erscheint.
Das Ergebnis von Tolbert (1. c), daß die Glykolsäurebildung Bicarbonat in der
Auß^nflüssigkeit erfordert, können wir nicht bestätigen. Bei den meisten unserer
Versuche war die Chlorella in saurem Phosphat (pH 4,3) suspendiert.
Die Herstellung definierter niedriger C02-Drucke
Dies war ein wesentliches Erfordernis dieser Arbeit. Wir benutzten dazu Carbonat-
Bicarbonatgemische4, die bei 20° die folgenden berechneten CO-i-Drucke ergaben:
CO>-Drucke
l' -NaHCOs
™ -NaoCOs
in mm
Brodie
15
85
0,28
25
75
0,88
50
50
5,24
75
25
23,0
85
15
49,0
95
5
173
Die Zellen wurden entweder in den Gemischen suspendiert, wobei sich dann die
Zellen in einem unphysiologischen alkalischen Medium befanden, oder aber es
wurden, unter Benutzung der neuen Wannengefäße5, die Zellsuspensionen und
Carbonatgemische räumlich getrennt. In die Wanne gaben wir die Zellen in ihrem
normalen sauren Kulturmedium von pH 4,3, während die Carbonatgemische auf
den Boden der Gefäße gegeben wurden und von hier aus im Gasraum und in den
Zellen die gewünschten Kohlensäuredrucke erzeugten.
Bestimmung der Glykolsäure
Glykolsäure wurde kolorimetrisch mit 2.7-Dihydroxynaphthalin nach Eegriwe6
bestimmt. 10 mg des Reagens wurden in 100 cm3 reiner konzentrierter Schwefel-
Aus Zeitschrift für Naturforschung 15b (1960): 197.
Glykolsäurebildung in Chlorella
459
säure jeden Tag frisch gelöst. Zu 0,2 cm3 der x-Lösung, die etwa 0,01 //Mol
Glykolsäure enthalten soll, wurden 3 cm3 des Reagens gegeben und damit 10
Minuten im siedenden Wasserbad erhitzt, wobei eine rotviolette Färbung entstand,
die im UV violett fluoresziert. Die Methode wurde kontrolliert durch Extraktion
der Glykolsäure mit Äther nach Clausen und Analyse des Calciumsalzes.
Bei den Versuchen mit Chlorella konnte die Glykolsäure im allgemeinen direkt
in der Außenflüssigkeit nach Abzentrifugieren der Chlorella bestimmt werden,
störende Verunreinigungen erkennt man an der unreinen Farbe und der Unrein-
heit des Fluoreszenzlichts. Dann mußte, z. B. wenn der C/z/ore//a-Suspension
Zucker zugesetzt war, die Glykolsäure zunächst im Clausen-Apparat extrahiert
werden, nötigerweise nach Enteiweißung mit Metaphosphat.
Abhängigkeit der Glykolsäurebildung vom Kohlensäuredruck
In den Hauptraum von 4 kegelförmigen Wannengefäßen wurden je 3 cm3 Kali-
lauge oder Carbonatgemisch gegeben, in den Gasraum Sauerstoff", in die Wanne je
2 mm3 Chlorella, suspendiert in 0,4 cm3 m/50-Phosphat pH 4,3. Nachdem bei
20° 800 mm3 Quanten pro Minute (weißes Licht) eingestrahlt worden waren,
wurde aus dem Inhalt der Wannen die Chlorella herauszentrifugiert und im Über-
stand die Glykolsäure kolorimetrisch bestimmt, was trotz der eingesetzten sehr
kleinen Zellmenge wegen der großen Empfindlichkeit der Glykolsäurereaktion gut
möglich war.
Wir fanden :
Im Hauptraum
KOH
50 'j-NaHCOg
50 £-Na2C03
85 +NaHCO;!
15™-Na2C03
95 "z-NaHCÜ3
5 ™-Na.2C03
COi-Druck mm Brodie
//Mole Glykolsäure in
60 Minuten
O-2-Entwicklung in
60 Minuten, mm Brodie
fast Null
0,05
5,24
0,15
11,5
49,0
0,08
21
173
0,005
-33
Abb. 1 ist eine graphische Darstellung des Versuchs. Das Maximum der Glykol-
säurebildung liegt bei 5 mm Brodie und fällt nicht mit dem Maximum der Oi-
Entwicklung zusammen. Bei einem Kohlensäuredruck von 173 mm Brodie werden
nur noch Spuren von Glykolsäure gebildet.
Ausbeute an Glykolsäure
Wenn die Glykolsäure aus der im Licht reduzierten Kohlensäure entsteht, so kann
maximal 1 Molekül Glykolsäure entstehen, wenn 2 Moleküle Kohlensäure im Licht
verbraucht werden. Nach den Ergebnissen des vorigen Abschnitts kann diese
maximale Ausbeute an Glykolsäure nur erwartet werden, wenn der Kohlensäure-
druck so niedrig ist, daß er die Glykolsäurebildung noch nicht hemmt. Ein geeig-
460
Glykolsäurebildung in Chlorella
neter Kohlensäuredruck war 5 mm Brodie, der durch ra/5-Carbonat-Bicarbonat-
gemisch 50 + 50 erzeugt wird. In den Hauptraum eines Manometriegefäßes
wurden 100 mm3 Chlorella gegeben, suspendiert in 3 cm3 des Gemischs 50 -f 50.
t
I
.1
0,150
0,135 V
0,120
^0,105
•S 0090
%
Ca
I
0,075
0,060
0,0V5
0.030
0,015 -
Abb. 1. Abhängigkeit der Glykol-
säurebildung vom CO-2-Druck. Me-
dium: ;///50-KHoPO4, pH 4,3.
0,2 0,V Oß 0,8 1,0 12 1H 16 18
C0Z -Druck in % einer Atmosphäre —
20
Der Gasraum enthielt reinen Sauerstoff", die Temperatur war 20°, die eingestrahlte
Intensität an weißem Licht betrug 800 mm3 Quanten pro Minute. Nach 60 und
120 Minuten wurde der entwickelte Sauerstoff am Manometer abgelesen. Im
Überstand der Zellen wurde die Glykolsäure bestimmt, Xo2 + (Glykolsäure/2)
ergab den CO-j-Verbrauch Xcoo- Wir fanden:
nach 60 Min.
nach 120 Min.
[//Mole]
[//Mole]
C"2 entwickelt (.vo2)
12,6
23,5
Glykolsäure gebildet
9,0
18,0
CO-2 verbraucht (XCO2)
12,6 + 2 == 17>!
23,5 + ™ = 32,5
— CO2
+ Glykolsäure
?-«■»
32-5 .. 1,8
18
Im Mittel wurden also 1,85 //Mole Kohlensäure verbraucht, wenn 1 Molekül
Glykolsäure erschien. Die Ausbeute an Glykolsäure war also 92% der Theorie.
Zeitliche Trennung von Reduktion der Kohlensäure und Bildung von
Glykolsäure
Damit Chlorella Glykolsäure produziert, sind ein hoher Sauerstoffdruck, ein
niedriger Kohlensäuredruck und intensive Belichtung notwendig, was durch den
folgenden Versuch und seine graphische Darstellung in Abb. 2 anschaulich
demonstriert wird.
In den Hauptraum von 4 Manometriegefäßen wurden 200 mm3 Chlorella, sus-
pendiert in 3 cm3 m/50-Phosphat pH 4,3, gegeben. Der Gasraum enthielt 2 Vol.-%
CO2 — O2, was bei den Abmessungen der Gefäße {v = ~18 cm3) bedeutete, daß
Glykolsäurebildung in Chlorella
461
jedes Gefäß etwa 15 //Mole Kohlensäure enthielt. Die Temperatur war 20°. Ein-
gestrahlt wurde weißes Licht der Intensität 800 mm3 Quanten pro Minute, das ist
soviel, daß die Kohlensäure nach 15 Minuten verbraucht war, wie der Umschlag
positiver in negative Druckänderungen zeigte. Wurde nun im Abstand von 15
Minuten je ein Gefäß herausgenommen und die Glykolsäure im Überstand der
Abb. 2. Zeitliche Trennung
von Kohlensäure-Reduktion
und Glykolsäurebildung.
m/50-KH2 PO4, pH 4,3.
10
* 6.5
6,0
,5.5
•Sä W
f~7,0 cm3. I: In Serum, ohne AS2O5, II: In
Ringerlösung, ohne AS-2O3, III: In 10'3-m.
As'203-Serum.
zeugten die embryonalen Zellen negative Drucke, da sie aerob nur atmen aber nicht
gären2. War das Medium Ringerlösung (Kurve II), so erzeugten die Zellen positive
Drucke, da Ringerlösung die Atmung entkoppelt und dadurch aerobe Gärung
erzeugt. War das Medium Serum + 10^-m. arsenige Säure (Kurve III), so er-
zeugten die Zellen positive Drucke, da die arsenige Säure die Atmung zum Teil
* Aus Zeitschrift für Naturforschung 12a (1957): 115.
Zusatz 1961. Während des Krieges ist in vielen Ländern behauptet und durch
falsche Versuche begründet worden, daß der normale Stoffwechsel, insbesondere
der embryonale Stoffwechsel, ein Gärungsstoffwechsel sei und daß die embryonale
Entwicklung der höheren Lebewesen ein anaerobiotischer Vorgang sei, womit
natürlich die Gärung der Tumoren eine bedeutungslose Erscheinung wurde. In
der vorliegenden Arbeit wird versucht, die Wissenschaft wieder auf den Boden
der Tatsachen zurückzuführen und dem im Krieg entthronten Sauerstoff wieder
den ihm zukommenden Platz anzuweisen. Wie es eine Wiederentdeckung auf dem
Gebiet der Photosynthese gab — die Wiederentdeckung des großen Energieum-
satzes — so gibt es auch hier nach dem Krieg eine Wiederentdeckung, die Wieder-
entdeckung der Funktion des Sauerstoffs im Leben der höheren Organismen.
Manometrie der Körperzellen unter physiologischen Bedingungen
497
hemmt, zum Teil entkoppelt, und dadurch aerobe Gärung erzeugt. Diese Wirkung
des Arsens auf die Energieproduktion der Körperzellen kann man jedoch, wie die
Abb. 1 zeigt, nur finden, wenn das Medium, in dem die Zellen suspendiert sind,
Serum ist. Ist das Medium Ringerlösung oder irgendeine andere Salzlösung und
setzt man das Arsen zu den Salzlösungen, so wird man die Wirkung des Arsens auf
die Energieproduktion übersehen, da das Arsen eine zum größten Teil entkoppelte
Atmung vorfindet.
Der Versuch zeigt, daß Salzlösungen als Medien bei der Manometrie der Körper-
zellen nicht benutzt werden dürfen, wenn Fragen der Carcinogenese oder der
Abb. 2. Kleines Gefäß, v = = 16,1 cm3; w ~
7 cm:!. Krebszellen und normale Körperzellen
in homologem, mit Milchsäure angereichertem
Serum. Je 10 mg Zellen (Trockengewicht).
38°. 5 Vol.-Prozent CO*— ö2.
I. Mäuseascites-Krebszellen. II. Rattengehirn
(Mark). III. Mäuse-Uterus (nicht geschnit-
ten). IV. Ratten-Niere (Mark)*. V. Ratten-
Milz. VI. Ratten-Gehirn (Rinde). VII. Mäuse-
Chorion. VIII. Ratten-Leber. IX. Ratten-
Niere (Rinde - Mark). X. Ratten-Netzhaut.
-WO
Chemotherapie untersucht werden sollen. In der Tat sollte man heute Versuche,
bei denen Salzlösungen als Medien benutzt worden sind, als nicht mehr zeitgemäß
streichen in allen Fällen, in denen die Energieproduktion zur Diskussion steht.
Bei den Versuchen mit Serum hat sich gezeigt, daß es nicht gleichgültig ist, ob
man homologes oder heterologes Serum benutzt, auch wenn man das Serum vorher
durch Erwärmen auf 57° inaktiviert. Man wird deshalb immer homologes Serum
benutzen. Es hat sich ferner gezeigt, daß es zweckmäßig ist, dem Serum L(-f)
Milchsäure zuzusetzen, weil die kleine Milchsäurekonzentration des normalen
Serums, die im strömenden Blut konstant gehalten wird, im Verlauf eines mano-
* Zusatz 1961. Zu der Kurve IV (Rattenniere Mark) vergleiche man den Zusatz
1961 in Beitrag 58.
32 Warburg, Zellphysiologie
498
Manometrie der Körperzellen unter physiologischen Bedingungen
metrischen Versuchs schnell verbraucht wird und weil dann die Atmung derjenigen
Zellen sinkt, deren Atmungs-Substrat Milchsäure ist.
Berücksichtigt man dies, so wird man bei der Manometrie intakter normaler
Körperzellen ebensowenig aerobe Gärung finden wie im lebenden Tier. Natürlich
ist die Milchsäurebestimmung im strömenden Blut lebender Tiere die entschei-
dende Methode; aber man kann nunmehr die Manometrie der Gewebeschnitte,
mit der so viel entdeckt worden ist, auch zur Untersuchung der Energieproduktion
benutzen, wenn man die hier beschriebenen Bedingungen einhält und die hier
untersuchten Versuchsobjekte benutzt.
