Ö IIEINK1CH WAftBÜBG srentmdklwiiÄ der /siologischen Met ',vaiB.di: auf Krebs, PhMosynÜiese und Wirlmngswdise de* Röntge.ostra.IiIen lethc iods Applied to Cancer, Photasyntbesis, and of X-R.ay Action Mechanism GEORG THEEM'E VERLAG •■ STUTTGART INTEESGIENGE PUBLISHEttS -NEW YORK Weiterentwicklung der zellphysiologischen Methoden Angewandt auf Krebs, Photosynthese und Wirkungsweise der Röntgenstrahlen New Methods of Cell Physiology Applied to Cancer, Photosynthesis, and Mechanism of X-Ray Action New Methods of Cell Physiology Applied to Cancer, Photosynthesis, and Mechanism of X-Ray Action Developed 1945-1961 by OTTO HEINRICH WARBURG ORDER POUR LE MERITE Director, Max-Planck- Institute for Cell Physiology Berlin-Dahlem With 177 Figures 1962 INTERSCIENCE PUBLISHERS • NEW YORK A DIVISION OF JOHN WILEY & SONS Weiterentwicklung der zellphysiologischen Methoden Angewandt auf Krebs, Photosynthese und Wirkungsweise der Röntgenstrahlen Arbeiten aus den Jahren 1945-1961 von OTTO HEINRICH WARBURG Direktor des Max-Planck-Instituts für Zellphysiologie Berlin-Dahlem Mit 177 Abbildungen 1962 GEORG THIEME VERLAG • STUTTGART Von demselben Autor / From the same author: Stoffwechsel der Tumoren. Springer, Berlin 1926 (vergriffen). Katalytische Wirkungen der lebendigen Substanz Springer, Berlin 1928 (vergriffen). The Metabolism of Tumors Constable and Co., Ltd., London 1930 Translated by Frank Dickens Schwermetalle als Wirkungsgruppe von Fermenten Werner Saenger, Berlin 1948 (vergriffen). Wasserstoffübertragende Fermente Werner Saenger, Berlin 1948 (vergriffen). Heavy Metals and Enzyme Action Clarendon Press, Oxford 1949 Translated by Alexander Lawson Alle Rechte, insbesondere das Recht der Vervielfältigung und Verbreitung sowie der Übersetzung in fremde Sprachen, vorbehalten. Kein Teil des Werkes darf in irgendeiner Form (durch Photokopie, Mikrofilm oder ein anderes Verfahren) ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. The special contents of this edition Copyright < by Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1962. Printed in Germany. Satz und Druck: Union Druckerei GmbH Stuttgart Emil Fischer (1852—1919) dessen Arbeiten über die Kohlehydrate, die Purine und die Peptide das Fundament der Biochemie von heute sind, der 1910 den Anstoß zur Gründung der Kaiser-Wilhelm-Gesellschaft gab. Denkmal in Talar mit Orden Pour le merke im Garten des Max-Planck-Instituts für Zellphysiologie in Berlin-Dahlem Vorwort Es sind zwei Probleme gewesen, die uns zur Weiterentwicklung der zellphysio- logischen Methoden veranlaßt haben, ein medizinisches Problem, die Entstehung der Krebszellen; und ein allgemein-biologisches Problem, die Umwandlung der Lichtenergie in chemische Energie in den grünen Zellen. Die vorliegende Samm- lung enthält methodisch wichtige Arbeiten, die wir in den Jahren 1945 bis 1960 veröffentlicht haben, sowie 20 Beiträge von 1961, die an anderer Stelle nicht ver- öffentlicht worden sind. Ich glaube, daß jeder, der auf den genannten Gebieten weiterarbeiten will, die neuen Methoden kennen muß und imstande sein muß, sie anzuwenden. Preface There have been two problems which caused us to develop further our cell-phy- siological methods : a medical problem, the origin of Cancer cells ; and a general biological problem, the conversion of light energy into chemical energy in green cells. The present collection contains methodologically important papers, which we published in the years 1945 to 1961, as well as 20 papers written in 1961 that have not been published elsewhere. I believe that anyone intending to work in the two fields must be familiär with these methods and must be capable to apply them. Berlin-Dahlem, November 1961 Otto Warburg Inhaltsverzeichnis ^ ( l * * lL--- Vorwort v^_. . .r^^f VII Preface VII Einleitung 1 Introduction 21 1 D. Burk Biographical Sketch 43 2 O. Warburg Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 47 3 O. Warburg Über den Quantenbedarf der Kohlensäureassimilation 73 4 O. Warburg, V. Schocken A Manometric Actinometer for the Visible Spectrum 75 5 D. Burk, St. Hendricks, M. Korzenovsky, V. Schocken, O. Warburg The Quantum Efficiency of Photosynthesis 80 6 O. Warburg, D. Burk, V. Schocken The Maximum Efficiency of Photosynthesis 92 7 O. Warburg, D. Burk, V. Schocken, M. Korzenovsky, St. B. Hendricks Does Light Inhibit the Respiration of Green Cells ? 100 8 O. Warburg, D. Burk, The Maximum Efficiency of Photosynthesis 103 9 O. Warburg, D. Burk, A. L. Schade, Extensions of Photosynthetic Experimentation 129 10 D. Burk, O. Warburg, 1 -Quanten-Mechanismus und Energie-Kreisprozeß bei der Photosynthese 135 11 D. Burk, O. Warburg, 1 -Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese 137 12 O. Warburg, 1 -Quanten-Mechanismus der Photosynthese 154 12a O. Warburg, H. Geleick, K. Briese, Weitere Steigerung des Energiegewinnes im Kreisprozeß der Photosynthese 165 13 O. Warburg, H.-S. Gewitz, Cytohämin aus Herzmuskel 175 14 O. Warburg, H.-S. Gewitz, Cyto-Deutero-Porphyrin 178 7QÜH£ X Inhaltsverzeichnis 15 O. Warburg, H.-S. Gewitz, W. Völker, Über Gewinnung und Abbau des Cytohämins 182 16 H.-S. Gewitz, W. Völker, Über die Synthese einiger Deuteroporphyrine 189 17 O. Warburg, E. Hiepler, Versuche mit Ascites-Tumorzellen 197 18 O. Warburg, G. Krippahl, W. Buchholz, W. Schröder, Weiterentwicklung der Methoden zur Messung der Photosynthese .... 201 19 O. Warburg, Über die Wirkungsgruppen der oxydierenden und reduzierenden Fermente 208 20 O. Warburg, Über das Verhalten von Aszites-Tumorzellen zu Sauerstoff von höheren Drucken 216 21 O. Warburg, K. Gawehn, Isolierung der Hefezymohexase und ihre Kristallisation als Quecksilber- salz 220 22 O. Warburg, K. Gawehn, G. Lange, Über das Verhalten von Ascites-Krebszellen zu Zymohexase 224 23 O. Warburg, H. Klotzsch, K. Gawehn, Über die Oxydationsreaktion der Gärung 231 24 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, Stöchiometrische Versuche mit dem oxydierenden Gärungsferment .... 234 25 O. Warburg, G. Krippahl, Messung der Lichtabsorption in Chlorella mit der Ulbrichtschen Kugel 237 26 O. Warburg, Über die Berücksichtigung der Retention der Kohlensäure bei Messungen der Photosynthese in Kulturlösungen 239 27 O. Warburg, G. Krippahl, W. Schröder, W. Buchholz, E. Theel, Über die Wirkung sehr schwachen blaugrünen Lichts auf den Quanten- bedarf der Photosynthese 242 27 a O. Warburg, Krebsforschung 244 28 O. Warburg, G. Krippahl, W. Schröder, Katalytische Wirkung des blaugrünen Lichts auf den Energieumsatz bei der Photosynthese 248 29 O. Warburg, G. Krippahl, W. Schröder, Wirkungsspektrum eines Phctosynthese-Ferments 261 Inhaltsverzeichnis XI 30 O. Warburg, G. Krippahl, W. Schröder, W. Buchholz, Sauerstoff-Kapazität der Chlorella 274 31 O. Warburg, W. Schröder, Versuche über die Sauerstoff-Kapazität der Chlorella 289 31 a O. Warburg, G. Krippahl, W. Schröder, Über den chemischen Mechanismus der Kohlensäureassimilation 294 31 b O. Warburg, G. Krippahl, Über die CCvKapazität der Chlorella und den chemischen Mechanis- mus der C02-Assimilation 305 31c O. Warburg, G. Krippahl, Über die funktionelle Carboxylgruppe des Chlorophylls 310 32 O. Warburg, G. Krippahl, W. Buchholz, Wirkung von Vanadium auf die Photosynthese 312 33 O. Warburg, G. Krippahl, Photochemische Wasserzersetzung durch lebende Chlorella 313 34 O. Warburg, Über die Messung des Energieumsatzes bei der Photosynthese mit dem Großflächen-Bolometer 320 35 O. Warburg, On the Origin of Cancer Cells 322 36 S. Weinhouse, Discussion: On Respiratory Impairment in Cancer Cells 335 36a D. Burk, A. L. Schade, Discussion : On Respiratory Impairment in Cancer Cells 339 36 b O. Warburg, Discussion: On Respiratory Impairment in Cancer Cells 344 37 O. Warburg, G. Krippahl, Über die funktionelle Kohlensäure der Chlorella 347 38 O. Warburg, W. Schröder, H.-W. Gattung, Züchtung der Chlorella mit fluktuierender Lichtintensität 361 39 O. Warburg, G. Krippahl, Ausbau der manometrischen Methoden 366 40 O. Warburg, G. Krippahl, Weiterentwicklung der manometrischen Methoden 369 41 O. Warburg, G. Krippahl, Weiterentwicklung der manometrischen Methoden 374 42 O. Warburg, G. Krippahl, Weiterentwicklung der manometrischen Methoden (Carbonatgemische) 378 XII Inhaltsverzeichnis 42 a O. Warburg, H. Klotzsch, G. Krippahl, Glutaminsäure-Decarboxylase in Chlorella 383 43 O. Warburg, H. Klotzsch, G. Krippahl, Über das Verhalten einiger Aminosäuren in Chlorella bei Zusatz von markierter Kohlensäure 384 44 O. Warburg, Photosynthesis 386 45 O. Warburg, H. Klotzsch, G. Krippahl, Glutaminsäure in Chlorella 400 46 O. Warburg, G. Krippahl, Beweis der Notwendigkeit der Glutaminsäure für die Photosynthese ... 411 47 O. Warburg, W. Schröder, Quantenbedarf der Photosynthese 414 48 O. Warburg, H.-S. Gewitz, W. Völker, D-(— )-Milchsäure in Chlorella 423 49 O. Warburg, G. Krippahl, Sauerstorf-Halbwertdrucke der Photosynthese und Atmung 427 50 O. Warburg, G. Krippahl, H.-S. Gewitz, W. Völker, Carotinoid-Oxygenase in Chlorella 431 51 O. Warburg, G. Krippahl, Hill-Reaktionen 435 52 O. Warburg, D. Kayser, Wirkung von Kohlenoxyd auf Atmung und Photosynthese in grünen Keimblättern 443 53 O. Warburg, G. Krippahl, Neubestimmung des Quantenbedarfs der Photosynthese mit der Kom- pensationsmethode 447 54 O. Warburg, G. Krippahl, Glykolsäurebildung in Chlorella 458 55 O. Warburg, G. Krippahl, H.-S. Gewitz, W. Völker, Über den chemischen Mechanismus der Photosynthese 462 56 O. Warburg, G. Krippahl, Notwendigkeit der Kohlensäure für die Chinon- und Ferricyanid-Reak- tionen in grünen Grana 481 57 O. Warburg, G. Krippahl, H.-W. Gattung, 1 -Gefäß-Methode zur Messung des Quantenbedarfs der Photosynthese 484 58 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, Stoffwechsel von embryonalen Zellen und von Krebszellen 488 Inhaltsverzeichnis XIII 59 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, Manometrie der Körperzellen unter physiologischen Bedingungen 496 60 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, Über die Wirkung von Wasserstoffperoxyd auf Krebszellen und auf embryonale Zellen 501 61 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, Über die Entstehung des Krebsstoffwechsels in der Gewebekultur .... 505 62 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, Stoffwechsel der weißen Blutkörperchen 509 63 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, Katalasegehalt, Gärung und Atmung in der Zellkultur nach Dulbecco- Vogt 511 64 O. Warburg, W. Schröder, H.-S. Gewitz, W. Völker, Manometrisches Röntgenstrahlen-Aktinometer und über die Wirkung von Röntgenstrahlen auf die Gärung von Krebszellen 515 65 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, W. Schröder, H.-S. Gewitz, W. Völker, Partielle Anaerobiose und Strahlenempfindlichkeit der Krebszellen 524 66 O. Warburg, W. Schröder, H.-W. Gattung, Über die Wirkung von Röntgenstrahlen auf Hämoglobin (Mit einer Be- merkung über die Strahlenempfindlichkeit von Gewebeschnitten) 534 67 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, Umwandlung des embryonalen Stoffwechsels in Krebsstoffwechsel .... 539 68 O. Warburg, G. Krippahl, Manometrische Bestimmung der Ascorbinsäure 541 69 O. Warburg, A. Lehmann, H.-W. Gattung, Über den Quantenbedarf der Photosynthese in Blättern 542 70 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, Weiterentwicklung der zellphysiologischen Methoden (Verbindung von Manometrie und optischer Milchsäurebestimmung) 545 71 O. Warburg, K. Gawehn, A.-W. Geissler, S. Lorenz Über die Umwandlung des embryonalen Stoffwechsels in Krebsstoff- wechsel 548 72 H.-S. Gewitz, W. Völker, Weiterentwicklung der manometrischen Methoden (Herstellung definier- ter Blausäure-Konzentrationen) 553 73 O. Warburg, G. Krippahl, Weiterentwicklung der manometrischen Methoden (Universalgefäße) . . 555 XIV Inhaltsverzeichnis 74 T. Terranova, K. Gawehn, Stoffwechsel der Zellen des trypsinisierten Knochenmarks 557 75 O. Warburg, G. Krippahl, Ortho- und meta-Phenanthrolin in Chlorella 560 76 O. Warburg, K. Gawehn, T. Terranova, Weitere Versuche über die Umwandlung des embryonalen Stoffwechsels in Krebsstoffwechsel 562 77 O. Warburg, G. Krippahl, Weiterentwicklung der manometrischen Methoden (Wechsel aerober und anaerober Bedingungen) 564 78 O. Warburg, G. Krippahl, Über den Photolyten der Photosynthese 567 79 O. Warburg, A.-W. Geissler, S. Lorenz, Neue Methoden zur Bestimmung des COo-Drucks über Bicarbonat- Carbonatgemischen 578 80 O. Warburg, A.-W. Geissler, S. Lorenz, Quantenausbeute der Photosynthese als Funktion des C02-Drucks 582 81 H.-S. Gewitz, W. Völker, 3-Hydroxytyramin, ein biologischer Oxydationskatalysator der Photo- synthese 583 82 O. Warburg, A.-W. Geissler, S. Lorenz, Weitere Versuche über die Wirkung von Röntgenstrahlen auf den Stoff- wechsel der Krebszellen 585 83 O. Warburg, D. Kayser, Über die Wirkung der Röntgenstrahlen auf den Stoffwechsel von Milch- säurebakterien 588 84 O. Warburg, G. Krippahl, H.