Zum Beleg des Gesagten sind in den Abb. 2 und 3 einige Versuche graphisch
dargestellt, bei denen das Serum homolog und mit l(+) Milchsäure angereichert
war. Die Versuche der beiden Abbildungen sind gleichzeitig, mit aliquotem Zell-
+60
Abb. 3. Großes Gefäß, v == 23,34
cm3; ^f ~ 7 cm3. Im übrigen alles
wie in Abb. 2. Je 10 mg Gewebe
ßff (Trockengewicht).
material, in verschieden großen Gefäßen ausgeführt worden, so daß man aus den
korrespondierenden Drucken, mit den Formeln der 2-Gefäßmethode, die Atmung
und die Gärung berechnen kann. Die Ergebnisse der Rechnung sind in der Tab. 1
zusammengestellt. In dem kleinen Gefäß (Abb. 2) erzeugen nur die Krebszellen
positive Drucke. Alle andern Gewebe erzeugen negative Drucke; und zwar erzeu-
gen die embryonalen Zellen, die in erster Linie mit den Krebszellen zu vergleichen
sind, sehr erhebliche negative Drucke. In dem großen Gefäß (Abb. 3) erzeugen die
Krebszellen positive Drucke; von den normalen Geweben erzeugt die Netzhaut
geringe positive Drucke, während alle übrigen normalen Gewebe negative Drucke
erzeugen.
Für viele Zwecke ist eine Berechnung der Atmung und Gärung nicht notwendig,
sondern man kann sich mit der Feststellung begnügen, ob positive oder negative
Drucke entstehen und ob irgendeine zugesetzte Substanz positive Druckänderun-
gen in negative umschaltet. Mit einfachen Kegelgefäßen (ohne Einsätze) kann man
so in großen Versuchsserien feststellen, ob eine Substanz auf die Energieproduktion
wirkt und in welcher Richtung sie wirkt.
Es bleibt von allen normalen intakten Geweben nur eine Ausnahme bei der
Manometrie übrig, die Netzhaut. Bringt man aber die Netzhaut, die man schnell
Manometrie der Körperzellen unter physiologischen Bedingungen
499
Nr.
Zellart
Kleines
Gefäß
(mm)
Großes
Gefäß
(mm)
Retention
<2o.
Qco2
I
Mäuse-Ascites-Krebszellen
ü'f = uf=7,15 cm3
30' 24,5
60' 48,5
30' 27
60'- 54
1,0
(Milchsäure)
- 6,1
-27,4
- 21,3
II
Rattengehirn (Mark)
z/F = z;F = 7,35 cm3
30' 19
60' 36,5
30'— 6,4
60'— 12,8
0,67
(COo)
5,9
7,2
1,3
III
Mäuse-Uterus (gravid)
ü'k=wf=7j15 cm3
30'— 19,3
60'— 39
30'— 7,2
60'— 15
0,49
(COo)
6,6
6,9
- 0,3
IV
Rattenniere (Mark)
z>'f = ^f=7,5 cm3
30'— 28,2
60'— 54,4
30'— 12,8
60'— 25,6
0,84
(COo)
5,9
- 4,3
0
V
Rattenmilz
^'f = ^f = 7,35 cm3
30'— 38
60'— 77,5
30'— 15,8
60'— 32,8
0,87
(C02)
9,7
- 9,7
0
VI
Rattengehirn (Rinde)
^'F = tJF=7,35 cm3
30' 43
60' 82
30'— 15,3
60'— 30
0,79
(COo)
12,3
14,7
+ 2,4
VII
Mäuse-Chorion
z/F = i>F=7,15 cm3
30'— 64,5
60'— 124,5
30'— 28,5
60'— 57,5
0,50
(CO-2)
15,3
- 12,4
0
VIII
Rattenleber
v'f ■' ^f=7,35 cm3
30'— 68,5
60'— 142,5
30'— 28,6
60'— 59,4
0,71
(co2)
18,7
-18,3
0
IX
Rattenniere (Rinde - Mark)
i)/F = ^F = 7,35 cm3
30'— 86,7
60'— 174,5
30—37,6
60'— 79
0,80
(co2)
-20,2
-17,1
0
X
Rattennetzhaut
ü'f = uf=7,35 cm3
30'— 10,3
60'— 21,6
30' -5,8
60' + 12
0,92
(Mittel von
C02 und
Milchsäure)
-10,5
-23,5
+ 13
Tab. 1. Zahlenwerte zu den Abb. 2
v = 23,34 cm3
und 3. 38°; 5 Vol.-Prozent. COo— O2. v' = 16,1 cm3;
. Je 10 mg Gewebe (Trockengewicht).
präpariert, sofort in homologes, mit l(+) Milchsäure angereichertes Serum, so
beträgt die aerobe Gärung nur 1/3 bis L/4 des Wertes, den wir früher in Ringer-
lösung gefunden haben; was wiederum dafür spricht, ebenso wie das Fehlen der
aeroben Gärung der Kaltblüter-Netzhaut, daß die aerobe Gärung der Warm-
blüternetzhaut ein „artefact" ist. Noch immer fehlt jedoch der entscheidende
Versuch, die Punktion der Vena ophthalmica.
Dagegen gehören die kernlosen roten Blutzellen3 nicht zu den Ausnahmen. In
den roten Blutzellen tritt die aerobe Gärung nur dann auf, wenn sie mit ihren
Kernen ihre Atmung verlieren; während die kernhaltigen roten Vogelblutzellen
im Kreislauf ihren Kern behalten und deshalb keine aerobe Gärung zeigen.
Methodische Anmerkungen
1. Für jeden Versuch waren etwa 35 cm3 Serum notwendig, nämlich 3mal 7 cm3 für die anaerobe
und die beiden aeroben Messungen und 2mal 7 cm3 für die Messung der Retention der Kohlen-
säure und der Milchsäure. Diese großen Mengen Mäuseserum erhält man leicht von Ascites-
Mäusen. Rattenserum wurde von normalen Ratten gewonnen. Der Ascites wurde ohne Zusatz
500 Manometrie der Körperzellen unter physiologischen Bedingungen
von Heparin entnommen und zentrifugiert. Das überstehende Serum wurde 10 Min. auf 57°
erhitzt und nochmals zentrifugiert. Es gerinnt nach dieser Behandlung nicht. Dem Rattenblut
wurde 0,05 mg Heparin pro cm3 zugesetzt. Dann wurde zentrifugiert, 10 Min. auf 57° erhitzt
und wieder zentrifugiert.
Ascites- Serum enthält fast keinen Zucker, aber etwa 2 mg l( — ) milchsaures Natrium pro cm3.
2 mg Glucose pro cm3 wurden immer zugesetzt. Dem Rattenserum, das nur wenig Milchsäure
enthält, wurden 2 mg l( — ) milchsaures Natrium pro cm3 zugesetzt, aber kein Zucker. Der Bi-
carbonatgehalt wurde auf etwa 350 mm3 Bicarbonatkohlensäure pro cm3 justiert
2. Die Retention4 wurde immer direkt für diejenige Menge Serum bestimmt, die im Versuch
angewandt wurde, in unserem Fall also für 7 cm3 Serum, in Kästchen von der gleichen Größe
wie die Versuchs-Gefäße. Bei der Bestimmung der Retention R der Kohlensäure wurde der ge-
wünschte CO^-Druck erzeugt, indem in einer siamesischen Birne Bicarbonat zu Schwefelsäure
gegeben wurde. Zur Bestimmung der Retention R der Milchsäure wurde Säure aus einer einfachen
Birne in den Hauptraum 'gegeben. Die Dimension von R ist , so daß
1 ' mm Brodie
kco\= kco2 + R
3. Ob eine atmende Zelle bei der manometrischen Anordnung positive oder negative Drucke
erzeugt, hängt von dem Wert und dem Vorzeichen von y ab, wie man erkennt, wenn man die
Formeln der 1 -Gefäßmethode betrachtet
*02 = H " Ko-2, [1]
„ &CQ2 ' kp2
*co2 + 7 ' &o2-
Ist y negativ und so groß, daß &co2 + y ' &o2 negativ wird, so wird Koz negativ und deshalb
H positiv, da die Atmung .vq2 immer negativ sein muß.
Literatur
1 Vgl. z. B. F. Roth, Z. Krebsforsch. 61 (1956), 287. Hoppe-Seylers. Z. physiol. Chem. 59 (1909), 112; 70
2 Warburg, O., Gawehn, K., und Geissler, A. W., diese (1910), 413. Warburg, O., Kubowitz, F., und Chri-
Z. IIb (1956), 657. stian, W., Biochem. Z. 242 (1931), 170.
3 Stoffwechsel der roten Blutzellen vgl. O. Warburg, 4 Warburg, O., diese Z. 9b (1954), 302.
60 Über die Wirkung von Wasserstoffperoxyd auf Krebszellen
und auf embryonale Zellen*
Von Otto Warburg, Karlfried Gawehn und August-Wilhelm Geissler
Die Manometrie der Körperzellen unter physiologischen Bedingungen zeigt, daß Krebszellen,
als partielle Anaerobier, viel weniger Katalase enthalten als embryonale Zellen. Die Möglichkeit
einer Anwendung auf die Wirkung der Röntgenstrahlen wird diskutiert.
Züchtet man Lactobazillen anaerob, so verlieren sie von der Kette der Atmungs-
fermente zunächst ihre Eisenfermente, Eisenoxygenase, Katalase, Peroxydase.
Bringt man solche Zellen in Berührung mit Sauerstoff, so übertragen sie Sauerstoff
mit ihren gelben Fermenten und produzieren dabei H2O2, das sie tötet. Setzt man
jedoch Katalase zu den Zellen, so wird das gebildete H2O2 schnell zerstört, und die
Zellen bleiben auch bei Berührung mit Sauerstoff am Leben1.
Krebszellen, als partielle Anaerobier, haben
ihre Eisenfermente z. T. verloren. Sie haben er-
heblich weniger Katalase als embryonale Zellen
und sind deshalb gegenüber Sauerstoff empfind-
licher als embryonale Zellen. Es ist eine Erfahrung
unseres Instituts, daß bei längeren manometri-
schen Versuchen mit Krebszellen der Sauerstoff-
druck nicht 1 Atmosphäre, sondern nur ljö At-
mosphäre betragen darf; während unter sonst
gleichen Bedingungen 1 Atmosphäre Sauerstoff
von den embryonalen Zellen ohne Schädigung
vertragen wird2.
Wir beschreiben im folgenden Versuche über
die verschiedene Empfindlichkeit von Krebszellen
und embryonalen Zellen gegenüber H2O2, die in
Serum mit der kürzlich beschriebenen mano-
metrischen Versuchsanordnung ausgeführt wur-
den3. Es zeigte sich, daß embryonale Zellen H2O2
viel schneller zersetzen als Krebszellen, anfangs
etwa lOmal so schnell, wenn die Temperatur 38°
beträgt. Ist die Anfangskonzentration des H2O2
1 200-normal (Abb. 1), so haben nach 60 Minuten
die embryonalen Zellen das H2O2 vollständig zer-
Minuten
Abb. 1. Zersetzung von n 2OO-H2O2
durch embryonale Zellen oder
Krebszellen. Beide Zellarten waren
in inaktiviertem Mäuse-Ascites-
Krebs-Serum suspendiert. Tempe-
ratur 38". Gasraum 5% COi-Luft.
Daten im Protokoll.
* Aus Zeitschrift für Naturforschung 12b (1957): 393.
Zusatz 1961. Dies war die Pionierarbeit auf dem Gebiet der selektiven Wirkung
der Röntgenstrahlen auf Krebszellen. Später (vergl. Beitrag 82) ist die Versuchs-
anordnung noch dadurch verbessert worden, daß wir auch als embryonale Zellen
Einzelzellen verwendeten, wodurch die Diffusionsverhältnisse für die Krebszellen
und die embryonalen Zellen gleichartiger gestaltet wurden.
502 Über die Wirkung von Wasserstoffperoxyd auf Krebszellen und auf embryonale Zellen
setzt, während die Krebszellen nur 30",, des berechneten Sauerstoffs entwickelt
haben. Der nicht entwickelte Sauerstoff ist dann zum größten Teil noch in der
Krebszellen-Suspension enthalten, wie man durch Titration mit Permanganat (nach
Trichloressigsäure-Fällung) oder durch Zusatz von Katalase nachweisen kann. Nur
ein kleiner Teil des zugesetzten H2O2 ist also durch Reaktion mit den Zellen ver-
braucht worden.
Dieser kleine Teil ist es, der in der 1 stündigen Versuchszeit den Stoffwechsel der
Krebszellen größtenteils vernichtet und der bewirkt, daß die Zellen nach der
1 stündigen Versuchszeit nicht mehr transplantierbar sind; während unter sonst
gleichen Bedingungen das H2O2 den embryonalen Zellen nicht zu schaden scheint,
da nach der 1 stündigen Versuchszeit der Stoffwechsel fast vollständig erhalten war.
Zum Beispiel bewirkte die Anfangskonzentration 1/1000-«. H2O2 nach 1 Stunde
bei 38° (in Ascitesserum), daß die folgenden Stoffwechselgrößen erhalten wurden:
Embryonale Zellen
ohne H2O2 + H2O2
Atmung Qoo = -15 Qo2 = -14
Aerobe Gärung Q%? = 0 Q%[ = 0
Anaerobe Gärung Öm = +24 Qm = ^24
Krebszellen
ohne H2O2 r H202
Atmung Qo2 = — 1 Q02 = - - 2
Aerobe Gärung Q%{ = 18 Q^1 = 0
Anaerobe Gärung Öm' = x^" Q M* = + ^
Es machte dabei keinen Unterschied, ob das nicht zersetzte H2O-2 aus der Krebs-
zellen-Suspension vor der Messung des Stoffwechsels mit Katalase entfernt war
oder nicht.
Obwohl die Krebszellen in vitro durch wenig H2O2 schnell getötet werden, kann
man durch Einspritzen von H2O2 in lebende Tumortiere, z. B. in die Bauchhöhle
von Asciteskrebs-Mäusen, therapeutisch nichts erreichen, da die Blutkatalase das
H2O2 zu schnell zersetzt4. Nur wenn man H2O2 kontinuierlich in den Zellen in vivo
erzeugen könnte, hätte man Aussicht auf Erfolg.
Anwendung auf die Wirkung der Röntgenstrahlen
Wie insbesondere Joseph Weiss5 gezeigt hat, erzeugen Röntgenstrahlen in wäßri-
gen Medien, also auch in lebenden Zellen, H2O2 durch Kombination der primär
gebildeten OH-Radikale oder durch Reduktion des molekularen Sauerstoffs durch
primär gebildete H-Atome. Die Idee, daß die Krebszellen gegen Röntgenstrahlen
deshalb empfindlicher sind als normale Zellen, weil sie weniger Katalase enthalten,
erhält durch den Versuch der Abb. 1 eine bemerkenswerte experimentelle Stütze.
Die Möglichkeit, Krebs durch Röntgenstrahlen zu heilen, wird so noch mehr als
bisher'5 zurückgeführt auf den biochemischen Unterschied zwischen Krebszellen
und embryonalen Zellen, d. h. auf die partielle Anaerobiose der Krebszellen.
Gegen die Idee spricht zunächst, daß die heilende Strahlendosis nicht diejenigen
Konzentrationen an Wasserstoffperoxyd erzeugt, die notwendig sind, um Krebs-
Über die Wirkung von Wasserstoffperoxyd auf Krebszellen und auf embryonale Zellen 503
Zeilen durch zugesetztes Wasserstoffperoxyd in vitro abzutöten. Doch muß man
bedenken, daß Wasserstoffperoxyd in statu nascendi (z. B. H02) in den Zellen viel
stärker wirken könnte als von außen zugesetztes Wasserstoffperoxyd ; und daß die
Katalase wahrscheinlich auch Wasserstoffperoxyd in statu nascendi zersetzt.
Für die Idee sprechen die Versuche von Crabtree und Cramer", die fanden,
daß Röntgenstrahlen auf Krebszellen aerob viel stärker wirken als anaerob ; und
daß die aerobe Strahlenwirkung durch Blausäure sehr erheblich verstärkt wird.
Diese Wirkung der Blausäure auf die Strahlenempfindlichkeit kann hier nur auf
der Inaktivierung der Katalase oder der Peroxydase beruhen, nicht aber auf der
Hemmung der Atmung, da Anaerobiose die Strahlenwirkung nicht steigert, son-
dern hemmt.
Versuchsanordnung
Zu den Vorschriften3 über die Manometrie der Körperzellen ist hier lediglich
hinzuzufügen, daß das aktive Ascitesserum besonders sorgfältig durch Waschen
mit inaktiviertem Serum entfernt werden muß, da aktives Serum Katalase ent-
halten kann. 10 Minuten Erhitzen auf 57° zerstört die Blutkatalase.
Protokoll
H-iO-i-Zersetzung durch Ascites-Krebszellen und durch Chorion der Maus
Ascites-KrebszeUen ( = 2mg Trockensubstanz) wurden zentrifugiert, 2mal mit inaktiviertem Ascites-
Serum (10' 57°) gewaschen und auf 3 cm3 mit inaktiviertem Ascites-Serum aufgefüllt.
Chorion von Mäuseembryonen wurde 2mal mit inaktiviertem Ascites-Serum gewaschen und
dann in 3 cm:! inaktiviertem Ascites-Serum suspendiert. Gewicht pro Gefäß 2,6 mg.
Anordnung: Glucose wurde nicht zugesetzt. Von der mit KMnCM titrierten H^Oü-Lösung
wurden 0,2 cm3 = 15,5 /iMole in die Ansatzbirne eines Manometriekegels gegeben, dessen
Hauptraum die Zellen, suspendiert in 3 cm3 inaktiviertem Ascites-Serum, enthielt. Der Gasraum
enthielt 5% CO-2-Luft. Die Temperatur war 38°. Die folgenden Druckänderungen wurden nach
Zugabe des H2O2 erhalten:
Chorion
Krebszellen
(Min.)
—
- H2O2
—
H2O2
(mm)
(mm)
(mm)
(mm)
2
0
+ 14
—0,5
0
4
0
40
+ 0,5
4,5
6
- 0,5
61,5
0
8,5
8
- 0,5
+ 76,5
0
+ 11,5
10
1,0
87,0
0,5
-13,5
15
- 2,5
103,5
-0,5
17,0
20
- 3,5
112,5
—2,0
21,0
30
- 5,5
120,0
-1,5
27,0
45
— 9,0
121,5
-4,0
33,5
60
-12,5
121,5
—6,0
37,0
Xo2 = 121,5 • 1,38 = 168 mm3
Xo2 == 37 • 1,39 == 51,5 mm3
= 7,5 11 Mole
= 2,3 f( Mole
Oj, während 15,5 /(Mole H2O2 = 7,75/<
O2, während 15,5 //Mole H2O2 = 7,75 m
Mole O2 zugegeben worden waren.
Mole O2 zugegeben worden waren.
Ausbeute an O2 = 97 Prozent.
Ausbeute an O2 = 30 Prozent.
Tab. 1. Beobachtete Druckänderungen bei Zusatz von H2O2
504
Über die Wirkung von Wasserstoffperoxyd auf Krebszellen und auf embryonale Zellen
Zur Messung des Stoffwechsels so vorbehandelter Zellen wurden 2 mg Glucose/cm3 zugesetzt
Milchsäure wurde zur Stoffwechselmessung nicht zugesetzt, da Asciteskrebs-Serum viel Milch-
säure enthält.
Literatur
1 Der Schutz der Anaerobier gegenüber Sauerstoff durch
Zusatz von Katalase ist 1924 im Rockefeller-Institute
in New York von O. T. Avery entdeckt worden [J. exp.
Medicine 39 (1924), 275, 347, 357]. Der chemische Me-
chanismus der HoO,-Bildung in den Anaerobiern
durch die Reoxydation der gelben Fermente ist 1933
in Dahlem entdeckt worden [Biochem. Z. 260 (1933>
499; 266 (1933), 377].
2 Vgl. dazu auch O. Warburg, Arch. Geschwulstforsch
6 (1953), 7.
3 Warburg, O., Gawehn, K., und Geissler, A., Z. Na-
turforschg. 12b (1957), 115.
4 Vgl. aber R. A. Holman, Nature (London) 179 (1957)
1033.
5 Weiss, J., Nature (London) 153 (1944), 748; vgl. auch
W. M. Dale, Nature (London) 151 (1943), 280.
6 Warburg, O., Science (Washington) 123 (1956), 309.
7 Crabtree, H. G., und Cramer, W., Imp. Cancer Res
Fund 10 (1932), 33, 95; 11 (1933), 75, 89, 103; vgl.
auch A. Forssberg, Nature (London) 159 (1947). 308;
L. H. Gray, Nature (London) 179 (1957), 991.
61 Über die Entstehung des Krebsstoffwechsels
in der Gewebekultur*
Von Otto Warburg, Karlfried Gawehn und August-Wilhelm Geissler
Unter den Bedingungen der „Monolayer Tissue Culture" in nicht bewegten Züchtungsfiaschen
entsteht in Nierenzellen aus dem normalen Stoffwechsel der Krebsstoffwechsel im Lauf einiger
Wochen. Diese Tatsache ändert unsere Auffassung von der Entstehung der Krebszellen wesentlich.
Da die Gewebekultur carcinogen ist1 und da man mit den neuen Methoden der
Gewebekultur physiologisch einheitliches Zellmaterial in beliebig großen Mengen
züchten kann, so ist es nunmehr möglich, den Stoffwechsel der bei der Gewebe-
kultur entstehenden Zellen mit der gleichen methodischen Sicherheit manome-
trisch zu messen wie etwa den Stoffwechsel der Hefezellen1.
Unser Ausgangsmaterial waren Kaninchen-Nieren, die durch Behandlung mit
Trypsin nach Dulbecco-Vogt in Einzelzellen aufgeteilt und dann nach einer Vor-
schrift von L. Grützner (Institut Robert Koch, Berlin) im Brutschrank gezüchtet
wurden. Direkt nach der Aufteilung in Einzelzellen wurde zunächst der normale
Nierenstoffwechsel gefunden, d. h. eine geringe anaerobe und gar keine aerobe
Gärung. Wurde dann im Brutschrank gezüchtet, so entwickelte sich — allmählich
— im Lauf von 1 bis 2 Wochen der typische Krebszellen-Stoffwechsel, d. h. eine
große anaerobe und eine erhebliche aerobe Gärung. Bei der Anlegung jeder Sub-
kultur schien diese Gärung wieder zu sinken und dann, wie bei der ersten Kultur,
wieder zu steigen.
Unsere bisherige Auffassung, daß die Gärung der Krebszellen im Lauf von Jah-
ren durch Selektion aus der latenten Gärungskomponente der normalen Zellen
entstehe, muß also dahin geändert werden, daß die große Gärung unter unnatür-
lichen Wachstumsbedingungen sehr schnell entstehen kann. Die lange Latenzzeit
bei der Krebsentstehung ist dann vielleicht die Zeit, in der ein zunächst reversibler
Gärungsanstieg irreversibel wird.
Gärung scheinbar normaler Zellen ist von uns bereits vor vielen Jahren2 in
Fibroblasten gefunden worden, die mit der alten CARREL-Methode gezüchtet wor-
den waren. Da beim normalen Wachstum im Körper eine solche Gärung nicht auf-
tritt, wäre es schon damals konsequent gewesen, zu schließen, daß die Gewebekultur
carcinogen ist. Doch war das nach Carrel gezüchtete Zellmaterial physiologisch
so uneinheitlich, und die Entstehung von Krebszellen aus normalen Zellen in vitro
war damals so unwahrscheinlich, daß es niemand wagen konnte, aus unsern
Messungen die Carcinogenität der Gewebekultur zu folgern.
1. Die Züchtung der Zellen
Nierenzellen von Kaninchen wurden nach einer Vorschrift von Dr. Liselotte
Grützner, Virusabteilung des Instituts Robert Koch in Berlin, gezüchtet. Die
Methode ist aus Methoden von Dulbecco und Vogt3 und von Youngner4 ent-
* Aus Zeitschrift für Naturforschung 13 b (1958): 61.
506 Über die Entstehung des Krebsstoffwechsels in der Gewebekultur
wickelt worden und wird von Frau Dr. Grützner folgendermaßen beschrieben5 :
„Die Gewebefragmente werden durch Vorbehandlung mit einer 0,25proz.Trypsin-
lösung in Einzelzellen zerlegt, die dann im flüssigen Nährmedium aufgeschwemmt
und in Flaschen einpipettiert werden. Sie nehmen Kontakt mit der Glaswand und
bilden auf dieser durch Vermehrung eine dichte Membran, die nach Behandlung
mit Versenlösung (0,02%) sich in eine Zellsuspension auflöst und als solche nach
Fortwaschen des Versens in neue Gefäße übertragen wird („Subkultur"), um hier
wieder zu einer gleichmäßigen Membran auszuwachsen. Versen hat sich als ober-
flächenentspannendes Mittel zur Auflösung von Zellmembranen in Einzelzellen
gut bewährt."
Als Züchtungsgefäße verwendeten wir Flaschen nach Roux von 1200 cm3 In-
halt, in die die Impfzellen, suspendiert in 70 cm3 Nährlösung, gegeben wurden.
Die Nährlösung war Hanksche Salzlösung6, der pro /lg Glucose, 5 g Lactalbu-
min-Hydrolysat der Firma Nordwald-Hamburg, 1 g Hefeextrakt der Firma Nord-
wald-Hamburg, 1,0 g Natriumbicarbonat und 20 cm3 inaktiviertes Kälberserum
zugesetzt worden waren. Der Gasraum der Züchtungsgefäße enthielt 5 Vol.-%
CO-2 und 95 Vol.-",, Luft. Die Züchtungsgefäße wurden im Brutschrank nicht be-
wegt.