-S. Gewitz, W. Völker, Über die Sauerstoff Übertragung durch belichtetes Chlorophyll 595 85 O. Warburg, G. Krippahl, Wasserstoffperoxyd in Chlorella 606 86 O. Warburg, G. Krippahl, K. Jetschmann, Zerfall und Wiederaufbau der Glutaminsäure in Chlorella 609 87 O. Warburg, K. Jetschmann, Hemmung der Phosphorylierung durch Phenanthrolin in lebender Chlorella 612 88 O. Warburg, K. Jetschmann, Wirkung der Blausäure auf die Bildung des Photolyten der Photo- synthese 615 Inhaltsverzeichnis XV 89 O. Warburg, K. Gawehn, Über die Messung der Atmung von Krebszellen mit einer 1-Gefäß- Methode 618 90 O. Warburg und D. Kayser, Über Wachstumshemmung durch Röntgenstrahlen 620 91 O. Warburg, Über Phosphorylierung im Licht 622 92 O. Warburg, Beweis, daß der Photolyt der Photosynthese eine Kohlensäureverbindung ist 625 93 O. Warburg, Über die fakultative Anaerobiose der Krebszellen und ihre Anwendung auf die Chemotherapie 627 94 O. Warburg, Über die Klassifizierung der Krebszellen auf der Basis der Anaerobiose in vivo 631 95 O. Warburg, Über Phosphorylierung durch Dehydrierung 633 Sachverzeichnis 635 Subject-Index 641 Einleitung * Motto: «De fixer les objets longtemps sans etre fatigue.» Allgemeines über unsere Methoden und ihre Anwendungen Als Mitarbeiter Emil Fischers habe ich in den Jahren 1903 bis 1906 die ersten optisch aktiven Peptide dargestellt und dabei, zum engeren Kreis seiner Mitarbei- ter gehörend, die Methoden und Arbeitsweise des größten Organikers unserer Zeit kennengelernt. Später habe ich im Strahlungslaboratorium der Physikalisch- Technischen Reichsanstalt, deren Präsident mein Vater von 1906 bis 1922 gewesen ist, die Arbeiten über den Quantenbedarf der Photosynthese begonnen. Es war das Laboratorium, aus dessen Versuchen Max Planck im Jahr 1900 sein Strahlungs- gesetz ableitete und das Wirkungsquantum h == 6,55 • 10 27 erg • sek berechnete. Es war das Laboratorium, in dem Emil Warburg die ersten Quantenausbeuten photochemischer Reaktionen gemessen hat. So kam es, daß in dem Kaiser- Wilhelm-Institut für Zellphysiologie die Metho- den weit getrennter Gebiete, der Strahlungsphysik und der organischen Chemie, in einer Hand vereinigt wurden. Das Ergebnis war der chemische Mechanismus der Fermentwirkungen, die Zurückführung der Fermentwirkungen auf sehr schnelle Zwischenreaktionen an Proteine gebundener Wirkungsgruppen, die wir von den Fermenten getrennt und kristallisiert haben. Kofermente aber und viele Vitamine erwiesen sich als nichts anderes als freie Wirkungsgruppen von Fer- menten. Ich möchte das für unser Institut charakteristische Zusammenwirken physi- kalischer und chemischer Methoden an einigen Beispielen erläutern. Mit den Methoden der Strahlungsphysik wurde die Substanz entdeckt, mit der der molekulare Sauerstoff in der lebenden Welt reagiert. Mit den Methoden der organischen Chemie wurde diese Substanz, die eine Eisenverbindung ist, von den Zellen getrennt und kristallisiert. — Mit den Methoden der Strahlungsphysik wurden die Wirkungsgruppen der wasserstoffübertragenden Fermente entdeckt, mit den Methoden der organischen Chemie wurden diese Wirkungsgruppen von den Zellen getrennt und kristallisiert. Aus dem Zusammenwirken der sauerstoff- und wasserstoffübertragenden Fermente ergab sich dann die Kette der Atmungs- fermente — die allgemeine Lösung des Problems der Lavoisierschen Atmung. — Mit den Methoden der Strahlungsphysik wurde die Hauptreaktion der Gärungen als Wasserstoffübertragung durch Nikotinsäureamid erkannt, mit den Methoden der organischen Chemie wurde aus gärenden Zellen die 1,3-Diphosphoglycerin- säure isoliert, deren Bildung und Zerfall bei den Gärungen die Verwandlung der Gärungsenergie in Phosphatenergie chemisch erklärt. — Mit physikalischen Me- thoden wurde die Gärung der Krebszellen entdeckt und damit das ungeordnete * Die kursiv gedruckten Zahlen dieser Einleitung sind die Nummern der Arbeiten in dem vor- stehenden Inhaltsverzeichnis. * Andere Literaturstellen sind in dieser Einleitung nur angeführt, wenn ältere eigene Arbeiten oder Arbeiten anderer Autoren zitiert werden. 1 Warburg. Zellphysiologie Einleitung Wachstum der Krebszellen durch eine Form der Energiegewinnung erklärt, die zu der Zeit herrschte, als die Erdatmosphäre noch keinen Sauerstoff enthielt — ein Ergebnis, das die letzte Ursache des Krebses in der anaeroben Vergangenheit des Lebens sieht. — Mit den Methoden der Strahlungsphysik wurde der Quanten- bedarf der Photosynthese gemessen und gefunden, daß etwas weniger als 3 Licht- quanten zur Spaltung von 1 CO, in C + 02 notwendig sind, was im Rot eine fast vollständige Umwandlung von Lichtenergie in chemische Energie bedeutet. Hier- bei spaltet 1 Lichtquantum aus einer durch die Atmung veränderten Kohlensäure primär 1 Molekül Sauerstoff ab, von dem aber 2 '3 wieder zurückreagieren, so daß in der Bilanz 3 Lichtquanten 1 Molekül CO2 spalten. Ein Mehrquanten-Problem der Photosynthese existiert hiernach nicht mehr. Die Photosynthese ist eingeordnet in die gewöhnlichen photochemischen Reaktionen der unbelebten Welt. Auf dieser Basis wird heute die spezielle Chemie der Photosynthese mit den Methoden der Manometrie und der organischen Chemie untersucht, wobei unsere Ergebnisse der allgemeinen Energetik in ausgezeichneter Weise bestätigt worden sind. Die besten physikalischen und chemischen Methoden aber wären nicht imstande gewesen, die Zellphysiologie zu fördern, wenn sie nicht verbunden worden wären mit einer Vereinfachung der physiologischen Versuchsanordnungen. Anstelle der Durchblutung überlebender Organe wurde die Methode der dünnen Gewebs- schnitte, anstelle der Gewebe wurden die einzelligen Versuchsobjekte eingeführt. Rote Blutzellen, die kernlosen der Säugetiere und die kernhaltigen der Vögel, waren die ersten Objekte bei der Untersuchung des chemischen Mechanismus der Zellatmung. Anstelle der grünen Blätter wurden — zur Untersuchung der Photo- synthese — die einzelligen Grünalgen eingeführt; oder die grünen Grana der Spinat-Chloroblasten oder die durch Beschallung gewonnenen noch viel kleineren grünen Grana der Chlorella. Anstelle der Tumoren wurden — zur Untersuchung der Krebszellen — die Ascites-Krebszellen eingeführt, anstelle der ganzen tieri- schen Zellen — bereits 1914 — die Grana der Leberzellen1. Immer war dabei unser Bestreben die Vereinfachung der Versuche und eine mit den Methoden der Maßanalyse vergleichbare Schnelligkeit und Genauigkeit der Versuche. Mit keiner komplizierten Versuchsanordnung haben wir jemals irgend etwas wesentliches entdeckt. SPEZIELLER TEIL I. Optische Messung der Hydrierung und Dehydrierung Wer die Biochemie vor der Entdeckung der wasserstoffübertragenden Funktion des Nikotinsäureamids nicht erlebt hat, kann die Bedeutung einer Methode nicht ermessen, die auf der Lichtabsorption der Dihydro-Pyridinnukleotide im nahen U. V. bei 340 mjj. beruht und von der es nicht übertrieben ist zu sagen, daß sie den Zeitaufwand, der zum Nachweis und zur Messung der wichtigsten Stoffwechsel- reaktionen notwendig ist, im Durchschnitt auf den 100. Teil verkürzt hat. Die Methode ist nicht auf Hydrierungen und Dehydrierungen beschränkt, sondern kann auch auf Spaltungen, Phosphorylierungen und alle Vorgänge ausgedehnt werden, die irgendwie mit Hydrierungen oder Dehydrierungen gekoppelt werden können. Die Arbeit (2) dieser Sammlung erläutert dies am Beispiel der Gärungs- reaktionen. Ist c die Konzentration des Dihydronikotinsäureamids, d der Lichtweg der Wellenlänge 340 ma und ß die Absorptionskonstante des Dihydronikotinsäure- amids, so ist der natürliche Logarithmus der Lichtschwächung i Drücken wir c in Mikromolen pro ccm und d in cm aus, so erhält ß die Dimension cm2/Mikromole. Der Zahlenwert von ß ß = 14 cm 2 1 // Mole gehört zu den wichtigsten Größen der Biochemie. Kennt man ihn, so kann man sofort hinschreiben, wieviel Mikromole Wasserstoff pro ccm in irgendeiner Flüssig- keit übertragen worden sind, wenn man -?- gemessen hat Aln^- Jc = /i Mole ß X d Ist zum Beispiel -?- = 2 und d = 1 cm, so wird Aln^- Jc = - -^ = -^=0,05 ß x d 14 u Mole cm3 woraus man sieht, daß die optische Methode sehr empfindlich ist, rund lOmal so empfindlich wie unsere biologische Manometrie. An den Vorschriften zur Ausführung der Methode hat sich seit 19352, seit der Entdeckung der Funktion und der U.V.-Bande des Dihydro-Nikotinsäureamids, nichts geändert. Doch ist die Methode erst allen zugänglich geworden, seit unsere Photozelle durch die Spektralphotometer von Beckman und Zeiss-Oberkochen 4 Einleitung ersetzt worden ist und seit die Firma Böhringer die reinen Stoffwechselfermente in den Handel bringt. Nikotinsäureamid kann im menschlichen Körper nicht in ausreichendem Maß synthetisiert werden und ist deshalb für den Menschen ein unentbehrliches Vita- min. Es ist weniger bekannt, daß Nikotinsäureamid auch ein wirksames Chemo- therapeutikum ist. 10 Jahre nach der Entdeckung der physiologischen Funktion des Nikotinsäureamids, im Jahr 1945, fand Vital Chorine3, daß man mit Niko- tinsäureamid tuberkulöse Meerschweichen und leprakranke Ratten heilen kann, wobei 0,3 bis 1 g pro Kilo Tier zur Heilung genügten. Die freie Nikotinsäure war therapeutisch unwirksam. Diese Wirkung des Nikotinsäureamids, einer völlig ungiftigen, als Bestandteil der wasserstoffübertragenden Fermente physiologisch notwendigen Substanz war für Gerhard Domagk der Anlaß, Nikotinsäureamid und seine Isomeren und Homologen bei der menschlichen Tuberkulose zu prüfen. Das Ergebnis war das Isonikotinsäure-Hydrazid, das heute das wirksamste Heil- mittel gegen menschliche Tuberkulose ist. IL Manometrie Die komplizierte manometrische Apparatur, z. B. zur Messung des Quantenbe- darfs der Photosynthese — Differentialmanometer, Ablesung mit dem Katheto- meter-Mikroskop, Kreisbewegung runder Gefäße — ist 1945 ersetzt worden durch einfache Manometer, Ablesung mit dem unbewaffneten Auge und gradlinige Bewegung von Kastengefäßen (8). Durch den Übergang von der Kreisbewegung zur gradlinigen Bewegung der Manometriegefäße ist eine Hauptfehlerquelle der Manometrie fortgefallen, die Bildung von Schaumblasen beim Schütteln der Ge- fäße. Eine Zellsuspension, die früher bereits nach einstündigem Schütteln voller Schaumblasen war, ist heute nach 24stündigem Schütteln frei von Schaumblasen, so daß wir zu beliebig langen Versuchszeiten übergehen und beliebig große mano- metrische Ausschläge erhalten konnten — ein Beispiel dafür, was man mit schein- bar geringen methodischen Änderungen erreichen kann. Wenn bei gradliniger Bewegung bestrahlter Manometriegefäße die Gefahr besteht, daß sich die Mano- metriegefäße an den Enden ihrer Bahn aus dem Lichtstrahl hinausbewegen, so kann man dies durch mitbewegte Spiegel, die an den Manometern angebracht werden, verhindern. Einfacher geworden sind auch die Stoffwechselmessungen in Serum, weil die komplizierte Berechnung der Retention der Kohlensäure durch eine einfache Bestimmungsmethode zur Bestimmung der Retention ersetzt worden ist. Einen entscheidenden Fortschritt der Manometrie (41, 42, 73) bedeutet die Ein- führung der neuen „Anhänger"- und „Wannengefäße", die die alten Manometrie- gefäße vollständig verdrängen werden. Alle neuen Manometergefäße werden in Deutschland hergestellt von Helmut Hanff, Seesen im Harz; oder von Braun- Melsungen; im übrigen von Aminco, Silver Springs, Maryland, USA. In den Anhängergefäßen halten Carbonat-Bicarbonat-Gemische, die in die Anhänger ge- geben werden, den Kohlensäuredruck konstant und zwar in einem Gebiet von 0,3 bis 600 mm Brodie, während sich die Zellen im Hauptraum in ihren physiologi- Einleitung 5 sehen Medien befinden und also nicht durch die Carbonatgemische, in denen sie früher suspendiert wurden, geschädigt werden können. Die Methode bedeutet die Lösung des ältesten Problems der biologischen Manometrie: mit Hilfe eines Ge- fäßes den Sauerstoffwechsel bei physiologischen Kohlensäuredrucken zu bestim- men. Sie macht die 2-Gefäß-Methode überall da überflüssig, wo die Kohlensäure nicht interessiert. Die Methode ist bereits benutzt worden, um mit einem belichteten Gefäß den Quantenbedarf der Photosynthese zu bestimmen; oder um den Sauer- stoffverbrauch von Krebszellen zu bestimmen, deren Atmung mit der 2-Gefäß- Methode wegen der großen aeroben Gärung nur ungenau bestimmt werden kann. Die neuen Wannengefäße sind Kegel, deren Einsätze nicht am Boden des Hauptraums, sondern im oberen Drittel des Hauptraums befestigt sind. Die Ein- sätze haben nicht mehr die Form von Zylindern, sondern die Form von flachen Wannen und sind mit einer Birne verbunden, aus der man Substanzen in die Wanne geben kann. Eine zweite Birne ist nicht mit der Wanne, sondern mit dem Haupt- raum verbunden. Mischen wir in der Wanne Substanzen, die neutral sind und erst beim Mischen alkalisch werden, so können wir die Kohlensäure im Manometriegef äß bestimmen. Säuern wir vorher die Zellsuspension im Hauptraum durch die zweite Birne an, und machen erst dann den Inhalt der Wanne alkalisch, so können wir die gesamte Kohlensäure im Manometriegefäß bestimmen. Mischen wir in der WTanne Sub- stanzen, die beim Zusammengeben Sauerstoff entwickeln, ohne den Kohlensäure- druck zu ändern — zum Beispiel Katalase und H2O2 — , so können wir, ohne die Gefäße zu öffnen, von anaeroben zu aeroben Bedingungen übergehen. Mischen wir in der Wanne Substanzen, die beim Zusammengeben Sauerstoff absorbieren, ohne daß die Reaktion alkalisch wird, so können wir, ohne die Gefäße zu öffnen, von aeroben zu anaeroben Bedingungen übergehen. Von den bisherigen Anwendungen der Wannengefäße seien erwähnt die Messung der Fixierung der Kohlensäure in grünen Zellen, die mit Hilfe der Wannengefäße ungleich sicherer und genauer möglich ist, als mit Hilfe der üblichen 14C-Methode. Es sei ferner erwähnt die Messung der Aufnahme von Kohlensäure in Chlorella durch Übergang von anaeroben zu aeroben Bedingungen und die Messung der Abgabe dieser Kohlensäure beim Übergang zu anaeroben Bedingungen. Es sei ferner erwähnt die Messung der Retention der Kohlensäure und der Milchsäure in einem Gefäß. III. Strahlungsmessung (Bolometer) Das Bolometer, das wir benutzen, ist in der Physikalisch-Technischen Reichsan- stalt von Lummer und von Kurlbaum entwickelt worden. Es ist ein Instrument, das eine große Vergangenheit hat, da mit ihm Lummer und Pringsheim4 die Strah- lung des schwarzen Körpers gemessen haben, in Versuchen, aus denen im gleichen Jahr Planck5 seine Strahlungsformel abgeleitet und das Wirkungsquantum h be- rechnet hat (h = 6,55 10 -7 erg sek. gegenüber dem heutigen Wert h == 6,63 10"27 erg sek.). Es ist das gleiche Instrument, mit dem Emil Warburg6 in den Jahren 1911 — 1930 die Grundlagen der quantitativen Photochemie geschaffen hat. 6 Einleitung Das Bolometer hat einen Vorzug, durch den es sich von allen anderen absoluten Strahlungsmessern auszeichnet. Läßt man einen Lichtstrahl auf die Platinstreifen des Bolometers fallen und verschiebt dann den Strahl auf der Fläche des Bolome- ters, so bleibt der elektrische Ausschlag des Bolometers konstant, während bei Verschiebungen eines Strahls auf der Fläche einer Thermosäule die Galvano- meterausschläge sich so stark ändern, daß absolute Strahlungsmessungen unmög- lich sind. Die Eichung des Bolometers haben wir vereinfacht {11), indem wir die Hefner- lampe durch die geeichte Kohlefadenlampe des Bureau of Standards in Washing- ton ersetzt haben. Verschließt man bei der Eichung das Bolometer anstatt durch ein Quarzfenster durch eine Lithium-Fluoridscheibe, so hat man keine Korrek- tionen mehr für die selektive Absorption, sondern nur noch für die Reflektion des Eichlichts anzubringen. Als Lichtquellen benutzen wir die Quecksilber- und Xenon-Hochdrucklampen der Osram A.G., oder Metallfadenlampen von 500 Watt mit kleiner leuchtender Fläche, wie sie für Kinos verwendet werden. Wir isolieren die Spektralbezirke nur noch selten mit Monochromatoren, sondern meistens mit Farbgläsern und Interferenzscheiben. Wir prüfen jeden Spektralbezirk, ehe wir ihn für Messungen der Photosynthese benutzen mit Hilfe einer Lösung von 1 mg/cm3 Äthylchloro- phyllid in Pyridin, die in einer Schichtdicke von 1 cm kein Licht durchlassen darf. Zu der Weiterentwicklung der Strahlungsmethoden (11) gehört auch die Tei- lung der Lichtstrahlen mit Prismen oder teildurchlässigen Spiegeln und die bolc- metrische Justierung der beiden Teile auf gleiche Intensität, wie es für die 2-Gefäß-Methode notwendig ist. Für die Aufnahme des blaugrünen Wirkungs- spektrums der Photosynthese ist diese Technik so ausgebaut worden, daß zu zwei roten Strahlen gleicher Intensität zwei blaugrüne Strahlen gleicher Intensität hinzugefügt werden konnten. IV. Strahlungsmessung (Quanten-Aktinometer) (4) Neben dem Bolometer benutzen wir für besondere Zwecke zur absoluten Strah- lungsmessung das von uns entwickelte Quantenaktinometer, in dem Chloro- phyllid oder Phaeophorbid Sauerstoff auf Thioharnstoff überträgt und in dem der verbrauchte Sauerstoff manometrisch gemessen wird. Liegen die in das Mano- metriegefäß eingestrahlten Quantenintensitäten unter einer gewissen Schwelle, so wird fast genau 1 Molekül Sauerstoff verbraucht, wenn 1 Lichtquantum ab- sorbiert wird. Sind geordnete Lichtstrahlen zu messen, so ist das Bolemeter dem Aktino- meter vorzuziehen. Ist aber diffuses Licht zu messen, so ist das Aktinometer vor- zuziehen. Auch die Summe nicht konstanter Lichtintensitäten kann mit dem Aktinometer gemessen werden, da das Aktinometer die eingestrahlten Lichtinten- sitäten integriert. Einleitung 7 V. Strahlungsmessung (Absorptionsmessung) (25) Von Anfang an war der schwierigste Teil der Strahlungsmessungen bei den Be- stimmungen der Ausbeute der Photosynthese die Messung der Lichtabsorption in dem trüben Medium der Zellsuspensionen. Unsere erste Lösung des Problems war, so viele Zellen in die Manometriegefäße einzufüllen, daß das eingestrahlte Licht vollständig absorbiert wurde. Damals störte dabei die große Atmung der vielen Zellen. Heute, nachdem die Atmung vor der Einstrahlung des Meßlichts (mit diffusem blaugrünem Licht) kompensiert wird, ist die große Atmung kein Einwand mehr gegen die Methode der vollständigen Absorption. Unvollständige Absorptionen haben wir zunächst mit dem Quantenaktinometer gemessen, mit dem wir das Manometriegefäß, in dem sich die Zellen befanden, umgaben. Später entwickelten wir zur Messung unvollständiger Absorptionen eine Ulbricht'sche Kugel, in deren Mittelpunkt die Manometriegefäße wie bei den Ausbeutebestimmungen bewegt und belichtet wurden. Gab der in die Oberfläche der Kugel eingebaute Elektronen-Multiplyer für weiße Zellen den Ausschlag io und für grüne Zellen den Ausschlag z, so war der von den grünen Zellen absor- bierte Bruchteil des eingestrahlten Lichts i a = — So haben wir nunmehr die Möglichkeit, sehr kleine und sehr große Lichtabsorp- tionen zu messen, also die Ausbeuten bei der Photosynthese für sehr dünne und sehr dichte Zellsuspensionen zu bestimmen. Daß wir bei 5°0 Lichtabsorption und bei 100" ,, Lichtabsorption nahezu die gleichen Quantenausbeuten fanden, mag man als eine Kontrolle unserer Methoden der Absorptionsmessung bewerten. Nach allem, was hier über Strahlungsmessungen gesagt worden ist, benötigen wir zur Messung der absorbierten Lichtenergie im allgemeinen 2 Instrumente. Ein Instrument, das die eingestrahlten Quanten mißt und ein Instrument, das den absorbierten Bruchteil der eingestrahlten Quanten mißt. Also zum Beispiel ein Bolometer und eine Ulbricht'sche Kugel. Wegen mißbräuchlicher Anwendungen des Bolometers durch Calvin und Daniels sei darauf hingewiesen, daß man das Bolometer nicht zur Messung der Absorption des Lichts benutzen kann. (34) VI. Metallo-Fermente (2) Während die Wirkung des Eisens oder des Kupfers in den sauerstoffübertragenden Fermenten durch ihren Valenzwechsel vollständig chemisch erklärt worden ist, gibt es eine zweite Art von Metallofermenten, in denen das Metall nicht durch Valenzwechsel wirkt, z. B. wenn Zink wirksam ist; oder wenn mehrere Metalle sich gegenseitig vertreten können. Ein derartiges Metalloferment ist die Hefezymo- hexase, die Hexosediphosphat in Triosephosphat spaltet und die zur Aktivierung des Zinks oder des Kobalts oder des Eisens bedarf. Unsere Methode zum Nachweis funktioneller Schwermetalle in Fermenten, die 8 Einleitung wir 1938 eingeführt haben, ist nicht die Analyse, die wegen des großen Molekular- gewichts der Fermente unsicher ist und die nichts über die Funktion aussagt; sondern die Methode ist die Entfernung der Metalle durch Dialyse gegen Kom- plexbildner, z. B. gegen Phenanthrolin und die Resynthese der Fermente durch Zusatz von Metallen. Viele funktionelle Schwermetalle sind seit 1938 mit dieser Methode gefunden worden und mehr und mehr scheint es, daß an der Wirkung der meisten Fermente Schwermetalle beteiligt sind. Die lange Polemik gegen das erste funktionelle Schwermetall, das entdeckt wurde — gegen das Eisen der Eisen- oxygenase — war offenbar eine Polemik, wie sie nicht unberechtigter sein konnte. Der chemische Mechanismus der Metallwirkungen in den Metallofermenten zweiter Art ist noch unbekannt. Es gehört zu den rätselhaften Tatsachen der Fer- mentchemie, daß von den beiden Zymohexasen, die wir kristallisiert haben, die Hefezymohexase ein Metalloferment ist, aber die Muskel-Zymohexase kein Me- talloferment ist. VII. Atmung (19) Seit die Wirkungsgruppen der oxydierenden und reduzierenden Fermente und ihre Ketten entdeckt worden sind7 [1] O2 — Eisenoxygenase - Cytochrom - - Flavin - - Nikotinsäureamid [2] O-z -> Kupferoxygenase — Orthochinon — * Nikotinsäureamid hat zur Diskussion gestanden, ob diese Ketten die vollständige Lösung des Pro- blems der biologischen Oxydation und Reduktion sind oder ob sie nur für eine be- schränkte Zahl von Substraten gelten. Denn zunächst gelang es nicht, zum Bei- spiel Fettsäuren oder die so leicht verbrennliche Essigsäure mit Hilfe der Ferment- ketten in vitro zu oxydieren. Die Antwort auf diese Frage war das Koferment A, das Lipmann8 im Jahr 1945 entdeckte und dessen Wirkungsgruppe, wie Lynen9 im Jahr 1951 fand, die SH- Gruppe ist, die organische Säuren zu Thioestern bindet und sie dadurch gegen- über den Gliedern der Fermentkette reaktionsfähig macht. Flavinproteide dehy- drieren an KoA gebundene Fettsäuren10, Pyridinproteide dehydrieren die dabei entstehende ß-Oxysäuren zu Ketonsäuren. Pyridinproteide dehydrieren die an KoA gebundene Brenztraubensäure zu Acetyl-KoA, dessen Essigsäure dann mit Oxalessigsäure zu Zitronensäure zusammentritt COOH COOH I I /OH CH3COOH + CO C< | | XCHoCOOH CH-2 CH2 COOH COOH In den Reaktionen des von H. A. Krebs11 entdeckten Zitronensäurezyklus verbrennt dann das Äquivalent der Essigsäure zu Kohlensäure und Wasser unter Rück- bildung von Oxalessigsäure. Die Fermente aber, die diese Oxydationen des Zyklus bewirken — die Oxydation der Isozitronensäure, der Ketoglutarsäure, der Bern- Einleitung 9 steinsäure und der Äpfelsäure — sind keine anderen Fermente, als die Pyridin- proteide, die Flavinproteide und die Hämoproteide. Solche Beispiele ließen sich heute beliebig vermehren. In der Tat, alle biolo- gischen Hydrierungen und Dehydrierungen, die wir kennen, werden durch Glie- der unserer Fermentketten bewirkt, die deshalb die allgemeine und vollständige Lösung des Problems der biologischen Oxydation und Reduktion gewesen sind. Fragen wir uns, warum Substrate durch die Bindung an Koferment A „akti- viert" werden, so möchte ich darauf aufmerksam machen, daß Koferment A das 3fach phosphorylierte Adenosin enthält, das auch im Triphospho-Pyridinnukleotid vorkommt und das hier die Funktion hat, das Nukleotid an die Fermentproteine zu binden; und daß allgemein Phosphat die Gruppe ist, die Substrate und Kofer- mente an die Fermentproteine bindet, wie z. B. durch einen Vergleich der Reak- tionsfähigkeiten von phosphoryliertem und nicht phosphoryliertem Glycerinal- dehyd oder von phosphoryliertem und nichtphosphoryliertem Lactoflavin gefun- den worden ist. Die Idee liegt deshalb nahe, die Bindung an Koferment A als eine Phosphorylierung aufzufassen, die zwar nicht direkt, aber über die Panthotein- brücke hinweg erfolgt. Dazu stimmt, daß Substrate wie Glukosephosphat oder Triosephosphat, die bereits phosphoryliert sind, der Bindung an Koferment A nicht bedürfen. Andererseits ist es wahr, daß es nichtphosphorylierte Substrate gibt, wie Acetaldehyd und Brenztraubensäure, die ohne Vermittlung von Kofer- ment A an Fermentproteine gebunden und hier von Nikotinsäureamid hydriert werden. Ein wesentlicher Fortschritt (13) (24) (25) (26) auf dem Gebiet der Atmung war die Kristallisation der prosthetischen Gruppe der Eisenoxygenase, des „Cyto- hämins", womit die Substanz, die in der organischen Welt im wesentlichen den Sauerstoff überträgt, nunmehr auch chemisch isoliert und der chemischen Unter- suchung zugänglich geworden war. Cytohämin enthält wie das Bluthämin 2 Pro- pionsäuren, aber anders als das Bluthämin eine Formylgruppe und dafür eine Vinylgruppe weniger. Cytohämin enthält ferner, anders als das Bluthämin, eine Seitenkette vom Molekulargewicht der Größenordnung 200, die gegenüber dem Bluthämin den niedrigeren Eisen- und Stickstoffgehalt bedingt. Ein Vergleich der Elementaranalysen der beiden Chlorferriverbindungen ergab die Prozente : C H N Fe Cl Cytohämin 64,47 6,79 6,50 6,42 4,20 Bluthämin 62,63 4,94 8,59 8,40 5,43 Cytohämin liefert bei der Resorcinschmelze ein schön kristallisierendes „Deu- terohämin", das 3 freie //-Stellen besitzt. S. F. MacDonald12, ein Schüler Hans Fischers, der die weitere Bearbeitung dieser wichtigen Substanz übernommen hat, fand für die Konstitution des „Cyto-Deuterohämins" 10 Einleitung CH3 H CH.s H H Propionsäure Propionsäure CH3 Noch wenig bekannt ist über die Konstitution des Chinons der Fermentkette 2. Zur Diskussion steht, zum mindesten für Pflanzen, die dehydrierte Chlorogen- säure, die ein Ester der 3,4-Dioxyzimmtsäure mit Chinasäure ist. Martius13 hat die Vermutung ausgesprochen, daß Naphtochinon-Proteide allgemein Glieder der Fermentketten sind. VIII. Gärung (2) Wenn Arthur Harden14 recht hat, daß die Oxydo-Reduktion der Gärungen die fundamentale Reaktion der Gärungen ist, weil sich in ihr der Sinn der Gärun- gen erfüllt, so ist 1939 das Jahr gewesen, in dem der chemische Mechanismus der Gärungen aufgeklärt worden ist. Denn damals15 wurden im Dahlem die chemi- schen Reaktionen gefunden, durch die Triosephosphat zu Brenztraubensäure oxydiert und Brenztraubensäure zu Milchsäure reduziert wird : (I) 3-Phosphoglycerinaldehyd -f H3PO4 — 1,3-Diphosphoglycerinaldehyd (II) 1,3-Diphosphoglycerinaldehyd - DPN == 1,3-Diphospho-Glycerinsäure - DPNHL> (III) 3-Phosphoglycerinaldehyd + H3PO4 + DPN = (Bilanz) 1,3-Diphosphoglycerinsäure :- DPNH2 1,3-Diphosphoglycerinsäure wird dann durch A.D.P. zu Brenztraubensäure dephosphoryliert und die Brenztraubensäure wird durch das D.P.N.H2, das in Reaktion II entstanden ist, zu Milchsäure hydriert. Alle diese Reaktionen ver- laufen in vitro beim Zusammengeben der reinen Substrate und kristallisierten Fermente. Nur der 1,3-Diphosphoglycerinaldehyd war damals von uns nicht isoliert wor- den, da er in wässriger Lösung fast vollständig zu 3-Phosphoglycerinaldehyd und H3PO4 hydrolysiert ist. So war in dem ganzen chemischen Mechanismus der Gärungen im Jahr 1939 noch eine einzige Substanz übrig, über die zu streiten eine Möglichkeit bestand. So entstand jene lange Polemik gegen den 1,3-Diphosphoglycerinaldehyd, die von Meyerhof im Jahr 1943 eröffnet wurde und dem Lipmann und viele nicht minder hervorragende Biochemiker folgten. Weil es um den Schlußstrich unter ein lOOj ähriges Problem der Biochemie, um den Mechanismus der Gärungen ging, sei der Verlauf dieser Polemik hier beschrieben. Die zu erklärende Tatsache war, daß der 3-Phosphoglycerinaldehyd nur bei Gegenwart von Phosphat dehydriert wurde und daß nach der Dehydrierung die aufgenommene Phosphorsäure in der 1 -Stellung des 3-Phosphoglycerinsäure wiedergefunden wurde. Niemand konnte hier etwas anderes annehmen, als daß der Aldehyd zunächst in 1 -Stellung phosphoryliert wurde Einleitung 11 R R i /H I /H CC - H3PO4 ^ CT OH X° X>P03H2 und daß dann die Aldehydgruppe durch D.P.N. zur Carboxylgruppe dehydriert wurde. Diese Auffassung lag uns besonders nahe, da wir früher in rein chemischen Versuchen gefunden hatten16, daß die Aldehydgruppe des Glycerinaldehyds durch Zusatz von Phosphat (ohne Zusatz von Fermenten) zu der neutralen wässrigen Lösung so aktiviert wird, daß sie von molekularem Sauerstoff zur Carboxylgruppe oxydiert wird. Dorothy Needham17 fügte später die Beobachtung hinzu, daß dabei D.P.N. den Sauerstoff ersetzen kann. Tatsächlich geht also das chemische Modell soweit, daß D.P.N. Glycerinaldehyd dehydriert, wenn man der neutralen wässrigen Lösung Phosphat aber keine Fermente zusetzt. Demgegenüber wiesen die Polemiker auf die Möglichkeit hin, daß bei der bio- logischen Dehydrierung durch D.P.N., anders als bei der chemischen Dehydrie- rung, der 3-Phosphoglycerinaldehyd zuerst an das Fermentprotein gebunden und in dieser Bindung durch D.P.N. dehydriert werde; und daß erst dann die Phos- phorsäure eingreife und das Protein von der Glycerinsäure verdränge, durch einen Vorgang, der als „Phosphorolyse" bezeichnet wurde. Indessen gab es ein entscheidendes Experiment. Wenn die Theorie der Phos- phorolyse richtig war, so mußte die Anfangsgeschwindigkeit der Dehydrierung unabhängig von der Phosphatkonzentration sein, während nach unsern Gleichun- gen der Phosphateinfluß von Anfang an vorhanden sein mußte. Das Experiment ergab, daß die Anfangsgeschwindigkeit von der Phosphatkonzentration abhängt, wie es unsere Gleichungen verlangen. So wurde 1957 der Schlußstrich unter das Problem des chemischen Mechanis- mus der Gärungen gezogen. (23) (24). IX. Krebszellen Der wesentlichste Fortschritt auf diesem Gebiet seit 1945 war der Übergang von Tumoren zu Einzel-Zellen. 