2. Messung des Stoffwechsels
Der Stoffwechsel der Nierenzellen wurde manometrisch mit der 2-Gefäßmethode,
wie kürzlich beschrieben7, gemessen. Die Zellen wurden zu dem Zweck mit Salz-
Lösung, der 0,02' ',, Versen zugesetzt war, vom Glas abgelöst und in Einzelzellen
zerteilt, dann auf der Zentrifuge bei 650 g zentrifugiert, in Züchtungsmedium
(vgl. vorigen Abschnitt) oder in inaktiviertem Mäuse-Asciteskrebsserum suspen-
diert und in die Manometriegefäße pipettiert. L-(+)-Milchsäure wurde für die
Zwecke der Manometrie dem Züchtungsmedium (2 mg pro cm3) zugesetzt, wäh-
rend ein Zusatz von Milchsäure zu Ascitesserum, wegen des Eigengehalts an Milch-
säure, nicht notwendig war. Zuerst wurde immer der aerobe Stoffwechsel ge-
messen. Dann wurde 5 Vol.-% CO>-Luft durch 5 Vol.-% CO-2-Argon ersetzt, und
es wurde der anaerobe Stoffwechsel gemessen.
Die Temperatur bei der Messung war 37°. Die Volumina des Gefäßpaares
waren 16,10 cm3 und 23,34 cm3, das Volumen der eingefüllten Flüssigkeit betrug
7,15 cm3. Bei diesen Abmessungen erzeugen alle normalen Zellen, wachsende oder
nicht wachsende, außer der Retina, in beiden Gefäßen negative Drucke, während
die Krebszellen in beiden Gefäßen positive Drucke erzeugen7.
Negative Drucke in beiden Gefäßen erzeugen auch die normalen Leukocyten des Blutes, von
denen noch immer in der Literatur behauptet wird, daß sie „Krebsstoffwechsel" haben. Wir ver-
hindern die Gerinnung des Blutes mit Na3-Citrat, zentrifugieren die roten Blutzellen vorsichtig
heraus und bringen dann die Suspension der weißen Zellen, ohne sie zu zentrifugieren, in das Paar
der Manometriegefäße. Vogelblut ist besonders geeignet, da hier die Schwierigkeit der Abtren-
nung der Thrombocyten fortfällt. Die veralteten Methoden, die Zellen in „Krebs-Ringer" zu
suspendieren und bei der Manometrie Kalilauge im Einsatz zu verwenden (vgl. F. Seelich, Z. f.
Krebsforschung 62 [1952] l)sind gänzlich zu vermeiden, da man hierbei den Stoffwechsel bei dem
Kohlensäuredruck Null, also bei unphysiologischen Bedingungen, mißt.
Über die Entstehung des Krebsstoffwechsels in der Gewebekultur
507
3. Graphische Darstellung einiger Versuche
Abb. 1 soll zeigen, daß die anaerobe Gärung der Nierenzellen im Lauf von etwa
2 Wochen Gewebekultur von einem sehr niedrigen Wert auf den fast lOfachen
Wert steigt und mit O = + 35 einen Gärungswert erreicht, der für Tumorzellen
mittlerer Virulenz charakteristisch ist.
Abb. 2 soll zeigen, daß die Nierenzellen in dem Züchtungsmedium nach 0 Tagen
Kultur, so wie alle normalen Zellen, in beiden Gefäßen negative Drucke geben;
daß sie aber nach 16 Tagen Kultur, so wie Krebszellen, in beiden Gefäßen positive
Drucke geben. Die Umkehr des Vorzeichens der Drucke rührt daher, daß die
aerobe Gärung der frischen Nierenzellen 0 ist, während die aerobe Gärung 16
Tage kultivierter Nierenzellen den beträchtlichen Wert von +15 hat.
+ 160
+ V40
e +i2o
E +100
+ 80
+ 60
+ V0
+ 20
8 /
<
/
/
1 I
+ >40
w
20 30
HO 50
mm —
60
Abb. 1. Anaerobe Bedingungen. Je 10 mg
Zellen (trocken) pro Gefäß
A: Nierenzellen nach 0 Tagen Kultur,
Q
Argon
M
B: Nierenzellen nach 16 Tagen Kultur,
q Argon = 35
+20
1
E
■20
- W
■60
-80
-WO
-120
^>J0 20 30 10 50 60
n^"N-v,i min — *■
Gr Gefäß
Kl. Gefäß
Grßefaß
Kl. Gefäß
Abb. 2. Aerobe Bedingungen. Je 10 mg Zellen
(trocken) pro Gefäß. Negative Drucke:
Nierenzellen nach 0 Tagen Kultur. Q02 = —12
Q9.2 = 0, Positive Drucke: Nierenzellen nach
-M
16 Tagen Kultur. Qo2 =
-7Q&
15
Beide Abbildungen zeigen, daß die Änderung des Stoffwechsels der Nierenzellen
bei der Züchtung außerhalb des Körpers nicht geringfügig ist, sondern tiefgreifend
und außerhalb aller möglichen experimentellen Fehler.
4. Die Stoffwechselquotienten
Die Tab. 1 soll zeigen, daß sich die Stoffwechselquotienten bei der Züchtung in
kurzen Zeiten ändern; daß die aerobe Gärung für die aus dem Körper entnommenen
Zellen immer Null ist und nach wenigen Tagen auf beträchtliche Werte steigt und
daß die anaerobe Gärung der aus dem Körper entnommenen Zellen etwa 3 ist und
im Lauf der Züchtung auf Werte von 30, sogar 40 und 50 steigt.
Bildet man das Mittel aller Atmungswerte der frischen Zellen und das Mittel
aller Atmungswerte der kultivierten Zellen, so erhält man für die frischen Zellen
508
Über die Entstehung des Krebsstoffwechsels in der Gewebekultur
Kulturdauer
Atmung
Aerobe Gärung
Anaerobe Gärung
Kultur
(Tage)
[QoJ
[ß&]
[öMrgon]
A
0
11,4
0
+ 3,0
A
1
- 6,8
0
+ 3,0
A
1
- 8,1
0
+ 3,5
A
6
- 8,3
+ 4,8
+ 35,0
A
7
10,3
! 10
+ 46,0
A
10
—
—
+ 30,0
A
13
2,1
+ 9
I 17,0
A 1. Subkultur
4
8,1
+ 14
• 12,0
A 1. Subkultur
10
- 3,5
10
29,0
B Neue Kultur
0
11,5
0
4,7
B 1. Subkultur
6
7,0
+ 15,1
35,0
B 1. Subkultur
16
- 3,8
+ 22
56,0
B 2. Subkultur
7
7,4
10
28,0
C Neue Kultur
1
7,0
0
2,2
C
12
13
+ 10
-21,0
C
18
1
+ 8
31,0
C 1. Subkultur
6
4
+ 20
25,0
D Neue Kultur
0
11
0
3,5
E Neue Kultur
0
10
0
2,4
Tab. 1. Änderung des Stoffwechsels im Lauf der Zucht
<2oo = -11 und für die kultivierten Zellen <2o2 = 6,5. Man beachte ferner, daß
beim Übergang zu Subkulturen der Stoffwechsel zunächst wieder in der Richtung
des normalen zurückgeht, so daß also der Krebsstoffwechsel nach Wochen z. T.
noch reversibel zu sein scheint.
Über die Ursachen der Entstehung des Krebsstoffwechsels können wir noch
nichts sagen. Vielleicht spielt die chemische Zusammensetzung des Züchtungs-
mediums eine Rolle, vielleicht auch der niedrige Sauerstoffdruck, der sich in den
ruhenden Gefäßen innerhalb der Zellschicht herausbilden muß.
Literatur
1 Warburg, O., Science (Washington) 123 (1956), 309.
Addendum by Dean Burk.
2 Warburg, O., und Kubowitz, F., Biochem. Z. 189
(1927), 242.
3 Dulbecco, R., und Vogt, M., J. exp. Medicine 99
(1954), 167.
4 Youngner, J. S., Proc. Soc. exp. Biol. Med. 85 (1954),
202, 527.
5 Unveröffentlichtes Manuskript.
6 Hanks, J. H., Proc. Soc. exp. Biol. Med. 71 (1949), 196.
7 Warburg, O., Gawehn, K., und Geissler, A., Z. Na-
turforschg. IIb (1956), 657; 12b (1957), 115.
62 Stoffwechsel der weißen Blutkörperchen*
Von Otto Warburg, Karlfried Gawehn und August-Wilhelm Geissler
Der „Krebsstoffwechsel" der normalen weißen Blutzellen, der vielfach in der letzten Zeit, z. B.
von W. Remmele und F. Seelich1, gefunden wurde, ist ein Artefakt infolge mechanischer und
chemischer Schädigungen.
Da in den weißen Blutzellen, ähnlich wie in anderen normalen Körperzellen2,
aerobe Gärung durch Entkopplung der Atmung erzeugt wird, wenn man die
Zellen aus Blutplasma in Salzlösungen bringt, so darf bei der Manometrie der
weißen Blutzellen nur Plasma (das mit 2 bis 5 Vol.-% C02-Luft gesättigt ist) ver-
wendet werden. Es ist ferner bei der Gewinnung der weißen Blutzellen für mano-
metrische Versuche ein Zusammenzentrifugieren zu vermeiden, da die empfind-
lichen Zellen dabei mechanisch geschädigt werden. Es ist außerdem zu beachten,
gr. Gefäß Ja
kl. Gefäß IE
Abb. 1. Manometrie der weißen Blutzellen in
Serum für je 6,44 mg Zellen (Trocken-
gewicht). 38°. 5% CO-2-Luft. Kurven I:
Weiße Menschenblut-Zellen Qo2 —3,3;
Ü C, 768 mm Hg) = = 2,86",, N;
berechnet für C29 H23 O5N: C 74,9%, H 4,99%, N 3,05%.
Die Analysen wurden im Organisch-Chemischen Institut der Technischen
Universität Berlin von Frau Dr. Fahs ausgeführt.
3-Hydroxytyramin ist zuerst von H. Schmalfuss und A. Heider'2 aus Ginster
und von U. S. von Euler3 aus Säugetierharn isoliert worden.
In unserm Test fanden wir die folgenden Werte an 02-Verbrauch und H202-
Bildung im Licht, wenn 3-Hydroxytyramin oder Spinat-Hitzesaft zu gewaschenen
Spinatgrana zugesetzt wurde :
20°. Gasraum Luft. Versuchszeit 20 Minuten.
* Aus Zeitschrift für Naturforschung, September 1961.
584
3-Hydroxytyramin, ein biologischer Oxydationskatalysator der Photosynthese
3 cm3 mit Wasser gewaschene Chloroplastensuspensionen aus Neuseeländer
Spinat, die 1,3 mg Chlorophyll enthielten, wurden mit J = 36 Mikromolen
Quanten (weißes Licht) pro Minute belichtet. Die Suspensionsflüssigkeit enthielt
außerdem 100 uMole Phosph. pH 6,8 und 50
5 35
2.0
2.5
2ß
15
1.0
0.5
-
Lrj2>'
-
-
ff
-
-
-
/
n
~2°/oC02
s*J
'
1 1
5 10 75 20 25 30 35 ■ W V5 50 55 60
Min belichtet (0=800 cm m Quanten pro Minute) —
Zellen bestimmt, so wurde für die ersten 15 Minuten, wegen des Kohlensäure-
drucks, fast keine Glykolsäurebildung gefunden. War aber die Kohlensäure ver-
braucht, so setzte eine starke Glykolsäurebildung ein, bis etwa für 2 Moleküle der
verbrauchten Kohlensäure 1 Molekül Glykolsäure erschienen war; dann folgte eine
langsame Glykolsäurebildung, wahrscheinlich aus der Atmungskohlensäure
(Abb. 2).
Literatur
1 Warburg, O., und Burk, Dean, Arch. Biochemistry 25
(1950), 411.
2 Tolbert, N. E., J. biol. Chcmistry 222 (1956), 895.
3 Warburg, O., Krippahl, G., Gewitz, H. S., und Völ-
ker, W., Z. Naturforschg. 14b (1959), 712.
4 Warburg, O., Biochem. Z. 100 (1919), 230.
5 Warburg, O., und Krippahl, G, Z. Naturforschg. 14b
(1959), 561.
6 Eegriwe. E., Z. analytische Chemie 89 (1932), 123, so-
wie Feigl, Fritz, SpotTests, Elsevier, Amsterdam 1954.
55 Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese*
Von Otto Warburg, Günther Kkippahl, Hans-Siegfried Gewitz
und Wolfgang Völker**
O-2-Entwicklung im Licht durch Chinone in grünen Grana und in Chlorella, stöchiometrisch und
katalytisch. Entstehung von H2O2 bei den Chinonkatalysen. Lichtphosphorylierung. Gleichungen
der O-2-Entwicklung. Photosynthese.