1. Ascites-Krebszellen (17, 22, 35, 58). Unser erstes Einzellen-Material waren die Zellen des Ehrlichschen Ascites- Krebses der Mäuse, die man in großen Mengen als beständige, gut zentrifugierbare und fast reine Krebszellensuspensionen gewinnen kann. Ursprungsgewebe, Binde- gewebe und Nekrosen waren nunmehr keine Fehlerquellen mehr bei Stoffwechsel- messungen und die Gärungsgrößen stiegen auf das 2- bis 3fache der früher für die reinsten Tumoren gefundenen Werte. Erst jetzt konnte die 2-Gefäß-Methode, die qualitativ und quantitativ gleiches Zellmaterial in beiden Gefäßen verlangt, ein- wandfrei auf Krebszellen angewandt werden; erst jetzt konnte mit Krebszellen quantitativ experimentiert werden. Es war ein Fortschritt wie in der Chemie der Übergang von Gemischen zu chemisch reinen Substanzen. 12 Einleitung 2. Earle- Zellen. Krebszellen als Suspensionen von Einzelzellen werden auch erhalten bei der Methode von W. Earle, der tierische Zellen in großen Flaschen jahrelang auf der Schüttelmaschine schüttelt und dabei, wie schon vor ihm Goldblatt und Came- ron mit der alten Carell-Methode, normale Zellen in Krebszellen umwandeln kann. Von besonderem Interesse für Stoffwechselversuche waren 2 Linien von Krebs- zellen, die Earle aus einer einzigen normalen Zelle gezüchtet hatte und die sich spontan in 2 Linien von hoher und niedriger Virulenz getrennt hatten. Dean Burk und seine Mitarbeiter Wood, Hunter und Hobby haben den Stoffwechsel dieser beiden Linien gemessen und haben für die hochvirulente Linie eine hohe Gärung und eine kleine Atmung, für die niedrig-virulente Linie eine kleine Gä- rung und eine große Atmung gefunden. Wer bisher an der Bedeutung der Gärung der Tumoren gezweifelt hatte, konnte es von nun an nicht mehr tun (36). 3. Zellen nach Dulbecco-Vogt. Die schnellste Methode, wachstumsfähige Körperzellen in großen Mengen als Einzelzellen zu gewinnen, ist die Methode von Dulbecco-Vogt, bei der tierische Gewebe mit einer verdünnten Trypsinlösung zerteilt werden. Wir haben den Stoffwechsel derartiger Zellsuspensionen sofort nach der Zer- teilung und nach dem Wachstum in vitro gemessen und haben für Nierenzellen von Kaninchen und Embryonen von Hühnern gefunden, daß der vorher rein aerobe Stoffwechsel beim Wachstum in vitro in den Gärungsstoffwechsel der Krebszellen umschlägt. Dabei vollzieht sich der Umschlag besonders schnell in den embryonalen Zellen, aus deren Stoffwechsel im Verlauf von 1 bis 2 Zell- teilungen der voll ausgebildete Stoffwechsel der Krebszellen entsteht : eine große anaerobe Gärung, eine kleine Atmung und folglich eine große aerobe Gärung. Da ein großer Teil der Einsaat in den Petrischaalen bei der in vitro-Kultur an- wächst und da der Stoffwechsel nach wenigen Zellteilungen umgeschlagen ist, so muß nunmehr die Theorie der Krebsentstehung durch Selection, an die wir alle lange Jahre glaubten, durchaus und in jeder Form aufgegeben werden. Wir er- klären diese Bereitschaft zur Anaerobiose durch die lange anaerobe Vergangen- heit des Lebens, die offenbar von den Genen noch nicht vergessen ist (59, 61, 63, 67, 71).* Die anaerobe Vergangenheit des Lebens erklärt vielleicht auch die bisher rätselhafte anaerobe Gärung der embryonalen Zellen, die bald nach der Gärung der Krebszellen gefunden worden ist und die keinen physiologischen Sinn hat, * Zusatz 1961. Inzwischen haben wir gefunden, daß der Krebsstoffwechsel in vitro durch eine Substanz erzeugt wird, die das zugesetzte Kälberserum enthält und die ihm durch Aluminiumhydroxyd entzogen werden kann. In der Tat kann man nunmehr die embryonalen Zellen in vitro ohne Gärung oder mit Gärung wachsen lassen, je nachdem man das Serum mit Aluminiumhydroxyd behandelt oder nicht behandelt. Einleitung 13 da die große Atmung der embryonalen Zellen die anaerobe Gärung im Körper immer zum Verschwinden bringt. Es ist die auffallendste Eigenschaft dieser „latenten" Gärung, daß sie am An- fang der Entwicklung besonders groß ist und dann schnell abfällt, zum Beispiel in wenigen Tagen auf x/4 des Anfangswerts. Dieses ist das zeitliche Verhalten von Eigenschaften, die in der Phylogenese notwendig waren, aber später überflüssig geworden sind. X. Wirkung der Röntgenstrahlen auf Krebszellen Bestrahlt man unter sonst gleichen Bedingungen Krebszellen und embryonale Zellen mit Röntgenstrahlen und mißt die von den Strahlen bewirkte Abnahme des Stoffwechsels, so findet man, daß der Stoffwechsel der Krebszellen stärker ab- nimmt, als der Stoffwechsel der embryonalen Zellen. Da Krebszellen weniger Kata- lase enthalten als normale Zellen und da Röntgenstrahlen in wäßrigen Flüssigkeiten Wasserstoffperoxyd erzeugen, lag die Idee nahe, die Wirkung der Röntgenstrahlen auf den Stoffwechsel als eine Vergiftung durch Wasserstoffperoxyd aufzufassen. Zur Prüfung dieser Idee entwickelten wir, in Analogie zu unserm Aktinometer für das sichtbare Licht, das manometrische Röntgenaktinometer, in dem zunächst die zu prüfenden Zellen geschüttelt und bestrahlt werden und in dem dann unter den gleichen Bedingungen eine Fricke'sche Ferrosulfatlösung geschüttelt und be- strahlt wird, deren Ferro-Eisen durch die Bestrahlung in Ferri-Eisen übergeht. Wurde in jedem Versuch neben dem Stoffwechsel die oxydierte Eisenmenge be- stimmt, so war, trotz komplizierter geometrischer Bedingungen, in jedem Versuch die wirksame Röntgendosis bekannt. Um den Zusammenhang zwischen Strahlenwirkung und Wasserstoffperoxyd zu finden, setzten wir bei der Bestrahlung Katalase zu den Zellen und fanden dann eine geringere Strahlenwirkung. Oder, noch besser, wir bestrahlten zunächst die Lösungen ohne Zellen, gaben dann Katalase zu den bestrahlten Lösungen und setzten erst dann die Zellen zu. Wir fanden, daß die bestrahlten Lösungen die Gärung von Krebszellen fast wie die Bestrahlung verminderten; daß aber nach Zusatz von Katalase zu der bestrahlten Lösung die bestrahlten Lösungen nicht mehr auf die Gärung von Krebszellen wirkten. Aus solchen Versuchen, die auch auf die Methämoglobinbildung durch Rönt- genstrahlen ausgedehnt wurden, ergab sich, daß bei der Bestrahlung verdünnter Suspensionen von Krebszellen die Gärung im wesentlichen durch das gebildete Wasserstoffperoxyd gehemmt wird und nicht durch die H Atome und OH Radi- kale, die nach Joseph Weiß die primären Spaltungsprodukte des Wassers sind. Die Reaktionen, in denen Wasserstoffperoxyd bei der Bestrahlung gebildet wird 2 OH = H202 2 H + O2 = H2O2 gehen also offenbar unter unsern Versuchsbedingungen schneller, als Reaktionen von H und OH mit den Gärungs-Fermenten. 14 Einleitung XI. Photosynthese* 1. Versuchsmaterial . Seit 1956 züchten wir Chlorella für Ausbeutebestimmungen nicht mehr in kon- tinuierlichem Licht, sondern in fluktuierendem Licht, dessen Hell- und Dunkel- perioden dem Tag, der Nacht und den Dämmerungen entsprechen. Vor allem hierdurch, aber auch noch durch andere Maßnahmen sind die guten Quanten- ausbeuten zu jeder Zeit reproduzierbar geworden, während früher Einflüsse von dunkler oder heller Jahreszeit, Züchtung an Nord- oder Südfenstern usw. die Quantenausbeuten zu beeinflussen schienen. Diese Methode der Züchtung der Versuchszellen ist also von entscheidender Bedeutung für die Ausnutzung des Lichts in Chlorella. 2. Blaugrünes Licht. 1955 entdeckten wir, daß blaugrünes Licht bei der Photosynthese katalytisch wirkt. Andere sehr reine Spektralbezirke des sichtbaren Lichts sind ohne Zusatz kleiner Intensitäten von blaugrünem Licht bei der Photosynthese von Chlorella nicht oder nur sehr schlecht wirksam. Immer ist seitdem bei Messungen des Quantenbedarfs blaugrünes Licht zugesetzt worden. Das Wirkungsspektrum des blaugrünen Lichts, ergab ein Maximum um 458 m// und ist wahrscheinlich das Absorptionsspektrum eines Ferments. Methodisch ge- hört die Bestimmung dieses Wirkungsspektrums zu den physikalisch schwierigeren Aufgaben, da sie die 2-Teilung von 2 verschiedenfarbigen Strahlen und also die bolometrische Justierung von 4 Strahlen für jeden Punkt des Wirkungsspektrums erfordert, was nur in einem hochentwickelten Strahlungslaboratorium durchführ- bar ist. 3. Quantenbedarf der Photosynthese in Chlorella. Bei einer Neubestimmung des Quantenbedarfs der Photosynthese im Jahr 1960 ist die Weiterentwicklung der Zellzüchtung, der Strahlungs- und Absorptions- messung, der Manometrie sowie die Notwendigkeit des blaugrünen Lichts kleiner Intensitäten berücksichtigt worden. Tatsächlich ist von den alten Methoden aus der Zeit vor 1945 nicht mehr viel übrig geblieben. Vor allem sind die Versuchs- zeiten und damit die manometrischen Ausschläge, die fast ganz im positiven Druck- gebiet liegen, nunmehr beliebig groß. Zudem hat man die Wahl zwischen der 2-Gefäß-Methode — falls man über die Einrichtungen zur Teilung der Licht- strahlen verfügt — oder einer sehr einfachen 1 -Gefäß-Methode, bei der die * Zusatz 1961. 1960 erschien in den American Lecture Series (C. C. Thomas, Springfield, 111.) "Problems in Photosynthesis" von W. Bladergroen. Seit vielen Jahrzehnten ist dies die erste konstruktive Darstellung des Gebiets. Es ist keine Reportage über Theorien, sondern eine Beschreibung von Experimenten und Methoden. Einleitung 15 Kohlensäuredrucke durch räumlich von den Zellen getrennte Karbonatgemische konstant gehalten werden. Zum Beispiel fanden wir für Chlorella*, wenn das Meßlicht rot und die Atmung mit blaugrünem Licht kompensiert war, mit Hilfe der neuen 1- Gefäß-Methode (vergl. Seite 582): CO-Druck [mm Brodie] 1 Quanten <P Oo 8 31 75 140 202 21 6,9 3,6 2,83 2,75 Man beachte, wie wesentlich sich der Quantenbedarf mit dem Druck der Koh- lensäure ändert und daß erst oberhalb eines Kohlensäuredrucks von 200 mm Bro- die der Grenzwert des Quantenbedarfs erreicht ist, der beträgt : = 2,75 <P Quanten Oo Es ist sehr nahe der energetisch mögliche Grenzwert, wenn die molare Spaltungs- energie der Kohlensäure 112000 cal beträgt; und es ist sehr nahe der Grenzwert, den wir mit der 2-Gefäß-Methode finden, was selbstverständlich erscheinen mag, aber wegen einer unsachverständigen Kritik der 2-Gefäß-Methode hier erwähnt werden mag. Da im ganzen sichtbaren Spektralgebiet gleichviele vom Chlorophyll absor- bierte Lichtquanten gleichviel Sauerstoff entwickeln, so können wir nunmehr den Energieumsatz im sichtbaren Licht hinschreiben, wenn wir mit einer molaren Spaltungsenergie der Kohlensäure von 112000 cal rechnen: Wellenlänge des Lichts Energie-Umsatz [m/t] 436 546 680 Chem. Energie-Gewinn Abs. Lichtenergie 112000 2,75 x 65 000 112000 2,75 x 52000 112000 2,75 x 42000 X 100 = 62% 100 = 78% 100 = 96% Historisch ist es von Interesse, daß die Quantenausbeute bei einem Kohlen- säuredruck von 20 mm Brodie nur einen kleinen Teil der maximalen Quanten- * Zusatz September 1961. In der Zwischenzeit ist bestätigt worden, daß der Quantenbedarf von Blättern viel größer ist, nämlich 15 bis 20 pro Molekül Sauer- stoff (vergl. Seite 542). Wenn der Mechanismus der Photosynthese in Blättern der gleiche ist, wie in Chlorella, so reagiert also in Blättern ein viel größerer Bruchteil des primär entwickelten Sauerstoffs zurück. 16 Einleitung ausbeute beträgt. 20 mm Brodie aber ist der Kohlensäuredruck gewesen, bei dem Emerson vor 20 Jahren den Quantenbedarf der Photosynthese bestimmte und einen Quantenbedarf von 10 bis 20 pro Molekül Sauerstoff fand. Emerson fügte die durch nichts begründete Behauptung hinzu, die bei dem Kohlensäuredruck von 20 mm Brodie gefundene Ausbeute sei die maximal mögliche Ausbeute, obwohl doch Chlorella nach unseren Vorschriften, die er befolgte, bei einem Kohlen- säuredruck von 500 mm Brodie gezüchtet worden war. Wahrscheinlich hätte niemand die Behauptung von Emerson ernst genommen, wenn nicht Franck und Gaffron18 mit einer eigenen Thermodynamik bewiesen hätten, daß die von Emerson bei 20 mm Brodie gefundene Ausbeute tatsächlich die maximal mögliche sei. Im Jahr 1949 bestimmte ich in Bethesda (U.S.A.) mit Dean Burk und mehreren amerikanischen Kollegen die Quantenausbeute bei einem Kohlensäuredruck von 500 mm Brodie mit der neuentwickelten Kompensationsmethode. In Überein- stimmung mit den früheren Dahlemer Versuchen wurde in langen Versuchsreihen ein Quantenbedarf von unter 4 gefunden (5, 6, 8). Trotzdem blieben Franck und Gaffron, unterstützt durch Eugene Rabino- witsch, bei ihrer Thermodynamik und machen nunmehr seit 20 Jahren, ohne selbst Experimente zur Energetik der Photosynthese beizutragen, für die Behaup- tungen Emersons Propaganda. 4. 1-Ouantenreaktion. Wenn wir das Ergebnis unserer Ausbeutebestimmungen in die Gleichung H2CO3 + 2,75 h • v = CHoO + 02 zusammenfassen, so ist klar, daß dies keine chemische Reaktionsgleichung, son- dern nur eine Bilanz mehrerer Reaktionen sein kann. Denn die Photochemie kennt keine Mehrquanten-Reaktionen und alle photochemischen Vorgänge, ob bio- logische oder nichtbiologische, sind so lange problematisch, als die zugrunde liegende 1 -Quantenreaktion nicht gefunden worden ist. Dean Burk und der Verfasser haben im Jahr 1950 in Dahlem die 1 -Quanten- reaktion der Photosynthese gefunden, eine Reaktion, bei der 1 Lichtquantum 1 Molekül Sauerstoff entwickelt: XO2 + 1 h • v = X + 0-2 wo XO2 die Substanz ist, aus der sich der Sauerstoff entwickelt. Offenbar kann XO2 nicht Kohlensäure sein, da man mehrere Quanten des sichtbaren Licht braucht, um den Sauerstoff aus der Kohlensäure zu entwickeln. Der Weg, auf dem die 1 -Quantenreaktion entdeckt wurde, sei hier kurz be- schrieben. Als wir bei Ausbeute-Bestimmungen mit Chlorella die Ausbeute in der üblichen Weise aus der Differenz der manometrischen Ausschläge im Hellen und im Dunkeln berechneten, zeigte sich, daß wir um so bessere Ausbeuten erhielten, je kürzer die Perioden waren, in denen Hell- und Dunkel-Perioden aufeinander folgten, bis bei einer Folge von 1 Minute hell und 1 Minute dunkel ein Grenzwert der Ausbeute erreicht wurde, der sich bei weiterer Verkürzung der Hell- und Einleitung 17 Dunkel-Perioden nicht mehr änderte. Dann entwickelte 1 Lichtquantum 1 Mole- kül Sauerstoff. Bei derartigen Versuchen beobachteten wir ferner, daß bei der Verkürzung der Hell- und Dunkel-Perioden nicht nur die Sauerstoffentwicklung im Licht, son- dern auch der Sauerstoffverbrauch im Dunkeln größer und größer wurde. So wurde zu der Entdeckung der 1 -Quantenreaktion eine zweite Entdeckung hinzu- gefügt, die die energetische und chemische Erklärung der 1 -Quantenreaktion an- bahnte: daß das Substrat XO2 der 1 -Quantenreaktion durch eine Dunkelreaktion entsteht, bei der Extrasauerstoff verbraucht wird. Viele günstige Umstände waren es, denen diese Entdeckungen zu verdanken sind, in erster Linie der hohe Kohlensäuredruck, der 10" 0 einer Atmosphäre be- trug*. Hätte der Kohlensäuredruck nur 2% einer Atmosphäre betragen, so wäre die 1 -Quantenreaktion nicht entdeckt worden. Zu den günstigen Umständen ge- hörte ferner der Ersatz des Nitrats durch Ammoniumchlorid in der Suspensions- flüssigkeit der Chlorella; es gehörten ferner große Zellmengen in den Mano- metriegefäßen dazu, da die 1 -Quantenreaktion keine kataly tische, sondern eine stöchiometrische Zellreaktion ist; und es gehörte eine vollkommen entwickelte 2 -Gefäß -Methode dazu, mit der man den Sauerstoffwechsel in 1 Minute noch hin- reichend genau messen konnte. Wie auf andern Gebieten der Zellphysiologie, so war es auch hier die 2-Gefäß-Methode, mit der die entscheidenden Entdeckungen gemacht worden sind. Später sind die Methoden zur Messung der 1 -Quantenreaktion vereinfacht und verbessert worden. Alle Ergebnisse der ersten Arbeit, Experimente und Schluß- folgerungen, sind im Lauf der Jahre mit denneuen Methoden bestätigt worden (47). 5. Wasser als Photolyt der Photosynthese ? Die Theorie, daß die Photosynthese eine Photolyse des Wassers ist, stammt von Isotopenversuchen mit Chlorella, bei denen der Sauerstoff des Wassers markiert, aber der Sauerstoff der Kohlensäure nicht markiert war; und bei denen sich zeigte, daß der im Licht entwickelte Sauerstoff teilweise markiert war. Wegen der schnel- len Hydratisierung der Kohlensäure in Chlorella beweisen jedoch diese Versuche in keiner Weise die Photolyse des Wassers. Später glaubte R. Hill, die Photolyse des Wassers bewiesen zu haben, als er fand, daß Ferrioxalat aus Chloroplasten, ohne Zufuhr von Kohlensäure, Sauerstoff entwickelt. Da jedoch Ferrioxalat im Licht Kohlensäure entwickelt und da auch sonst bei den Versuchen Hills die Kohlensäure nicht ausgeschlossen war, bewie- sen auch die Versuche von Hill die Wasserphotolyse nicht. Tatsächlich war lange Zeit, von 1944 bis 1958, die einzige Stütze der Wasser- photolyse unsere Arbeit von 194419, in der gezeigt wurde, daß Chinon aus sorg- * Zusatz 1961. Da nur bei hohen COL>-Drucken Chlorella mit dem Photolyten gesättigt ist; und da man die Quantenausbeute 1 nur finden kann, wenn Chlorella mit dem Photolyten gesättigt ist. Denn nur aus Chlorophyll, das mit dem Photo- lyten verbunden ist, kann absorbiertes Licht 0_> entwickeln. 2 Warburg, Zellphysiologie 18 Einleitung fältig mit Wasser ausgewaschenen grünen Grana im Licht Sauerstoff entwickelt nach der Gleichung 2 Chinon + 2 Ha0 = 2 Hydrochinon A 0a Hier schien der Weg über die Kohlensäure noch besser als durch Waschen der Grana dadurch ausgeschlossen zu sein, daß die Grana nicht imstande waren, aus zugesetzter Kohlensäure Sauerstoff zu entwickeln. Bei einer genaueren Untersuchung der Chinonreaktionen mit neuen Methoden in den Jahren 1959 und 1960 fanden wir jedoch, daß Kohlensäure für den Ablauf der Chinonreaktionen notwendig ist, allerdings nur sehr wenig Kohlensäure, da die Kohlensäure bei den Chinonreaktionen nicht stöchiometrisch, sondern kata- lytisch wirkt. Tatsächlich unterscheiden sich die Chinonreaktionen von der Photo- synthese in ihrem Verhalten gegenüber Kohlensäure nur dadurch, daß bei den Chinonreaktionen die reduzierte Kohlensäure durch überschüssiges Chinon immer wieder vollständig zu Kohlensäure zurückoxydiert wird, während bei der Photo- synthese ein Teil der reduzierten Kohlensäure als „fixierte Kohlensäure" übrig bleibt. So war 1960 die einzige Stütze der Wasserphotolyse gefallen und mit ihr das ganze Gebäude der Theorien, deren Fundament die Photolyse des Wassers gewesen war. Insbesondere haben wir es nie ernst genommen, daß die von uns entdeckte20 Reduktion der Phosphoglycerinsäure durch Dihydro-Nikotinsäureamid diejenige Reaktion sein sollte, durch die die Kohlensäure bei der Photosynthese reduziert wird. Das Auftreten der Phosphoglycerinsäure in den Radiogrammen nach Be- lichtung war hinreichend erklärt durch die lichtinduzierte Atmung. 6. Der Photolyt der Photosynthese Schüttelt man Chlorella aerob und im Dunkeln mit Kohlensäure, so wird Kohlen- säure chemisch gebunden. Belichtet man nach Beendigung der Kohlensäureauf- nahme, so verschwindet die aufgenommene Kohlensäure unter Entwicklung von Sauerstoff, bis Zersetzung und Aufnahme von Kohlensäure sich das Gleichgewicht halten und die Photosynthese stationär geworden ist. Die im Dunkeln sich anhäu- fende Kohlensäureverbindung, aus der der Sauerstoff entwickelt wird, nennen wir den Photolyten der Photosynthese. Die Konzentration des Photolyten, die man in Chlorella maximal erreichen kann, hängt von dem Druck der Kohlensäure und der Zucht der Zellen ab. In den A-Zellen, die im Licht die besten Quantenausbeuten geben, ist die Sättigung mit dem Photolyten bei einem Kohlensäuredruck von 10 bis 20° ,, einer Atmosphäre erreicht. Dann ist die Photolytkonzentration in der Regel gleich der Chlorophyll- konzentration. Der Photolyt bildet sich nur unter aeroben Bedingungen, wenn die Zellen atmen, und zerfällt unter Abspaltung von Kohlensäure, wenn man den Zellen den Sauerstoff entzieht. Die Bildung des Photolyten wird gehemmt, wenn man die Zellen in Arseniat anstatt in Phosphat suspendiert, steigt aber wieder auf den Normalwert, wenn man zu der Arseniatlösung Phosphat zusetzt. Einleitung 19 Der Gehalt an Photolyt steht zu dem Gehalt an Glutaminsäure in einer nahen Beziehung. Läßt man in der lebenden Chlorella die Glutaminsäure zu y-Amino- buttersäure und Kohlensäure zerfallen, so zerfällt auch der Photolyt unter Ent- wicklung von Kohlensäure; mit der Re- Synthese der Glutaminsäure in der leben- den Chlorella wird auch der Photolyt zurückgebildet. In den A-Zellen, die im Licht die besten Quantenausbeuten geben, findet man in der Regel, daß die Photolytkonzentration gleich der Glutaminsäurekonzentration ist. Alle die erwähnten Reaktionen der Bildung und des Zerfalls des Photolyten sind sehr schnelle Reaktionen, sie sind Teilreaktionen im Mechanismus der Photosyn- these und haben mit den langsamen Reaktionen der Proteinsynthese, den Umami- nierungen usw., nichts zu tun. Zum Beispiel beträgt die Kalbwertszeit der Bildung des Photolyten beim Wechsel von anaeroben zu aeroben Bedingungen bei 20° 5 Minuten. Wahrscheinlich ist die erste Reaktion bei der Bildung des Photolyten die rever- sible Phosphorylierung der Kohlensäure durch das A.T.P. der Atmung H2C03 - ATP # HCO3H2PO3 -f ADP eine Reaktion, die die Abhängigkeit vom Kohlensäuredruck und von der Atmung erklärt. Das gebildete Carboxyphosphat reagiert dann reversibel mit der Glutamin- säure, die entstandene Glutaminsäureverbindung reagiert reversibel mit dem Chlorophyll (vergl. Seite 567 und 627). 7. Die lichtinduzierte Atmung der Grana Von den Eigenschaften der Grana seien hier die folgenden hervorgehoben: 1 . Grana aus Blättern oder durch Beschallung von Chlorella gewonnen, haben keine Dunkelatmung. 2. Grana sind unfähig, im Licht reduzierte Kohlensäure zu fixieren. 3. Die SauerstofTentwicklung aus belichteten Grana wird durch Blausäure nicht gehemmt. Es sei hinzugefügt, daß die Atmung der Chlorelle sehr leicht, zum Beispiel durch wenig Chinon, zerstört werden kann und daß Chlorella dann folgende Eigenschaf- ten der Grana annimmt : daß sie zwar im Licht noch Sauerstoff entwickeln kann, aber unfähig zur Fixierung reduzierter Kohlensäure und unfähig zur Blausäure- hemmung wird. Es war das Hauptproblem der Granareaktionen, wie es energetisch möglich ist, daß die Grana aus Kohlensäure Sauerstoff entwickeln, obwohl ihnen doch keine Atmungsenergie zur Umwandlung der Kohlensäure in den Photolyten zur Ver- fügung zu stehen scheint. Die Antwort ist, daß die Grana zwar keine Dunkelat- mung haben, daß sie aber eine durch Licht induzierte Atmung haben. Ist Chinon — ein natürliches oder ein zugesetztes Chinon — der Oxydations- katalysator, so sind die Gleichungen der lichtinduzierten Atmung: 20 Einleitung 2 Chinon + 2 H20 + C = 2 Hydrochinon + C02 [1] 02 + 2 Hydrochinon = 2 Chinon - 2 H20 [2] Bilanz C + 02 = C02 [3] Licht CQ2 = C - Q2 [4] Bilanz 0 = 0 [5] Wie aber kann man, unter den Umständen dieser Bilanz, die lichtinduzierte Atmung der Grana nachweisen und messen ? Im Dunkeln kann man sie nicht nach- weisen, da sie im Dunkeln nicht vor sich geht. Im Licht kann man sie nicht nach- weisen, da die gebildete Atmungskohlensäure im Licht gemäß Gleichung [4] in C + O2 gespalten wird. Trotzdem ist es gelungen, die lichtinduzierte Atmung zu messen. Gibt man nämlich soviel Blausäure zu den belichteten Granasuspensionen, daß die Katalase der Grana gehemmt wird, so wird nunmehr in Reaktion [2] die doppelte Menge Sauerstoff verbraucht : 2 02-2 Hydrochinon = 2 Chinon + 2 H202 und für jedes Molekül Sauerstoff, das im Licht entwickelt wird, entstehen 2 Mole- küle Wasserstoffperoxyd. Dann wird die Bilanz von [1] bis [5] nicht Null, sondern Siewird: 02 + 2 H20 = 2 H202 so daß man nunmehr die lichtinduzierte Atmung der Grana durch Verbrauch von Sauerstoff und Bildung von Wasserstoffperoxyd messen kann — eine Methode, die man dem glücklichen Umstand verdankt, daß die Sauerstoffentwicklung in den belichteten Grana durch Blausäure nicht gehemmt wird. Dies ist die Methode, mit der die lichtinduzierte Atmung der Grana entdeckt worden ist und mit der bewiesen worden ist, daß auch in den Grana die Sauer- stoffentwicklung aus Kohlensäure quantitativ mit Oxydationsprozessen gekoppelt ist. Das Energieproblem der Granareaktionen war damit gelöst. Die Entdeckung der lichtinduzierten Atmung erlaubt es nun auch, die Nicht- fixierung der reduzierten Kohlensäure bei den Granareaktionen in einfacher Weise zu erklären. Man braucht nur anzunehmen, daß in den Grana die Oxydation der reduzierten Kohlensäure schneller geht als die Reduktion der Kohlensäure, wäh- rend in Zellen die Reduktion schneller geht als die Oxydation, und man versteht, warum in Zellen, aber nicht in Grana, beim Verdunkeln reduzierte Kohlensäure übrig bleibt, das heißt, warum in den Zellen aber nicht in den Grana Kohlensäure fixiert wird. Introduction* Motto: «De fixer les objets longtemps sans etre fatigue.» General remarks about our methods and their applications As a co-worker of Emil Fischer, I prepared the first optically active peptides in the years from 1903 to 1906, and thereby, as one who belonged to the inner circle of his co-workers, I came to know the methods and experimental techniques of this greatest organic chemist of our times. Later on I began work on the quan- tum requirement of photosynthesis in the radiation laboratory of the Physikalisch- Technische Reichsanstalt, where my father Emil Warburg was president from 1906 to 1922. From the experiments of this laboratory, Max Planck derived his law of radiation and calculated "the quantum of action", h = 6.55 • 10~2T erg ■ sec. In the same laboratory Emil Warburg measured the first quantum yields of photochemical reactions. Thus it came about that in the Kaiser- Wilhelm- Institut für Zellphysiologie the methods of two widely separated fields, those of radiation physics and organic chemistry, were united in one hand. The result was the elucidation of the chemical mechanism of enzyme action — the very fast intermediate reactions of protein- bound active groups, that we were able to separate from the enzymes and to cry- stallize. Coenzymes and many vitamins proved to be nothing eise than free active groups of enzymes. Here are some examples to illustrate the interplay of physical and chemical methods that is characteristic of our institute. By the methods of radiation physics the substance was discovered, that reacts in the living world with the molecular oxygen. By the methods of organic chemistry this substance which is an iron Compound was isolated and crystallized. — By the methods of radiation physics the acting groups of the hydrogen-transferring enzy- mes were discovered, by the methods of organic chemistry these acting groups were separated and crystallized. — From the interaction of the oxygen- and hydrogen- transferring enzymes resulted the respiratory chain — the general Solution of the problem of Lavoiser's respiration. — By the methods of radiation physics the main reaction of fermentations was recognized as a hydrogen transfer by nicotinamide, by the methods of organic chemistry 1, 3, Diphosphoglyceric acid has been iso- lated from yeast, the reactions of which explain the production of phosphateenergy in fermentations. — By methods of physics the fermentation of Cancer cell was discovered and the de-differentiated growth of Cancer cells was explained by a type of energy transformation at a time when the atmosphere of the earth did not yet contain oxygen — a result, which explained the ultimate cause of Cancer by the anaerobic past of life. * The italicized figures in this introduction are the reference numbers of the papers listed in the previous table of contents. * Other literature references (superscripts) are quoted in this introduction only when older works of the author or works of other authors are being cited. 