Zu Chlorella1, die seit 1920 das Hauptversuchsobjekt der Photosynthese gewesen
ist, sind 1944 die grünen Grana2 der Spinat- und Rübenblätter als Versuchs-
objekte hinzugekommen. Alles Chlorophyll der grünen Zellen ist in den Grana
konzentriert. Sie haben den weiteren Vorzug, daß sie, anders als Chlorella, für
viele Salze durchlässig sind, z. B. für die Naphtochinonsulfosäuren und für die
Adenosinphosphorsäuren. Zwar haben die isolierten Grana nicht mehr die Fähig-
keit zur Photosynthese, aber setzt man ihnen Chinone'2 zu — Benzochinone oder
Naphtochinone — so können sie im Licht ebenso schnell O2 entwickeln wie intakte
grüne Zellen. Die Reaktionsgleichung lautet :
2 Chinon + 2 H20 = 2 Hydrochinon + 02, [1]
wobei die Grana in saurem Phosphat oder Bicarbonatpuffer suspendiert sind, unter
Zusatz von wenig Chlorid, das hier die noch unaufgeklärte Rolle eines Kofaktors
spielt.
Reaktion [1] ist in der Bilanz eine Zersetzung des Wassers durch Chinon. Es ist
im vorigen Jahr gefunden worden3, daß diese Zersetzung nicht vor sich gehen kann,
wenn alle Kohlensäure aus den Versuchsobjekten entfernt wird. Der notwendige
Halbwertdruck der Kohlensäure ist gleich etwa 10 mm Wasser. Bei einem Kohlen-
säuredruck von 1 mm Wasser ist eine (^-Entwicklung durch Chinon kaum mehr
nachweisbar. Dies war ein unerwartetes Resultat, da die Grana bei noch so hohen
Kohlensäuredrucken in der Bilanz keine Kohlensäure verbrauchen. Kohlensäure
muß also hier katalytisch wirken, das heißt, jede Reaktion, die sie eingeht, muß
immer wieder rückgängig gemacht werden. Versucht man, diese katalytische Wir-
kung der Kohlensäure durch Zwischenreaktionen zu erklären, so ist vorauszu-
schicken, daß der 0> sich aus einem Peroxyd entwickeln muß, welche Zwischenreak-
tionen man auch annehmen mag. Denn eine Entwicklung von atomarem Sauerstoff
ist aus chemischen und energetischen Gründen auszuschließen. Chinon muß also
hier ein Peroxyd erzeugen. Betrachtet man als Modell die technische Erzeugung
der dimeren Perkohlensäure durch Dehydrierung, so sind die folgenden Zwischen-
reaktionen naheliegend :
* Zeitschrift für Naturforschung 14b (1959): 711.
* Zusatz 1961. Das wesentliche Ergebnis dieser Arbeit ist die Entdeckung,
daß bei der photochemischen Oo-Entwicklung aus Grana oder Chlorella H2O2
entsteht, und zwar 2 Moleküle H2O2, wenn 1 Molekül Oi entwickelt wird. Diese
HoO^-Bildung, die die stöchiometrische Beteiligung eines Oxydans an der photo-
chemischen 0L>-Entwicklung beweist, wird ohne Zusatz eines Oxydans gefunden,
aber nach Zusatz von Chinonen verstärkt gefunden.
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese 463
Chinon + CO> - 2 H-20 == Hydrochinon -f OHCOOOH-
OHCOOOH = HCOOH + 02
Chinon - HCOOH = Hydrochinon CO2
Bilanz : 2 Chinon - 2 U20 = 2 Hydrochinon + 02
Hier oxydiert also das Chinon die Kohlensäure zu einem monomeren Kohlen-
säureperoxyd, das dann unter Abspaltung von molekularem Sauerstoff zur Stufe
der Ameisensäure reduziert wird. Die Stufe der Ameisensäure aber reagiert in
statu nascendi mit Chinon zu Kohlensäure zurück und verschwindet damit aus der
Bilanz.
Dabei müssen alle Zwischenprodukte mit dem Chlorophyll verbunden sein, da
nur bei Bindung an das Chlorophyll gute Energieausbeuten möglich sind. Keines-
falls finden die Reaktionen in Lösung statt. Denn sie werden durch «/1000-Phenyl-
urethan vollständig narkotisch gehemmt.
Eine Alternative wäre die Theorie, daß das Chinon nicht die Kohlensäure, son-
dern das Wasser oxydierte. Dann wäre das entstehende Peroxyd das Peroxyd des
Wassers, also H202, und 02 würde durch die Katalase aus dem Peroxyd des
Wassers entwickelt: 2 Chinon + 4 H.20 = 2 Hydrochinon + 2 H2Oa
2 H0O2 = 2 HoQ - Ol
Bilanz : 2 Chinon - 2 H20 = 2 Hydrochinon - O2
Auch auf diesem Weg gelangt man also zu der im Experiment gefundenen
Bilanz.
Für beide Alternativen gibt es Gründe und Gegengründe. Auf dem Weg über
das Peroxyd der Kohlensäure würde die Kohlensäure bereits bei der Entwicklung
des 02 reduziert. Auf dem Weg über das Peroxyd des Wassers wäre die Reduktion
der Kohlensäure eine sekundäre Dunkelreaktion. Der Weg über das Peroxyd der
Kohlensäure ist also der einfachere und deshalb a priori der wahrscheinlichere.
Er ist aus Versuchsgründen der wahrscheinlichere, weil die Chinonreaktionen,
damit sie ablaufen können, einen Kohlensäuredruck benötigen. Gegen den Weg
über das Peroxyd des Wassers spricht, daß die Katalase auf diesem Weg vor-
kommt, ein Ferment, das durch Blausäure gehemmt wird, während, wie wir
vorausgreifend erwähnen möchten, die Entwicklung des 02 bei den Chinon-
reaktionen durch Blausäure nicht gehemmt wird. — Eine Entscheidung dieser
Alternative wäre von großer Bedeutung, wäre damit doch die Frage beantwortet,
ob die Photosynthese eine Photolyse der Kohlensäure oder eine Photolyse des
Wassers ist.
I. Katalysen des Chinons
Wenn bei den Chinonreaktionen das Chinon zu Hydrochinon reduziert und 02
entwickelt wird, so erhält man die stöchiometrische Beziehung der Gl. [1], nach der
2 Moleküle Chinon 1 Molekül 02 entwickeln. Bedingung dafür ist eine so saure
Reaktion, daß 02 und Hydrochinon nicht zurückreagieren. Wichtiger jedoch, we-
gen der Anwendungen auf die Photosynthese in lebenden Zellen, sind die Be-
dingungen, unter denen 02 und Hydrochinon zurückreagieren, also Bedingungen,
unter denen das Chinon katalytisch wirkt.
464 Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
Um von den stöchiometrischen zu den katalytischen Chinonreaktionen über-
zugehen, hat man nur nötig, den pH-Wert der Medien, in denen die Grana sus-
pendiert sind, von 6,5 auf 8 zu bringen. Dann folgt auf die Entwicklung des 02 die
Rückreaktion des 02 und man erhält die Gleichungen :
2 Chinon + 2 H20 = 2 Hydrochinon + 02
2 Hydrochinon + Q2 = 2 Chinon + 2 H20
Bilanz: 0 = 0
Nunmehr wird also alles, was geschieht, wieder rückgängig gemacht, auch das
Chinon und der O2 fallen aus der Bilanz heraus, und die Bilanz wird Null. Als man
später fand, daß Phosphat in diesen Granasuspensionen gebunden wird, sah es
zunächst so aus, als ob die Phosphatbindung das einzige sei, was chemisch im
Licht geschah, ein Irrtum, dem der Name „Lichtphosphorylierung" seine Ent-
stehung verdankt. In Wirklichkeit liegt hier nichts anderes vor als etwas, das man
bei photochemischen Reaktionen sehr häufig findet : ein stationärer Zustand zwi-
schen Hinreaktion und Rückreaktion, zwischen Lichtreaktion und Dunkelreaktion.
Untersucht man die Reoxydation des Hydrochinons näher, so zeigt sich, daß es
zwei Arten von Reoxydation gibt; eine fermentative Reoxydation durch das Kupfer
einer Phenoloxydase und eine direkte chemische Autoxydation. Beide Arten von
Reoxydation unterscheiden sich wesentlich. Die fermentative Reoxydation bei der
wahrscheinlich das notwendige Orthochinon die Dehydro-Chlorogensäure ist,
also: 02— Cu^Chlorogensäure —Hydrochinon [vgl. dazu Zitat 2], geht bereits bei
niedrigen 02-Drucken schnell vor sich, die Autoxydation geht schnell nur bei
höheren 02-Drucken vor sich. Die fermentative Reoxydation wird durch Blausäure
gehemmt, die Autoxydation wird durch Blausäure nicht gehemmt. Bei der fer-
mentativen Reoxydation bildet sich kein H202, bei der Autoxydation bildet sich
quantitative H202 nach der Gleichung :
2 Hydrochinon + 2 O2 = 2 Chinon + 2 H202
II. Blausäure*
Von den beiden Reaktionen des 02 im Verlauf der Chinonkatalysen, der Ent-
wicklung des 02 und der Rückreaktion des 02, wird, wie erwähnt, die fermentative
Rückreaktion des 02 durch Blausäure gehemmt. Die Hinreaktion des 02 jedoch
wird merkwürdigerweise durch Blausäure nicht gehemmt. Dies kann man zeigen,
indem man zu den stöchiometrischen Chinonreaktionen bei pH 6,5 Blausäure gibt,
also unter Bedingungen, unter denen eine Rückreaktion des 02 nicht stattfindet.
Man findet dann, daß die 02-Entwicklung durch «/100-Blausäure gar nicht, durch
w/10-Blausäure nur wenig gehemmt wird.
Da nun zwar die Hinreaktion des 02 durch Blausäure nicht gehemmt wird, da
aber die fermentative Rückreaktion des 02 durch Blausäure gehemmt wird, so
wird die Chinon-Katalyse bei niedrigen 02-Drucken immer durch Blausäure ge-
hemmt werden. Steigert man aber den 02-Druck so weit, daß die autoxydative
Rückreaktion des 02 schnell genug verläuft, so sind jetzt sowohl die Hinreaktion
des O2 als auch die Rückreaktion des 02 ungehemmt, und man hat in w/100-Blau-
* Die Reaktion des Chinons mit Blausäure zu Dicyanhydrochinon verläuft so langsam, daß sie
hier nicht störte.
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
465
säure die volle Chinonkatalyse. Der einzige Unterschied gegenüber der normalen
Chinonkatalyse ist dann, daß bei der Rückreaktion des O2 an Stelle des Wassers
H2O2 entsteht, da Blausäure die Katalase der Grana hemmt. Die Gleichungen der
Chinonkatalysen in n/100-Blausäure sind also:
2 Chinon + 2 H20 = 2 Hydrochinon + O2
2 Hydrochinon - 2 02 = 2 Chinon 2 H202
Bilanz: 2 H20 - 02 == 2 H202
Die Bilanz ist also nunmehr nicht mehr Null, sondern in der Bilanz wird O2
verbraucht und es erscheint H2O2. Manometrisch wirkt sich dies so aus, daß bei
Zusatz von Blausäure die Druckänderungen von Null in starke negative Druck-
änderungen umschlagen.
Man beachte, daß hier das Verhältnis H2O2/O2 nicht gleich 1 ist, wie es bei einer
einfachen Autoxydation sein sollte, sondern das Verhältnis H2O2/O2 ist gleich 2.
Man erhält also im Vergleich zum verbrauchten O2 zuviel H2O2 und zwar 100%
zuviel. Der Grund ist aus unsern Gleichungen ersichtlich : immer wenn 2 Mole-
küle O2 in der Autoxydation verbraucht werden, wird 1 Molekül O2 entgegenent-
wickelt.
Da das Verhältnis H2O2/O2 bei unseren Anwendungen der Chinonkatalysen auf
die Photosynthese eine Rolle spielen wird, habe ich die Versuche in einer Tabelle
(Tab. 1) zusammengestellt, aus der hervorgeht, wie groß die Stoffumsätze sind und
wie genau das Verhältnis H2O2/O2 bestimmt werden kann.
Nr.
Puffer
Versuchszeit
o2
H2O2
H202
O2
(pH 8,3)
(Min.)
(/(Mole)
(//Mole)
1
«/100-NaHCO3-CO2
20
-6,2
+ 12,5
2,04
2
55
20
-7,9
+ 17
2,16
3
w/30-Phosphat
50
-7,2
+ 13
1,80
4
53
50
-5,6
11
1,96
5
Tris
35
-6,7
+ 13
1,94
6
»/100-NaHCO3-CO2
35
-8,2
- 15,7
1,92
Mittel 1,97
Tab. 1. 02-Verbrauch und H202-Entwicklung in Grana (~ 1 //Mol Chlorophyll) in Luft, in n 100-
HCN, bei Zusatz von 0,5 bis 1 //Mol Benzochinon oder /i-Naphtochinonsulfosäure. pH 8,3. Einge-
strahlter Energiestrom ~ 36 //Mol Quanten pro Minute.
III. „Lichtphosphorylierung"
Setzt man den grünen Grana, die nach unseren Vorschriften von 1944 gewonnen
und in Phosphatlösungen bei pH 8 suspendiert sind, Adenosindiphosphat zu und
belichtet, so verschwindet, wie Arnon4 gefunden hat, Phosphorsäure, und es er-
scheint Adenosintriphosphat.