22 Introduction The methods of radiation physics were employed to measure the quantum requirement of photosynthesis. It was found that in Chlorella somewhat less than three light quanta are necessary to split 1 CO > into C + O2 ; this means that in red light there is an almost complete conversion of light energy into chemical energy. In this energy tranformation 1 light quantum splits off 1 molecule of oxygen from the photolyt which is a carbonic acid, transformed by the energy of respiration; 2/3 of the produced C and O^ enter into a back reaction so that, in the net balance, three light quanta split one molecule of carbon dioxide. Thus the problem of the multiquanta reactions no longer exists in photosynthesis. The process of photo- synthesis is part of the ordinary photochemical reactions of the nonliving world. On this basis, the special chemistry of photosynthesis is nowadays being investigated with the methods of manometry and organic chemistry ; our findings in general energetics have thereby found excellent confirmation. The best physical and chemical methods, however, would not have been able to advance cell physiology, had they not been combined with a simplification of the biological technique. Instead of measuring the flow of blood through the surviving organs, the use of thin tissue slices was introduced ; instead of tissues, single cells were employed later. Red blood cells — nonnucleated ones of mam- mals, and nucleated ones of birds — were the first objects used to investigate the chemical mechanism of cell respiration. Instead of green leaves employed to study photosynthesis, unicellular green algae were introduced ; the algae were sometimes replaced by the green grana of spinach chloroplasts or the even much smaller green grana of Chlorella, produced by exposure to sound waves. In the investi- gation of Cancer cells, ascites Cancer cells were substituted for tumors ; whole animal cells were replaced by the grana of liver cells as early as 19141. In all this experi- mentation it was always our aim to simplify the technique and to attain a speed and precision comparable to the methods of Volumetrie chemical analysis. With com- plicated methods we have never discovered anything significant. SPECIAL PART I. Optical measurement of hydrogenation and dehyrogenation No one who has not worked in biochemistry before the hydrogentransferring function of nicotinamide was discovered can fully appreciate the significance of a method that is based on the absorption of light by the dihydropyridine nucleo- tides in the near ultraviolet ränge, at 340 ma. It is no exaggeration to say that this method has reduced the time previously required for detecting and measuring the most important metabolic reactions to about onehundredth. The method is not limited to hydrogenation and dehydrogenation but can be extended to degra- dations, phosphorylations, and all processes that can be coupled in any way with hydrogenation or dehydrogenation. Paper {2) in this collection illustrates the foregoing for fermentation reactions. If c is the concentration of dihydronicotinamide, d the path of light of wave- length 340 m\i, and ß the absorption constant of the dihydronicotinamide, then In — — = ß X c X d i If we express c in micromoles per cubic centimeter and d in centimeters, the dimension of ß becomes Square centimeters per micromole. The numerical value ofjS ß = 14 cm- //mole is one of the most important and most frequently used quantities in biochemistry. If this value is known, one may immediately derive from it, by means of the following expression, the number of micromoles of hydrogen per cubic centimeter 20 that were transferred in any one liquid, provided has been measured : z'o I /// 1 Ac ß x d //mole cm-5 For instance, if — = 2 and d = - 1 cm, then i ■Un — i 0,7 ß x d 14 //mole crrr from which it may be seen that the optical method is very sensitive, approximately 10 times as sensitive as our biological manometry. The directions for carrying out this method have not changed since 1935-, since the function and the UV-bands of dihydronicotinamide were discovered. However, this method did not become generally accessible until our photoelectric cell was replaced by the spectrophotometer of Beckman and Zeiss-Oberkochen and until the firm of Böhringer began to market pure metabolic enzymes. 24 Introduction Nicotinamide cannot be synthesized in adequate amounts in the human body and is, therefore, a vitamin indispensable to man. It is less known that nicotin- amide is also a therapeutically effective chemical. Ten years after the discovery of the physiological function of nicotinamide, in 1945, Vital Chorine3 found that tubercular guinea pigs and leprous rats could be healed by the use of nicotinamide, whereby 0.3 to 1 g per kg of body weight was sufficient to effect a eure. Free nicotinic aeid proved therapeutically ineffective. This action of nicotinamide, a com- pletely nontoxic substance, a component of hydrogen-transferring enzymes, was responsible for the testing of nicotinamide and its isomers and homologs with regard to the effect of these Compounds on human tuberculosis. The result of this work was the discovery by Gerhard Domagk of the action of isonicotinic aeid hydrazide, the most effective remedy against human tuberculosis today. II. Manometry Complicated manometric equipment, such as was used to measure the quantum requirement of photosynthesis — differential manometers, readings by means of the cathetometer-microscope, the rotary motion of round vessels — was replaced in 1945 by simple manometers, readings with the unaided eye, and the straight- line motion of reetangular vessels (8). The transition in the motion of the mano- metric vessels from circular to rectilinear caused one of the prineipal sources of error in manometry to disappear, i. e., the formation of foam when the vessels are shaken. A cell Suspension, formerly füll of bubbles after being shaken for no more than 1 hour, is today free of bubbles after being shaken for 24 hours. This enabled us to change over to experiments of any desired duration and, thereby, to obtain manometric effects of any desired magnitude — an example of what may be achieved by means of apparently minor modifications in technique. If irradiated manometric vessels moving in a straight line run the risk, at the end of their paths, of moving beyond the beam of light, this can be prevented by the use of mirrors that are attached to and move along with the manometers. Metabolism measurements in serum have also become simplified, because the complicated calculation of carbon dioxide retention has been replaced by a simple direct method of determination. The introduction of the new "side Chamber" and "trough" vessels, which will completely displace the older types of manometric vessels, represents a decisive advance in manometry (41, 42, 72). Carbonate-bicarbonate mixtures put into the side Chambers maintain constant pressures of carbon dioxide within the entire side-chamber vessels, over the ränge of 0.3 to 600 mm Brodie; cells maintained in their physiological environment in the main compartment of the vessel can thus no longer be damaged by the carbonate mixtures in which they formerly were suspended. This method constitutes the Solution of the oldest problem of biologi- cal manometry: to determine the oxygen metabolism under physiological carbon dioxide pressures by means of one vessel. It obviates the use of the two-vessel method in all cases in which the carbon dioxide is of no interest. The new manome- tric vessels may be obtained from Aminco, Silver Springs, Maryland, USA. Introduction 25 The new procedure has already been employed to determine the quantum requirement of photosynthesis with only one irradiated vessel. It has also been employed to determine the oxygen consumption of Cancer cells ; the respiration of these cells is determined only inaccurately by means of the two-vessel method because of the cells' large aerobic fermentation. The new trough vessels are conical and have insets that are located within the upper third, rather than at the bottom, of the main vessel. These trough insets are no longer shaped like cylinders but rather like flat troughs. They are connected to a sidearm, from which substances may be introduced into the trough; a second sidearm is connected to the main vessel rather than to the trough. If we mix in the trough via its sidearm, substances that are neutral and that do not become alkaline until they are mixed, we can determine the carbon dioxide content of the manometric vessel. If the cell Suspension in the main compartment of the vessel is fvrst acidified via the second sidearm, and the contents of the trough are only then made alkaline, the total carbon dioxide in the manometric vessel can be determined. If we mix in the trough substances which, upon contact with one another, give off oxygen without a simultaneous change in the pressure of carbon dioxide — for instance, catalase and hydrogen peroxide — we can make the transition from anaerobic to aerobic conditions without opening the vessel. If, on the other hand, we mix in the trough substances that, upon contact with one another, absorb oxygen, without the reaction becoming alkaline, we can make the transition from aerobic to anaerobic conditions without opening the vessel. Of the application of trough vessels to date we should like to mention the meas- urement of the fixation of CO-2 in green cells, a determination that can be made much more reliably and precisly by the use of through vessels compared to the usual C14 methods. We should further like to mention the measurement of the uptake of carbon dioxide by Chlorella as a result of the transition from anaerobic to aerobic conditions, as well as the measurement of the evolution of carbon dioxide by Chlorella on transition to anaerobic conditions. In addition, we should like to mention the measurement, in a Single vessel, of the retention of carbon dioxide and lactic acid. III. Radiation measurement (Bolometer) The bolometer in use today was developed at the Physikalisch-Technische Reichs- anstalt by Lummer and Kurlbaum. It is an instrument that has a great past; with it Lummer and Pringsheim4 measured the radiation of black bodies. From their experiments in 1900, Planck5 derived his formula for radiation in 1900 and calculated the constant h (h = 6.55 • 10~27 erg • sec, as compared to today's value of h = 6.63 • 10 --' erg • sec). It is the same instrument with which Emil War- burg6 in the years 1911 to 1930 laid the foundations of quantitative photochemistry. The bolometer has one advantage that distinguishes it from all other instruments for the absolute measurement of radiation : If one permits a beam of light to fall on the platinum Strips of the bolometer and then shifts the beam over the surface of the 26 Introduction bolometer, the electrical response of the bolometer remains constant; whereas, if a ray is shifted along the surface of a thermopile, the deflections of the galvano- meter change so considerably that absolute radiation measurements are impossible. We have simplined (11) the calibration of the bolometer by substituting for the Hefner lamp the calibrated carbon-filament lamp of the Bureau of Standards in Washington. If, during calibration, the bolometer opening is covered by means of a lithium fluoride window rather than a quartz window, no corrections need be made for selective absorption; correction must be made only for the reflection of the Standard light. As light sources we use the mercury and xenon high-pressure lamps manufac- tured by the Osram A.G., or 500-watt metal-filament lamps that have a small area of intense brightness. Nowadays we rarely employ monochromators to isolate the spectal regions but, most of the time, use colored glass filters and interference disks. We test each spectral region before using it for measurements of photosyn- thesis, employing a Solution of 1 mg/cm3 ethyl chlorophyllide in pyridine; the So- lution should not transmit any light in a layer of 1-cm thickness. Another contribution to the development of radiation methods (11) is the Splitting of light beams by means of prisms or of mirrors that permit only partial transmission; and the bolometric adjustment of the two parts to the same intensity, as is required in the two-vessel method. This technique has been improved in such a way for the measuring the absorption of the blue-green action spectrum of photosynthesis, that it became possible to add, to two red beams of equal intensity, two blue-green beams of equal intensity. IV. Radiation measurement (Quantum actinometer) (4) In addition to using the bolometer for absolute radiation measurements, we deve- loped the quantum actinometer for special purposes, In this instrument, oxygen is transferred to thiourea by chlorophyllide or pheophorbide and the oxygen absorbed is measured manometrically. If the quantum intensities are below a cer- tain threshold, the amount of oxygen consumed when one light quantum is ab- sorbed is almost exactly one molecule. If monochromatic light beams are to be measured, the bolometer is to be preferred to the actinometer. But if diffuse light is to be measured, the actinometer is prefer- red. The actinometer may also be used to measure the sum of light intensities that are not constant, since the actinometer integrates the intensities of the absorbed light. V. Radiation measurement (Absorption measurement) (25) The most difficult part of the determination of the photosynthetic yield by radiation measurements was the measurement of the light absorption in the turbid media of the cell suspensions. Our first Solution of the problem consisted Introduction 27 in putting so many cells into the manometric vessels that the radiated light was completely absorbed. But the great respiration of these many cells was inconve- nient. Nowadays the respiration is compensated for by means of düfused blue- green light before the incident light is allowed to irradiate the manometric vessel; therefore, extensive respiration no longer presents an obstacle to the application of the method of complete absorption. Incomplete absorptions we measured first by means of the quantum actinometer, which we placed around the manometric vessel containing the cells. Later we developed an Ulbricht sphere for measuring incomplete absorptions ; in the center of the sphere the manometric vessels were moved about and irradiated as they were in the yield determinations. If the photomultiplier built into the surface of the sphere showed the deflection zD for white cells and i for green cells, the fraction of irradiated light absorbed by the green cells was i a = —^ Thus, it is now possible to measure both very small and very large quan- tities of absorbed light that is to determine the yields of photosynthesis for very dilute as well as very dense suspensions of cells. The fact that we found almost the same quantum yield for 5% light absorption as for 100" 0 light absorption may be considered a confirmation of the reliability of our methods of absorption measurement. As may be gathered from all the aforesaid, two instruments are required for measuring light absorption: one instrument to measure the incident quanta, and another to measure the absorbed fraction of the incident quanta. A bolometer and an Ulbricht sphere are examples of such instruments. Because both Calvin and Daniels used the bolometer quite incorrectly, we should like to point out that this instrument is not suitable for measuring light absorption (34) by light- scattering suspensions. VI. Metallo-enzymes (2) The role of iron or copper in oxygen-transferring enzymes has been completely explained from a chemical point of view by a valence change of these metals. However, there is a second type of metallo-enzyme, in which the function of the metal is not a valence change, e.g., when zinc is effective or when several metals are interchangeable with one another. A metallo-enzyme of this type is yeast zymohexase, which splits hexosediphosphate into triosephosphate and which is activated by zinc, cobalt, or iron. The method we introduced in 1938 for the detection of functional heavy metals in enzymes is not an analytical one, since the high molecular weights of the enzymes make analytical results uncertain and since analysis does not give an explanation of the function of metal. Instead, our method consists in removing the metal by dialysis against complexing substances, e.g., phenanthroline, and in resynthesizing the enzymes by addition of metals. Many functional heavy metals have been dis- 28 Introduction covered by this method since 1938 and it seems to become increasingly evident that heavy metals contribute to the action of most enzymes. Obviously the long polemics directed against the first functional heavy metal that was discovered — the iron of iron oxygenase — was an attack that could not have been more unjustified. The chemical mechanism of the function of metals in the metallo-enzymes of the second type is still unknown. One of the mysteries of enzyme chemistry is the fact that of the zymohexases we have crystallized, yeast zymohexase is a metallo- enzyme but muscle zymohexase is not. VII. Respiration {19) Since the active groups of the oxidizing and reducing enzymes and their chain reactions have been discovered", [1] 0-2 — iron oxygenase -> cytochrome — flavin — * nicotinamide [2] O2 -> copper oxygenase — orthoquinone -»■ nicotinamide the question has been discussed whether these pathways provide a complete explanation for the mechanism of biological oxidation and reduction or whether they are valid for only a limited number of substrata — for the initial attemps at in vitro oxidation by enzymes of, for instance, fatty acids and the so-easily-com- bustible acetic acid, were unsuccessful. Coenzyme A, which Lipmann8 discovered in 1945, supplied the answer to this question. In 1951 Lynen9 discovered that coenzyme A acts through its SH group, which forms thioesters with organic acids and thereby makes the acids capable of reacting with the components of the enzyme chains. Flavoproteins dehydrogenate Coat bound fatty acids10; the //-hydroxy acids thus formed are dehydrogenated to keto acids by pyridine proteins. The latter dehydrogenate the CoA-bound pyruvic acid to acetyl CoA, whose acetic acid constituent then combines with oxalacetic acid to form citric acid: COOH COOH CH3COOH H 1 CO 1 | OH C \ xCH2COOH CH2 CH2 COOH COOH In the citric acid cycle discovered by H. A. Krebs11, the equivalent of the acetic acid is oxidized to carbon dioxide and water, and at the same time oxalacetic acid is formed once more. The enzymes, which effect these oxidations within the cycle — the oxidation of isocitric acid, ketoglutaric acid, succinic acid, and malic acid — are none other than the pyridine proteins, flavoproteins, and heme proteins. Many similar examples could be cited today. Indeed, all the biological hydro- genations and dehydrogenations that we know of are effected by reactions of members of our enzymatic chains. Thus they provide the universal and complete Solution to the problem of biological oxidation and reduction. Introduction 29 If we ask why Substrates are "activated" by combination with coenzyme A, I should like to point out that coenzyme A contains triply phosphorylated adenine, which also occurs in triphosphopyridine nucleotide and, serves to bind the nucleotide to the enzyme proteins. I should mention further that phosphate is generally the group that binds Substrates and coenzymes to the enzyme proteins, as has been discovered by a comparison, for instance, of the reactivities of phospho- rylated and nonphosphorylated glyceraldehyde or phosphorylated and nonphos- phorylated lactoflavin. The idea thus readily suggests itself that the coenzyme A fixation may be interpreted as a phosphorylation which proceeds, although not directly, via the pantothenic bridge. This is supported by the fact that Sub- strates such as glucose phosphate or triosephosphate, which already are phos- phorylated, do not require coenzyme A. On the other hand, it is true that there are nonphosphorylated Substrates, such as acetaldehyde and pyruvic acid, which combine with enzyme proteins and are subsequently hydrogenated by nicotinamide without any intermediary action on the part of coenzyme A. In the field of respiration, the crystallization of the prosthetic group of iron oxygenase, the "cytohemin", constituted significant progress (13, 24, 25, 26). This substance which in the living world transfers the oxygen thus was chemically isolated and became accessible to chemical investigation. Cytohemin, like blood hemin, contains two propionic acids; unlike blood hemin, it contains a formyl group but, only one vinyl group. Also unlike blood hemin, cytohemin contains a side chain having a molecular weight of the order of magnitude of 200; this side chain is responsible for its lower contents of iron and nitrogen as compared to the iron and nitrogen contents of the blood hemin. A comparison of the elementary analyses of these two chlorferri Compounds yielded the following percentages : C H N Fe Cl Cytohemin 64.47 6,79 6.50 6.42 4.20 Blood hemin 62.63 4.94 8.59 8.40 5.43 On fusion with resorcinol, cytohemin yields a "deuterohemin" that forms beau- tiful crystals and that contains three free ß positions. S. F. MacDonald1'2, a Student of Hans Fischer, who took over the study of this important substance, proposes the following structure for "cytodeuterohemin" : CH3 H CH3 H I H propionic acid propionic acid CH3 The structure of the quinone in the enzymatic chain [2] (above) is still unknown, That of dehydrogenated chlorogenic acid, an ester formed by 3,4-dihydrocin- namic acid and quinic acid, is open to question, at least in the case of plants. Martius13 assumes that naphthoquinone proteins are generally members of the enzymatic chains. 30 Introduction VIII. Fermentation (2) If Arthur Harden14 is right, that the oxido-reduction offer mentations is the main reaction of fermentations because by the oxidation-reduction the meaning of the fermentations is fulfilled, then 1939 was the year the chemical mechanism of fer- mentations was discovered. In 1939 at Dahlem the chemical reactions were dis- covered15 by which triosephosphate is oxidized to pyruvic acid and pyruvic acid is reduced to lactic acid : (I) 3-Phosphoglyceraldehyde + H3PO4 =^ 1,3-diphosphoglyceraldehyde (II) 1,3-Diphosphoglyceraldehyde + DPN ^ 1,3-diphosphoglyceric acid DPNHo (III) 3-Phosphoglyceraldehyde + H3PO4 r DPN = (Balance) 1,3-Diphosphoglyceric acid -f DPNHo 1,3-Diphosphoglyceric acid is then dephosphorylated by ADP (adenosine diphos- phate) to pyruvic acid, and the latter is hydrogenated to lactic acid by the DPNHo formed in reaction (II). All these reactions occur in vitro upon addition of the pure Substrate and the crystallized enzymes to one another. 1,3-Diphosphoglyceraldehyde is the only one of these Compounds which we did not isolate, because 1,3-diphosphoglyceraldehyde in aqueous Solution hydro- lyzes to 3-phosphoglyceraldehyde and H3PO4. Thus, in the entire chemical mechanism of fermentations, there remained in 1939 one single sustance about which it was possible to quarrel. Therefore began the long argument about 1,3-diphosphoglyceraldehyde. Meyerhof initiated the fight in 1943 and Lipmann and many distinguished biochemists followed suit. Because the question at issue — the mechanism of fer- mentations— was a biochemical problem that had resisted Solution for a hundred years, the course of this controversy may be described. The fact that needed explanation was that 3-phosphoglyceraldehyde was dehy- drogenated only in the presence of phosphate and that, after dehydrogenation, the added phosphoric acid turned up in the 1-position of the 3-phosphoglyceric acid. No one could come to any conclusion other than that the aldehyde was first phosphorylated in the 1-position R R C<^ + H3PO4 5* C^OH ^O XOP03H2 and that the aldehydic group was subsequently dehydrogenated to a carboxyl group by means of DPN (disphosphopyridine nucleotide). Because of earlier experimental results, this Interpretation Struck us as particularly plausible. In purely chemical experiments we had found16 that the aldehyde group of the gly- ceraldehyde is activated by the addition of phosphate to the neutral aqueous Solu- tion without enzymes to such a degree that it is oxidized to the carboxyl group by molecular oxygen. Dorothy Needham17 later made the Observation that DPN can replace the oxygen in this reaction. Thus, in the chemical model DPN actually de- hydrogenates glyceraldehyde, if phosphate is added to the neutral aqueous Solution. Introduction 31 The pole micists pointed to the possibility that in the case of biological dehydrc- genation by DPN, as opposed to chemical dehydrogenation, the 3-phosphogly- ceraldehyde bound to the enzyme protein, be dehydrogenated by DPN; and that the phosphoric acid reacts only afterwards, displacing the protein from the glyceric acid by means of a process that was called "phosphorolysis". In the meantime, a decisive experiment was made. If the theory of phosphoroly- sis was correct, the initial velocity of dehydrogenation had to be independent of the phosphate concentration; according to our equations, however, the phosphate had to exert its influence from the beginning. The experiment showed that the initial velocity depends on the phosphate concentration, as required by our equations. This is how the last problem of the chemical mechanism of fermentations was solved in 1957 {23, 24). IX. Cancer cells The transition from tumors to single Cancer cells constituted the most essential improvement in this field since 1945. 1. Ascites Carcinoma cells (17, 22, 35, 58) Our first unicellular material consisted of the cells of the Ehrlich ascitic Carcinoma of mice. These Cancer cells were available in large amounts in the form of stable, easily centrifuged, and almost pure suspensions. Thus, tissue from the original organ, connective tissue, and necrotic tissue no longer constituted sources of error in measurements of metabolic rate, and fermentation rates rose to values two- to three-times higher than those found earlier in the case of even the purest tumors. The two-vessel method, which requires the use of equal amounts of identical cell material in both vessels, only then became truly applicable to Cancer cells; quantitative experimentation with Cancer cells only then became possible, a progress comparable to the transition from mixtures to chemically pure sub- stances in chemistry. 2. Earle cells Cancer cells as suspensions of single cells may be obtained by the method of W. Earle who uses a shaking machine to agitate Cancer cells (contained in large bottles) over a period of years. Like Goldblatt and Cameron in experiments with the Carrel method, Earle succeeded with his new method to transform normal cells to Cancer cells. Two lines of Cancer cells were of special interest for use in metabolism tests : These two lines, one of high virulence and the other one of low virulence, had separated spontaneously from a culture Earle had prepared from a single normal cell. Dean Burk and his collaborators, Wood, Hunter and Hobby, have measured 32 Introduction the metabolic rates of these two lines. In the highly virulent line they found extensive fermentation and limited respiration ; in the line of low virulence, limited fermentation and extensive respiration. Anyone who, until then, may have doubted the significance of the fermentation of tumors, could no longer do so (36). 