Bei einer Untersuchung dieser „Lichtphosphorylierung" haben wir festgestellt,
daß alles, was die Chinonkatalysen hemmt, auch die Lichtphosphorylierung
hemmt. n'lOOOO-Phenanthrolin hemmt die Chinonkatalysen und hemmt auch die
Lichtphosphorylierung. n 100-Blausäure hemmt bei niedrigen Oj-Drucken die
30 Warburg, Zellphysiologie
466 Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
Chinonkatalysen und hemmt auch die Lichtphosphorylierung. Aber «/100-Blau-
säure hemmt bei hohen Oj-Drucken die Chinonkatalysen nicht oder wenig und
hemmt auch die Lichtphosphorylierung nicht oder nur wenig. Dieses sehr spezi-
fische Verhalten gegenüber Blausäure in beiden Fällen beweist den Zusammen-
hang zwischen dem Ablauf der Chinonkatalysen und der Lichtphosphorylierung
über allen Zweifel.
Es scheint fast ein Widerspruch zu sein, daß trotzdem die Bindung der Phosphor-
säure an ADP keinen Einfluß auf die Chinonkatalysen hat. Tatsächlich ist die
Geschwindigkeit der O-2-Entwicklung durch Chinon die gleiche, ob man den
Chinonkatalysen ADP zusetzt oder nicht, vorausgesetzt, daß freies Phosphat im
Überschuß vorhanden ist. Die Erklärung ist, daß die Chinonreaktionen immer und
unter allen Umständen Phosphat binden. Setzt man kein ADP zu, so wird das
gebundene Phosphat bei der (^-Entwicklung wieder frei, die Phosphorsäure bleibt
in der Bilanz konstant und hat also die Funktion eines Katalysators. Setzt man
ADP zu, so fängt das ADP das gebundene Phosphat ab und in der Bilanz wird
Phosphorsäure verbraucht.
Wenn nun ADP, das bei den Chinonreaktionen gebundene Phosphat quanti-
tativ abfängt, so kann man mit Hilfe von ADP messen, wieviel Phosphat bei den
Chinonreaktionen gebunden wird. Um den dabei stattfindenden Chinonumsatz zu
messen, schalten wir mit Blausäure auf die autoxydative Katalyse um und messen
durch das H20> den Chinonumsatz bei der Phosphatbindung.
Wir fanden, daß 1 Molekül Phosphorsäure gebunden wird, wenn 1 Molekül
H202 erscheint; oder anders ausgedrückt, daß 1 Molekül Phosphorsäure gebunden
wird, wenn 1 Molekül Chinon 2 H-Atome aufnimmt. Dies ist dasselbe Verhältnis
zwischen Phosphatbindung und Dehydrierung, das wir früher bei der Oxydations-
reaktion5 der Gärung gefunden haben, in dem bisher einzigen chemisch aufgeklär-
ten Phosphorylierungs-Mechanismus. Die Energetik der Lichtphosphorylierung
ist damit auf die Energetik der Dunkelphosphorylierungen zurückgeführt.
Welche Substanz aber ist es, die bei den Chinonreaktionen das Phosphat bindet ?
Die Antwort hängt davon ab, ob man bei den Chinonreaktionen denWeg über die
Photolyse der Kohlensäure oder den Weg über die Photolyse des Wassers an-
nimmt. Im ersten Fall wäre das Zwischenprodukt vielleicht ein phosphoryliertes
Peroxyd der Kohlensäure, im zweiten Fall wäre es ein phosphoryliertes Wasser-
stoffperoxyd, eine Substanz, die man auch „Perphosphorsäure" nennen kann. Die
Gleichungen für diese beiden Wege wären :
Weg über die Photolyse der Kohlensäure
Chinon - C02 + H20 H3PO4 == Hydrochinon H2PO3 — O — COOOH
H0PO3 — O — COOOH - H20 == H3PO4 -- Oz HCOOH
Chinon - HCOOH = Hydrochinon - C02
Bilanz: 2 Chinon - 2 H20 == 2 Hydrochinon - O2
Weg über die Photolyse des Wassers
2 Chinon 2 H3PO4 H- 2 H20 == 2 Hydrochinon - 2 H3PO5
2 H3PO5 == 2 H3PO4 - 02
Bilanz: 2 Chinon + 2 H20 == 2 Hydrochinon H- 02,
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese 467
wo man vielleicht an Stelle von 2 H3PO5 die Per-Pyrophosphorsäure H4P2O9 ein-
setzen könnte, da die beiden O-Atome aus einem Peroxydmolekül entwickelt
werden müssen.
IV. Chlorella
Wir wollen uns nunmehr fragen, ob es Anhaltspunkte dafür gibt, daß die (^-Ent-
wicklung bei der Photosynthese chemisch verwandt ist mit der 02-Entwicklung
durch Chinon.
Zunächst ist hier an die von Dam6 in grünen Zellen entdeckten Naphtochinone,
an die K- Vitamine, zu erinnern: dann an die kürzlich von Morton7 und von O.
Wiss8 und Mitarbeitern untersuchten Ubichinone, die Benzochinone sind; und
nicht zuletzt an die Arbeiten von Martius9, nach denen Naphtochinone, gebun-
den an Protein, Fermente der oxydativen Phosphorylierung sind.
Auf der Suche nach einem entscheidenden Experiment haben wir die Grana
verlassen und sind zu Chlorella als Versuchsobjekt übergegangen. Da nach unseren
Erfahrungen die Chinonkatalysen der Grana am besten durch die H-iO-i-Bildung
in Blausäure nachgewiesen werden können, prüften wir, ob Chlorella, ohne Zusatz
von Chinon, unter den gleichen Bedingungen H2O2 ausscheidet.
Chlorella, ohne Zusatz von Chinon, wurde in kohlensäurehaltiger Luft belichtet,
zunächst ohne Zusatz von Blausäure, wobei in der bekannten manometrischen
Anordnung die normale Photosynthese die positiven Drucke erzeugte. Wurde
dann Blausäure bis zu n/100 zugesetzt, so wurde die Photosynthese vollständig
gehemmt und die Druckänderungen im Licht wurden Null. H2O2 erschien nicht.
Wurde jedoch der CVDruck bei der Belichtung von 1/g Atmosphäre auf eine ganze
Atmosphäre erhöht, so traten erhebliche negative Drucke auf, und es erschien in
der Außenflüssigkeit H2O2. Im Dunkeln erschien kein H2O2, w/10000-Phenan-
throlin hemmte die FLC^-Bildung vollständig. Wurde neben dem H2O2 auch der
verbrauchte O2 gemessen, so ergab sich das Verhältnis H2O2/O2 nicht gleich 1, wie
es bei einer einfachen Autoxydation sein müßte, sondern das Verhältnis H2O2/O2
ergab sich gleich 2. Alles dies bedeutet, daß die für die Chinonkatalysen in Grana
gefundenen Gleichungen auch für Chlorella, der kein Chinon zugesetzt ist, gelten,
mit dem Unterschied, daß wir das Oxydans hier nicht Chinon nennen dürfen, da
wir ja kein Chinon zugesetzt haben. Nennen wir das Oxydans F, um anzudeuten,
daß es ein Ferment sein könnte, so lauten also die Gleichungen, auf Chlorella
angewandt: 2 F + 2 HaO = 2 FH2 + 02
2 FH-2 + 2Qq = 2F + 2 H2O-2
Bilanz: 2 H20 + 02 = 2 H2Oo
Chlorella enthält also einen natürlichen Katalysator, der im Licht reduziert wird
und dabei ö> entwickelt; der in einer Dunkelreaktion immer wieder reoxydiert
wird; und der sich in weiteren sehr speziellen Reaktionen ebenso verhält wie
Chinon, das man zu Grana oder Chlorella zusetzt*.
* Es ist bemerkenswert, daß die Chinone viel schneller reagieren als die Pyridin- und Alloxazin-
Nukleotide, die also keine Zwischenprodukte der Chinonreaktionen sein können. Sehr schnell
reagiert Chinon mit Ascorbinsäure. Aber dieser Chinon-Anteil ist für die photochemische O2-
Entwicklung verloren.
468
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
Es soll dabei nicht vergessen werden, daß die Chinonreaktionen ihrerseits Metall-
katalysen sind; daß die Hinreaktion des O2 eine Katalyse durch das unbekannte
Schwermetall ist, das durch w/10000-Phenanthrolin inaktiviert, aber durch
w/100-Blausäure nicht inaktiviert wird; daß die fermentative Rückreaktion des O2
eine Katalyse durch das Kupfer einer Phenoloxydase ist; während es noch zweifel-
haft ist, ob ein drittes Schwermetall, das Eisen der in grünen Zellen und Grana
sehr aktiven Katalase, bei den Chinonreaktionen eine Rolle spielt.
Wegen ihrer Bedeutung habe ich die Versuche in einer Tabelle zusammen-
gestellt, in denen, nach Festlegung der optimalen Bedingungen, das Verhältnis
H2O2/O2 bestimmt worden ist. Wie man aus der Tab. 2 sieht, waren die Stoff-
umsätze so groß, daß das Verhältnis H2O2/O2 mit hinreichender Genauigkeit be-
stimmt werden konnte.
02
H2O2
H2O2
Nr.
[//Mole]
[/(Mole]
02
1
— 1,32
+ 2,40
1,82
2
— 1,26
+ 2,60
2,04
3
- 1,97
+ 4,95
2,50
4
— 2,04
+ 4,12
2,02
5
- 1,36
+ 2,72
2,00
6
-2,14
+ 4,12
1,92
Mittel-
- 1,68
+ 3,48
2,06
werte
- 38 mm3 O2
+ 78 mm3 O2
Tab. 2. Oi-Verbrauch und H^Oj-Entwicklung in 100 mm3 Chlorella pro Stde., in »/100-HCN,
in 20 Vol.-",, CO2— O2. pH 4. Eingestrahlter Energiestrom 36 //Mole Quanten pro Minute.
V. Photosynthese
Es bleibt noch das Problem, die Verbindung herzustellen von der 02-Entwicklung
im Licht zu dem Vorgang, welcher der Sinn der Photosynthese ist, zur Fixierung des
Kohlenstoffs. Bei keinem der Versuche, die wir beschrieben haben, ist Kohlenstoff
fixiert worden. War dies ein zufälliges Resultat oder hatte es eine innere Ursache ?
Zur Beantwortung dieser Frage haben wir eine Methode entwickelt10, mit der
Änderungen des Partialdrucks der Kohlensäure in einem Manometriegefäß ge-
nauer als bisher bestimmt werden können (Abb. 1). Es befand sich im Hauptraum
die Grana- oder Zellsuspension, in Birne I überschüssige Schwefelsäure, in der
Wanne Kaliumpermanganat, in der mit der Wanne verbundenen Birne Kalium-
ferrocyanid, im Gasraum 2 Vol.-",, Kohlensäure in Argon oder Sauerstoff.
Gibt man Schwefelsäure in den Hauptraum, so wird Kohlensäure aus etwa vor-
handenem Bicarbonat in Freiheit gesetzt. Gibt man das Ferrocyanid in das
Kaliumpermanganat, so wird die vorher neutrale Reaktion in der Wanne alkalisch
und die im Gefäß befindliche Kohlensäure wird schnell absorbiert. So erhält man
den Partialdruck der gesamten Kohlensäure im Manometriegefäß zu den Zeiten
to und t, und jede Abnahme dieses Partialdrucks im Licht würde Fixierung des
Kohlenstoffs bedeuten. Trotz vieler Variationen fanden wir, daß die (^-Entwick-
lung im Licht durch Chinon in keinem Fall von einer Änderung des Partialdrucks
der Kohlensäure begleitet war.
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
469
Die Ursache der Nichtfixierung ist nichts anderes als das Fehlen der Atmung.
Grana atmen nicht und fixieren nicht. Chlorella, der Chinon zugesetzt ist, atmet
nicht und fixiert nicht. Chlorella nach Behandlung mit n/100-Blausäure im Dun-
keln atmet und fixiert, aber Chlorella nach Behandlung mit w/100-Blausäure im
Abb. 1.
Manometriegefäß zur
Bestimmung des Kohlen-
säure-Partialdrucks.
Licht, atmet nicht und fixiert nicht. Sie atmet nicht, weil im Licht FLO2 entsteht,
das die Atmung vernichtet.
Durch sehr viele derartige Versuche ist die Regel* „Keine Fixierung ohne
Atmung" gefunden worden. Zwar kann man unsere Gleichungen der Kohlen-
säure-Photolyse leicht so ändern, daß Kohlenstoff fixiert wird, einfach, indem man
die Peroxydbildung durch Chinon auf der Ameisenstufe sich wiederholen läßt.
Aber dann kommt man mit der fundamentalsten Tatsache der Photosynthese in
Konflikt, daß 1 Lichtquantum 1 Molekül O2 entwickelt; und erst wenn man die
lichtinduzierte Atmung hinzuschreibt und ihre Energie für die 1 Quantenreaktion
ausnutzt, wird die Fixierung energetisch möglich.
So wächst unablässig die Evidenz, daß die Atmung zum chemischen Mechanis-
mus der Photosynthese gehört. Die Entdeckung der lichtinduzierten Atmung
durch Dean Burk und Warburg im Jahr 1950 hier in Dahlem war das erste und
* Versuche, in denen wir (vgl. diese Z. 13b, 509 [1958]) Fixierung ohne Atmung zu finden glaub-
ten, haben sich bisher immer als irrtümlich erwiesen.
470 Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
wichtigste Experiment11. Es folgte 1958 die Arbeit von Krippahl12, nach der im
Gebiet sehr niedriger O-2-Drucke die Atmung und die Photosynthese in gleichem
Maße absinken. Es folgte 1959 eine Arbeit von Kayser13, nach der in den grünen
Keimblättern der Gerste, in denen die Kohlenoxydhemmung im Lauf von 14
Tagen verschwindet, in jeder Phase des Verschwindens Atmung und Photosyn-
these um den gleichen Betrag gehemmt werden. Es folgt heute die Hemmung der
Fixierung des Kohlenstoffs durch atmungshemmende Dosen von Chinon; und —
besonders beweisend — die Fixierung oder Nichtfixierung des Kohlenstoffs je
nach Vorbehandlung der Chlorella mit w/100-Blausäure: Fixierung nach Vorbe-
handlung mit Blausäure im Dunkeln, wobei die Atmung intakt bleibt ; und Nicht-
fixierung nach 1 stündiger Vorbehandlung der Chlorella mit Blausäure im Licht,
wobei die Atmung vernichtet wird.
Versuchsteil
Als Versuchsobjekte wurden Grana oder „Broken Chloroplasts" oder Chlorella
benutzt.
Granu. Die Grana wurden aus Blättern von Freilandspinat nach den Vorschriften von 1944 gewon-
nen2, und unter Zusatz von Cl-Ionen, die hier die Funktion eines Kofaktors haben, belichtet. Die
Suspensionsmedien waren entweder ;;?/30-Phosphat oder w/10-Bicarbonat mit Kohlensäure im
Gasraum; pH wurde von 4,3 bis 8 variiert. Sollte auch die Lichtphosphorylierung untersucht wer-
den, so wurden ADP und MgCk zugesetzt. Oxydantien waren wie 1944 Benzochinon, ß-Naphto-
chinonsulfosäure und Ferricyanid. Wegen ihrer Fähigkeit zur Autoxydation sind die Chinone die
physiologisch interessanteren Oxydantien.
Wir unterscheiden stöchiometrische und katalytische Versuche. Bei den stöchiometrischen Ver-
suchen mit Grana war pH etwa 6,7, ein pH, bei dem der O-i die Hydrochinone nicht reoxydiert. 2
Moleküle Chinon entwickelten dann 1 Molekül Sauerstoff. Bei den katalytischen Versuchen mit
Grana war pH etwa 8, ein pH, bei dem der Oj die Hydrochinone reoxydiert. Bei den katalytischen
Versuchen war die zugesetzte Chinonmenge etwa 1 //Mol Chinon pro //Mol Grana-Chlorophyll. Bei
den stöchiometrischen Versuchen war die zugesetzte Menge Chinon 10 bis 20 //Mole Chinon pro
,»Mol Grana-Chlorophyll.
Die stöchiometrische Versuchsanordnung ist die einfachere, weil man es hierbei nur mit der
Entwicklung des O2, mit der Hinreaktion der Katalyse zu tun hat. Die verschiedenartigsten Grana
geben dabei schnelle (^-Entwicklungen, z. B. Grana aus Freilandspinat, aus Neuseeländer Ge-
wächshausspinat, aus Mangold, Zuckerrüben, Futterrüben, Kohlrabi, Salat und so weiter.
Komplizierter ist die katalytische Versuchsanordnung, weil hier zu der Hinreaktion die Rück-
reaktion des O2 hinzukommt. Noch komplizierter ist die Versuchsanordnung mit Phosphorylierung,
weil hier zu den Chinonreaktionen die Transphosphorylierungs-Reaktionen hinzukommen. In
der Tat kann Phosphorylierung nur gefunden werden, wenn die Transphosphorylasen nicht aus
den Grana ausgewaschen sind, während diejenigen Fermente, die das Adenosintriphosphat spalten,
entfernt sein müssen. So kommt es, daß viele Granaarten, die zur Untersuchung der Chinon-
reaktionen geeignet sind, zur Untersuchung der Phosphorylierung ungeeignet sind. Allen Anforde-
rungen genügten die Grana aus Freilandspinat, also diejenigen Grana, die 1944 bei der Entdeckung
der Granareaktionen die Versuchsobjekte gewesen sind. Neuere Vorschriften zur Gewinnung dieser
Grana und die komplizierten Medien, die zur Untersuchung der Lichtphosphorylierung empfohlen
wurden, sind nach unseren Erfahrungen keine Verbesserungen, sondern eher Verschlechterungen
gegenüber 1944.
„Broken Chloroplasts". Fraktioniert man nach unseren Vorschriften die Granasuspensionen auf der
Zentrifuge, so werden die schwereren Fraktionen neuerdings als „Broken Chloroplasts" bezeichnet.
In diesen Fraktionen ist das Ferment der Rückreaktion des Hydrochinons, die Phenoloxydase,
wirksamer als in den leichteren Fraktionen. Die Folge davon ist, daß zur Reoxydation des Hydro-
chinons ein niedrigerer Ü2-Druck genügt, so daß man bei der Manometrie in Argon und in Luft die
gleiche Lichtphosphorylierung findet ; während die leichteren Granafraktionen in Argon schlechter
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese 471
phosphorylieren als in Luft. Die Folge davon ist, daß die schweren und leichten Grana-Fraktionen
sich in Blausäure bei Variationen des O^-Drucks etwas verschieden verhalten.
Chlorella. Chlorella hat als Objekt zur Untersuchung der Chinonreaktionen den Nachteil, daß sie
impermeabel für viele Salze ist, z. B. für Naphtochinonsulfosäuren und für die Adenosinphosphate.
Da auch die Atmung der Chlorella hier eine Komplikation ist, so sind die nicht atmenden Grana
als Versuchsobjekte vielfach vorzuziehen.
Sind aber Versuche mit Chlorella aus irgendeinem Grund notwendig, so muß man wissen, daß
ihre Atmung labil gegen oxydierende Substanzen ist, z. B. gegen Chinon, das in sehr kleinen Kon-
zentrationen die Atmung der Chlorella irreversibel hemmt; z. B. gegen H2O2, das in sehr kleinen
Konzentrationen die Atmung der Chlorella hemmt, falls die Katalase durch Blausäure vergiftet ist.
Die Folge davon ist, daß Blausäure im Licht die Atmung der Chlorella zerstört, während Blausäure
im Dunkeln die Atmung der Chlorella intakt läßt. Dunkelkontrollen bei Versuchen mit Blausäure
können also irreführen. Sie haben uns vor vielen Jahren irregeführt14, als wir zu finden glaubten,
daß Blausäure die Photosynthese nur oberhalb des Kompensationspunktes hemmt. In Wirklichkeit
hemmt Blausäure die Photosynthese in gleichem Maße auf beiden Seiten des Kompensations-
punktes, was heute selbstverständlich ist. Denn heute weiß man14a, daß die Atmung durch nichts
anderes kompensiert wird als durch die Reaktion CO2 = C + O2.
Manometrie. Wegen der Carotinoid-Oxydase15 sollten die manometrischen Versuche in Luft oder
O2 nach Möglichkeit unter Zusatz von Kohlensäure ausgeführt werden und im allgemeinen nicht
länger als eine Stde. dauern. Mehrfach haben wir nach beendeter Manometrie die Pigmente der
Grana oder Chlorella mit Methanol extrahiert und die Spektren der Methanolextrakte registriert.
Keine wesentlichen Änderungen der Spektren in den Versuchszeiten wurden gefunden.
Bei den manometrischen Versuchen mit Blausäure ist darauf zu achten, daß beim Durchleiten
der Gase durch die Manometriegefäße keine Blausäure verloren wird. Es wird empfohlen, Mano-
metriegefäße mit 2 Birnen zu benutzen. In die erste Birne werden 0,4 cm3 der Blausäurelösung ge-
geben, durch die zweite Birne strömen die Gase während der Gasdurchleitung aus. Erst nachdem
die Gasdurchleitung beendet ist und die Hähne geschlossen sind, wird die Blausäure aus der Birne
in den Hauptraum gegeben. Man überzeugt sich durch Titration der Blausäure mit Silbernitrat im
Hauptraum, daß bei dieser Anordnung keine nennenswerten Mengen an Blausäure verloren werden.
Die Temperatur bei der Manometrie war 20°. Die Lichtstrahlen wurden von 500-Watt-Metall-
fadenlampen (Kinolampen) erzeugt und mit verdünntem Kupfersulfat von Ultrarot nahezu be-
freit. Der pro Gefäß eingestrahlte Energiestrom betrug 36 //Mole Quanten pro Min. und wurde von
dem Chlorophyll, dessen Menge 0,75 bis 1,5 mg pro Gefäß betrug, zum größeren Teil absorbiert.
War bei den manometrischen Versuchen Adenosindiphosphat zugesetzt und enthielt der Gas-
raum Kohlensäure, so wurde bei der Phosphatbindung Kohlensäure absorbiert, da die Reaktion bei
der Phosphatbindung alkalischer wird. Will man dabei den O-j-Umsatz bestimmen, so muß die
Kohlensäureaufnahme durch Einkippen von überschüssiger Säure gemessen und bei der Berech-
nung des O-2-Umsatzes berücksichtigt werden. Um dieses etwas umständliche Verfahren zu ver-
meiden, wird man im allgemeinen, wenn ADP zugesetzt ist, Phosphatpuffer als Suspensions-
flüssigkeit verwenden. Allerdings ist dann die Phosphatbindung gegenüber Bicarbonat-Kohlen-
säure-Puffer verlangsamt.
Die manometrische Bestimmung der Fixierung des Kohlenstoffs ist im Text beschrieben. Diese
Methode ist dem nur qualitativen Nachweis der Fixierung mit Hilfe von radioaktiver Kohlensäure
bei weitem vorzuziehen.
Bestimmung der Phosphatbindung. Zur Messung der Phosphatbindung wurde das anorganische Phos-
phat zu den Zeiten t0 und t im Perchlorsäureextrakt der Grana mit Ammonmolybdat und Ferrosulfat
nach Sumner16 bestimmt. Nur wenn der Phosphatpuffer konzentriert war, wurde das anorganische
Phosphat mit MgCl? in alkalischer Lösung ausgefällt und im Filtrat die Zunahme des ATP bestimmt.
Bestimmung des H2O2. Die beste Bestimmung des H2O2 ist die manometrische. Die Granasuspensio-
nen werden zu dem Zweck mit Perchlorsäure gefällt, aus dem Perchlorsäure-Extrakt wird die Blau-
säure ausgetrieben. Dann wird bis pH 6 neutralisiert und nach Zusatz von Katalase der O2 entwickelt.
Sollte das H2O2 kolorimetrisch bestimmt werden, so wurde mit Trichloressigsäure enteiweißt
und zum Filtrat Titandioxyd zugesetzt, falls die Flüssigkeiten nicht zuviel Phosphorsäure enthielten.
Andernfalls wurde eine neue Farbreaktion angewendet, bei der 2.7-Dihydroxynaphtalin in kon-
zentrierter Schwefelsäure eine Blaufärbung erzeugt. Hierbei stört weder Phosphorsäure noch Blau-
säure, aber z. B. Glykolsäure und Milchsäure. Zur Ausführung löst man 10 mg 2.7-Dihydroxy-
naphtalin in 100 cm3 reinster konz. Schwefelsäure, gibt 3 cm3 davon zu 0,2 cm3 einer wäßrigen
x-Lösung und erwärmt 10 Min. im siedenden Wasserbad.
472
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
Versuche
Versuch vom 30. 6. 59. Grana von Freilandspinat, nach der Vorschrift von 1944 gewonnen und in
w/30-Phosphat pH 6,7 suspendiert. Die stöchiometrische O-2-Ennuicklung im Licht wird durch njlOO
Blausäure nicht gehemmt.
Gefäß 297 Gefäß 302
koo = Ml mm'-, in n 100-Blausäure ko2 = 1>37 mm2, ohne Blausäure
Hauptraum :
Birne:
Gasraum:
[Min.]
10
10
5
25
[cm3]
1,0 w/10-Phosphat pH 6,5
1,0 Grana == 0,79 //Mole Chlorophyll
1,4 H20
0,1 ;h/2-KC1
0,4 m/10-HCN
12 //Mole ß-Naphtochinon-
sulfosäure in 0,1 H2O
1,7% CO2- Argon
hell
O2 [mm3]
+ 83
+ 44
0
127
= 5,7 //Mole O2
ber. 6,0 //Mole O2
0,4 H2O
— >
hell
O2 [mm3]
+ 93
+ 37
0
+ 130
= 5,8 //Mole O2
ber. 6,0 //Mole O2
Nichthemmung der stöchiometrischen O^-Entwicklung findet man auch, wenn man die ß-Naphto-
chinonsulfosäure durch Benzochinon ersetzt.
Birne II:
Gasraum:
[Min.]
5
5
5
15
15
15
60
Argon
hell
[mm]
21
14,5
12,0
+ 28
21
15
111,5
179mm302
Gefäß II
&02 = 1,665 mm'-2
»/100-HCN
Versuch vom 15. 7. 59. Grana von Freilandspinat, nach Vorschrift von 1944, suspendiert in w/12-
Phosphat pH 7,4, ± HCN belichtet. Die stöchiometrische O^-Entwicklung durch Ferricyanid wird
von njlOO-HCN nicht gehemmt.
Gefäß I
&(>., = 1,604 mm'2
" ohne HCN
Hauptraum: 2,5 cm3 w/'lO-Phosphat
pH 7,4, 0,1", KCl
0,5 cm3 Grana
= 1,8// Mole
Chlorophyll
Birne I: 0,2 m/5 K3Fe(CN)6
= 40 //Mole
0,3 h/10-HCN
—. >
hell
[mm]
+ 18
15,5
+ 11,0
+ 26
20,5
+ 15,5
! 106,5
177mm302
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
473
Versuch vom 30. 6. 59. Grana von Freilandspinat, nach der Vorschrift von 1944 gewonnen, in
m 40-Phosphat pH 8,3 suspendiert, verbrauchen ö2 bei Belichtung in n 100-HCN und bilden
H2O2. Das Verhältnis H2O2/O2 ist ungefähr = 2.
Hauptraum :
Birne :
Gasraum :
[Min.]
5
5
5
5
10
10
10
Gefäß I
ko-> = 1541 mm2
njlOO-HCN
[cm3]
1,0 w/10-Phosphat pH 8,3
0,1 w/2,KCl
1,0 Grana = 0,79 //Mol
Chlorophyll
1,4 H2O
0,4 m/10-HCN
1 //Mol f/'-Naphtochinon-
sulfosäure in 0,1 H2O
Luft
hell
[mm]
— 10,5
— 25
— 19
— 13
— 24
— 13
— 9
Gefäß II
koi = 1>37 mm-
ohne HCN
aber ohne HCN
hell
50
H2O2 gebildet
- HoO-2
-02
-113,5
- 160 mm3 O2
- 7,2 //Mole O:
13,1 //Mole
= — 1,82
1 mm
kein H2O2
Versuch vom 1. 6. 59. Grana („Broken Chloroplasts") von Freilandspinat, suspendiert in n 10-
NaHC03, Gasraum, 2 Vol-% C02-Argon, pH 8,3: belichtet -_ HCN. Der niedrige Oj-Druck,
der im Licht entsteht, genügt zur Reoxydation der katalytischen Chinonmenge, wenn keine HCN
zugegen ist. In HCN jedoch ist die fermentative Reoxydation gehemmt und damit auch die Licht-
phosphorvlierung.
Gefäß I
Volumen 18,92 cm3
ohne HCN (pH 8,3)
hell
Hauptraum : [cm3]
2,0 ;;/ 5-NaHC03 = 400 //M
0,3 m IO-K2HPO4 = 30 //M
0,1 ?»/10-MgCl2
0,4 w/20 ADP
1,0 Grana
= 1 //Mol Chlorophyll
Birne: 0,5 //Mol p'-Naphtochinon-
sulfosäure
in 0,2 H2O
Gasraum: 2 Vol.-% C02-Argon
25 Min. — 49 mm
(ist C(>2-Absorption
infolge Phosphorylierung)
//Mole ATP 12,8
Gefäß II
Volumen 18,52 cm3
n 270-HCN (pH 8,3)
hell
aber
- 0,15 cm3 n 10-KCN
- 5 mm
(wenig Druck, da wenig
Phosphorylierung)
0,75
474
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
Versuch vom 1. 7. 59. Grana von Freilandspinat, nach Vorschrift von 1944 gewonnen, suspendiert in
w/10-NaHCO3, Gasraum 2 Vol-% C02 mit Luft oder Argon. pH 8,3. Wirkung des 02-Drucks und
der Blausäure auf die Lichtphosphorylierung. In 2% CO-2-Luft steht für die Reoxydation des Hydro-
chinons der Oo-Druck der Luft zur Verfügung, in 2% CQs-Argon steht nur der im Licht entwickelte
0-2 zur Verfügung. In COi-Argon ist also der O-2-Druck sehr niedrig. Im Licht war:
Hauptraum:
Birne:
Gasraum :
Gefäß I
- HCN
Hoher
Oi-Druck
[cm3]
2,0 w/5-
NaHC03 = 400 //M
0,1 ;w/10-
MgClo
0,3 w/10-
K2HPO4 = 30 //M
0,4 w/20-
ADP
1,0 Grana =
0,9 //Mol
Chloro-
phyll
0,4 H2O
Gefäß II
+ HCN
Gefäß III
- HCN
Niedriger
02-Druck
Gefäß IV
4- HCN
2 Vol.-%
C02-Luft
0,4 n/10-
HCN
2 Vol.-",,
COo-Luft
0,4 H2O
2 Vol.-%
C02-Argon
ADP gebildet nach 30 Min. Belichtung
16,3 //Mole
7,4 //Mole
6,5 //Mole
0,4 k/10-
HCN
2 Vol.-%
C02-Argon
0 //Mole
Versuch vom 8. 7. 59. Grana von Freilandspinat, nach der Vorschrift von 1944 gewonnen und in
Bicarbonatpuffer suspendiert, sind das beste Versuchsmaterial zum Nachzveis und zur Messung der
Lichtphosphorylierung. In dem folgenden Versuch bindet eine Granamenge, die 1,5 //Mole Chloro-
phyll enthält, in 15 Min. 20 //Mole H3PO4. Die Halbwertzeit beträgt etwa 3 Minuten. Katalysator
ist /»-Naphtochinonsulfosäure. Im stöchiometrischen Versuch mit /»'-Naphtochinonsulfosäure
erscheint in 15 Min. die berechnete Menge O2, die Halbwertzeit ist etwa 14 Minuten. Im Licht war:
Hauptraum:
Birne:
Gasraum:
Stöchiometrischer Versuch
pH 6,8
[cm3]
1,0 w/10-Phosphat
0,1 w/2-KCl
0,5 Grana =
1,5 //Mole Chlorophyll
2,4 HoO
10 //Mole />'-Naphto-
chinonsulfosäure
Argon
Katalytischer Versuch
' pH 8,0
Hauptraum: [cm3]
2,0 w/5-NaHCOs = 400 //M
0,1 w/2-KCl
0,1 w/10-MgCl2
0,3 w/10-Na2HPO4 = 30//M
0,4 w/20-ADP = 20 //M
0,5 Grana =
1,5 //Mole Chlorophyll
0,4 H2O
Birne: 1 //Mol ß-Naphtochinon-
sulfosäure
Gasraum: 2 Vol.-% CC>2-Luft
Über den chemischen Mechanismus der Photo synthese
475
[Min.] hell
[02 mm3]
5 + 60,6
5 + 42,3
5 + 9,9
5 + 1,4
20 +114,2
= 5,l//Mole02
berechnet
5,0//Mole 02
in.] hell
dunkel
[mm]
[mm]
5 — 59
+ 1
5 — 44
+ 4
5 — 5
+ 4
5 — 1
+ 4
1
Ist C02-
Absorption
durch
Phosphat-
bindung
1
ATP
ATP
gebildet
gebildet
17,4 //Mole
0//M
Versuch vom 29. 5. 59. Granu („Broken Chloroplasts") von Freilandspinat, suspendiert in
m/10-NaHCO3, Gasraum 2 Vol.-% C02-Luft, pH 8,3, zeigen mit ADP sehr erhebliche Licht-
phosphory Herwig. Wird durch n!200-HCN nicht gehemmt. Aus den Drucken kann der 02-Verbrauch
nicht berechnet werden, da C02 infolge der Phosphorylierung, absorbiert wird Bestimmung von
ATP und von H202.
Gefäß I Gefäß II Gefäß III
(v == 18,92 cm3) (v == 18,5 cm3) (v == 18,78 cm3)
ohne HCN n/1000-HCN nl200-HCN
Hauptraum :
Birne:
Gasraum :
[cm3]
2,0 w/5-NaHC03
0,3 w/10-K2HPO4
0,1 w/10-MgCl2
0,4 w/20-ADP
1,0 Grana =
0,5 //Mole Chloro-
phyll
0,5 //Mole /3-Naphto-
chinonsulfosäure
in 0,2 H20
2% C02-Luft
[Min.]
5
5
10
hell
[mm]
— 26
— 18
— 21
1
- 0,3 cm3
30proz.
HCIO4
H3P04
gebunden
als ATP
13,5 //Mole
+ 0,04 cm3
«/10-HCN
hell
[mm]
— 54
— 45
— 32
1
13,0 //Mole
+ 0,2 cm3
w/10-HCN
hell
[mm]
— 52
— 47
— 41
1
12,2 //Mole
Also keine Hemmung der Lichtphosphorylierung durch HCN.
476
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
Versuch vom 29. 5. 59. Grana („Broken Chloroplasts") von Freilandspinat suspendiert in
«/10-NaHCO3, Gasraum 2 COo-Luft, pH 8,3, in k/500-HCN. Vergleich von Phosphorylierung
und HiO-2-Bildung.
Hauptraum:
Birne:
Gasraum:
Gefäß I
Gefäß II
Vol. 18,92 cm3
Vol. 18,52 cm3
ohne HCN
w/500-HCN
hell
hell
[cm3]
2,0 «z/5-NaHC03
0,3 w/10-K2HPO4
->
0,1 m/10-MgCl2
aber
0,4 w/20-ADP
+ 0,1 cm3
1,0 Grana =
h/10-HCN
0,5 //Mol Chloro-
phyll
0,5 //Mol ß-Naphto-
chinonsulfonsäure
->
in 0,2 cm3 H20
2Vol.-% C02-Lufl
25 Min. — 73 mm —165 mm
//Mole ATP 14,4
13,0
//Mole H2O2 0
13,5
Gefäß III
Vol. 18,78 cm3
«/500-HCN
dunkel
aber
+ 0,1 cm3
w/10-HCN
+ 4 mm
0
0
H2O2
ATP
Dieser Quotient kann nur gefunden werden, solange ADP im Überschuß vorhanden ist, also
in kurzen Versuchen.
Versuch vom 13. 7. 59, Grana von Freilandspinat, nach der Vorschrift von 1944 gewonnen
und in ;;//30-Phosphat pH 8,3 suspendiert. Die stöchiometrische O^-Entwicklung durch ß-Naphto-
chinonsulfosäure im Licht zvird durch Zusatz voji ADP nicht beeinflußt. In diesem Versuch ist die
Phenoloxydase durch die große Menge Chinon vergiftet, daher bei sehr niedrigen (>2-Drucken
keine Reoxydation.
Gefäß 297 Gefäß 302
&O2 = 1>50 mm2 &O2 = 1j47 mm2
+ ADP ohne ADP
Hauptraum: [cm3]
1,0 >»/10-Na2HPO4
0,1 ;«/10-MgSO4
0,1 m/2-KCl ->
0,4 w/20-ADP 0,4 H2O
0,2 Grana =
0,64 //Mol Chlorophyll ->
1,0 h2o
Birne :
Gasraum:
10 //Mole /i-Naphtochinon-
sulfosäure in 0,2 H2O
->
Argon
->
r... n hell
[Min.l
L J [mm]
hell
[mm]
2 +16,5
10,0
2 + 8,0
+ 8,0
3 + 6,0
+ 10,0
3 + 7,0
+ 9,0
5 +11,0
+ 12,0
5 + 7,0
7,0
5 0
+ 0,5
25 r55,5
+ 56,5
= 83 mm3 O2
= 83 mm3 O2
Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese
477
Entwickelt man unter sonst gleichen Bedingungen den 0_> mit 40 //Molen Ferricyanid : : ADP,
so findet man auch dann keinen Einfluß von ADP auf die Geschwindigkeit der Oo-Entwicklung.
Entgegengesetzte Angaben der Literatur beruhen darauf, daß durch den Zusatz des ADP die
Acidität verschoben worden ist
Versuch vom 24. 5. 59. Chlorella (2tägige Südfenster-Kultur), suspendiert in »1/5O-KH2PO4
w/50-MgSO4, pH 4,3, im Dunkeln H1O1 oder + HCN oder + H2O2
Hauptraum:
Birne:
Gasraum :
[Min.]
5
5
5
15
30
Gefäß I
ko2 = l,86 mm2
nur H2O2
100 mm3 Chlorella in
3 cm3 /»/5O-KH2PO4
w/50-MgSO4
10 //Mole H2O2
20 Vol.-% CO2— O2
dunkel und Birne ein-
gekippt
ko
Gefäß II
, = 1,70 mm'2
nur HCN
-f-0,3 h/10-
HCN
HCN.
Gefäß III
ko2 = 1,840 mm-
H2O2 + HCN
+ 0,3 m/10-
HCN
[mm]
-52,5 I
= 62,5 mm
-1,5
+ 9,0
= 116 mm3
-2,0
1,0 1
= 5,2
—0,5
- 4,0
/