3. Cells according to Dulbecco-Vogt The fastest technique to prepare large amounts of single cells from body cells that are capable of growth is the method of Dulbecco-Vogt, in which a Suspension of animal tissues is made by addition of a dilute Solution of trypsin. We have measured the metabolism of such cell suspensions immediately after preparation and after in vitro growth and have found that the purely aerobic meta- bolism of rabbit kidney cells and of chick embryonic cells changes during growth in vitro into the fermentation metabolism of Cancer cells. In the case of embryonic cells this conversion proceeds with special rapidity. Within one to two cell divi- sions their metabolism changes to the fully developed metabolism of Cancer cells, characterized by extensive anaerobic fermentation, limited respiration, and, conse- quently, extensive aerobic fermentation. Since a large part of the inoculum in the Petri dishes grows in the in vitro culture and since the metabolism changed after only a few cell divisions, the theory of carcinogenesis by selection (in which all of us believed for many years) must be definitely and totally abandoned. We interpret this readiness for anaerobiosis by the long anaerobic history of living matter, a history which evidently the genes have not yet forgotten (59, 61, 63, 67, 71, 76).* The anaerobic past of living matter may also explain the anaerobic fermentation of embryonic cells. This fermentation was discovered soon after that of the Cancer cells but has no physiological significance, because the extensive respiration of embryonic cells always eliminates any anaerobic fermentation by them in the body. The most striking property of this "latent" fermentation is that it is especially strong in early development but then decreases rapidly, for example, to one-fourth of its initial value within a few days. This is the behavior of properties that were necessary in phylogenesis but that later became superfluous. X. Effect of X-rays on Cancer cells If Cancer cells and embryonic cells are irradiated with x-rays under otherwise equal conditions, and if the decrease in metabolism caused by the rays is measured, the reduction in the metabolism of Cancer cells is found to be greater than in the case * 1961 Addition. In the meantime, we have discovered that the metabolism characteristic of Cancer is produced in vitro by a substance present in added calf serum ; this substance can be removed from the calf serum by addition of alumi- num hydroxide. Indeed, embryonic cells may now be grown in vitro, with or without fermentation, depending on whether the serum is treated with aluminum hydroxide or not. Introduction 33 of embryonic cells. Since Cancer cells contain less catalase than normal cells, and since hydrogen peroxide is produced in aqueous Solutions lipon irradiation with x- rays, the obvious explanation was to regard the effect of x-rays on metabolism as a process of hydrogen peroxide poisoning. In order to test this theory we developed the manometric x-ray actinometer (analogous to our actinometer for visible light), in which the test cells are first shaken and then irradiated and in which a Fricke's Solution of ferrous sulfate is subse- quently shaken and irradiated under the same conditions. As a result of the radi- ation, ferrous iron is transformed into ferric iron. If, in addition to making the metabolic determination, one assays the amount of iron oxidized in each experi- ment, the effective x-ray dosage becomes known in each instance, regardless of complicated geometrical conditions. In order to find the connection between the radiation effect and hydrogen perox- ide, we added catalase to the cells during irradiation; this proved to diminish the radiation effect. Or, better still, we irradiated the Solutions without the cells, then added catalase to the irradiated Solutions, and then added the cells. We found that the irradiated Solutions lowered the fermentation of Cancer cells almost like irradiation; after the addition of catalase, however, the irradiated Solutions no longer affected the fermentation of Cancer cells. Studies of this kind, which were extended to the formation of methemoglobin by x-rays showed that it is essentially the hydrogen peroxide formed that inhibits the fermentation of dilute suspensions of Cancer cells during irradiation, rather than the H atoms and OH radicals, which, according to Joseph Weiss, are the primary degradation products of water. Thus, the reactions in which hydrogen peroxide is formed during irradiation 2 OH = H2O2 2 H + 02 = H2O2 obviously proceed more rapidly under our experimental conditions than do reac- tions of H and OH with fermentation enzymes (60, 63, 64, 65, 66, 82). XI. Photosynthesis* 1. Experimental material We no longer use continuous light to cultivate Chlorella for yield determinations ; since 1956, we have used fluctuating light, whose light-dark time intervals corre- spond to the day, night, and twilight periods. This, above all, but also other meas- ures are responsible for the fact that good quantum yields are now reproducible any time at will, and explains failures in earlier times. * 1961 Addition. In 1960 "Problems in Photosynthesis" by W. Bladergroen was published in the American Lecture Series (Charles C Thomas, Publisher, Springfield, 111.). This is the first constructive presentation of this field of investi- gations that has appeared in many decades. It does not detail theories but describes experiments and techniques. 3 Warburg, Zellphysiologie 34 Introduction 2. Blue-green light In 1955 we discovered that blue-green light acts as a catalyst in photosynthesis. Other very pure spectral regions of visible light are either ineffective or only of very poor effectiveness in photosynthesis, unless small amounts of blue-green light are added. Since that time, blue-green light has always been added in measure- ments of the quantum requirement. The action spectrum of blue-green light yielded a peak at approximately 458 mit and is probably the absorption spectrum of an enzyme. The determination of this action spectrum is one of the more difficult tasks of radiation-physics, since it requires that each of two light beams of different color is split into two parts; also that four beams are bolometrically adjusted for each point of the action spectrum. These Operations can be carried out only in a well equipped radiation laboratory. 3. Quantum Requirement of Photosynthesis in Chlorella* When the quantum requirement of photosynthesis was newly determined in 1960, the progress in cell cultivation, radiation and absorption measurement, and mano- metry were taken into consideration as well as the necessity of adding blue-green light of low intensities. Experiments can now last as long as desired and produce manometric changes (almost exclusively in the region of positive pressure) of any desired magnitude. In addition, one has the choice of the two-vessel method — pro- vided the equipment necessary for Splitting the light beams is available — or a very simple one-vessel method, in which the carbon dioxide pressure is kept constant by carbonate mixtures separated from the cells. The following are examples of determinations we made by means of the new one-vessel method, when the incident light was red and the respiration was com- pensated for with blue-green light (see page 582) : C02 Pressure [ 1 Quanta (mm Brodie) cp O2 8 21 31 6.9 75 3.6 140 2.83 202 2.75 These figures show how remarkably the quantum requirement changes with the carbon dioxide pressure and that the limiting value of the quantum requirement is reached only when the carbon dioxide pressure exceeds 200 mm Brodie. The limiting value is 1 - = 2.75 <P Quanta Oj * Addition in September 1961. In the meantime it has been confirmed that the quantum requirement of leaves is much greater, namely 15 to 20 per molecule of oxygen (page 542). If the mechanism of photosynthesis in leaves is the same as in Chlorella, it follows that in leaves a much greater fraction of the produced oxygen reacts back. Introduction 35 This is very close to the thermodynamically possible minimum value when the molar energy required to split carbon dioxide is 112,000 cal. It is also close to the minimum value that we find with the two-vessel method ; this may appear obvious but is mentioned here because of inexpert criticism of the two-vessel method. Since the same number of light quanta absorbed by Chlorophyll develop the same amount of oxygen over the entire visible spectral region, we can calculate the energy transformation in visible light as follows, when we assume that the molar energy required to split carbon dioxide is 112,000 cal.: Wavelength of light Energy transformation (m/0 Gain in chemical energy Absorbed light energy 112,000 436 2.75^65^00 ^ 10° = 62% 112,000 546 2.75 - 52,000 10° = ?8 "" 112,000 680 TTlTr ^^ 100 = 96",, 2.75 42,000 The fact that the quantum yield at a carbon dioxide pressure of 20 mm Brodie represents only a small part of the maximum quantum yield is of historical interest. 20 mm Brodie has been the pressure of carbon dioxide at which Emerson deter- mined the quantum requirement of photosynthesis 20 years ago and at which he found a quantum requirement of 10 to 20 per molecule of oxygen. Emerson added the totally unfounded claim that the yield obtained at 20 mm Brodie was the highest possible yield, in spite of the fact that according to our prescriptions Chlorella had been cultivated at a carbon dioxide pressure of 500 mm Brodie. Probably no one would have taken Emerson's claim seriously, if Franck and Gaffron18 had not produced a "thermodynamic theory" to show that the yield Emerson obtained at 20 mm Brodie was indeed the highest that could be achieved. In 1949 in Bethesda (U.S.A.), with Dean Burk and several other American col- leagues, we used the newly developed respiration-compensation technique to deter- mine the quantum yield at a carbon dioxide pressure of 500 mm Brodie. In a long series of experiments a quantum requirement of less than 4 was found ; this result agreed with the earlier work done at Dahlem. Franck and Gaffron, supported by Eugene Rabinowitsch, stuck nevertheless to their thermodynamics. And without themselves contributing any experimental work to the energetics of photosynthesis, they have been making propaganda for Emerson's Claims for 20 years. 4. 1-Quantum Reaction If we summarize the results of our yield determinations by means of the equation H2C03 + 2.75 hv = CH20 + 02 it is evident that this equation does not represent a single chemical reaction but expresses the balance of several reactions. For multiquanta reactions are unknown in photochemistry and no photochemical process, biological or nonbiological, can 36 Introduction be considered explained, until the 1-quantum reaction on which it is based has been discovered. Working in Dahlem, in 1950, Dean Burk and the author discovered the 1-quan- tum reaction of photosynthesis, a reaction in which 1 light quantum develops 1 molecule of oxygen, as follows : X02 -i- 1 hv = X + 02 where XO2 is the substance from which the oxygen develops. Obviously, XO2 cannot be carbon dioxide, since several quanta of visible light are needed to liberate the oxygen from carbon dioxide. This is the way the 1-quantum reaction was discovered. We were making yield determinations with Chlorella and were calculating the yields, as usual, from the dirTerence in manometric readings obtained in light and in darkness. During this work we noticed that yields improved when the intervals between the light and dark periods were shortened. A limit was reached at time intervals of 1 minute each. Then 1 light quantum developed 1 molecule of oxygen. In the course of these experiments we further observed that shorter light and dark periods not only increased the amount of oxygen developed in light but also the oxygen consumed in the dark. To the discovery of the 1 quantum reaction in light was thus added the second discovery that the subtrate XO2 arises in a dark reaction in which extra oxygen is consumed. This discovery led to an explanation of the 1-quantum reaction energetically and chemically. Many favorable conditions contributed to these discoveries ; but a high carbon dioxide pressure (at least 10" ,, of an atmosphere) was primarily responsible.* If the carbon dioxide pressure had failed to exceed 2% of an atmosphere, the 1-quantum reaction would not have been discovered. Another condition promoting these dis- coveries was the Substitution of ammonium chloride for nitrate in the Suspension medium of Chlorella; the use of large quantities of cells in the manometric vessels was necessary because the 1-quantum reaction is not a catalytic but a stoichiometric cell reaction; and, finally, a fully developed two-vessel method was required that would suffice to measure the oxygen metabolism in one minute with an adequate degree of accuracy. As in other areas of cell physiology, the decisive discoveries were made by the use of the two-vessel method. Later on the techniques for measuring the 1-quantum reaction were simplified and improved. In the course of years, use of the new methods brought confirmation of all results of the first work, experiments as well as conclusions. 5. Is Water the Photolyte in Photosynthesis ? The theory that photosynthesis is the photolysis of water originated by the use of isotopes in experiments with Chlorella, in which the oxygen of the water was * 1961 Addition. High carbon dioxide pressures are necessary to saturate Chlo- rella with photolyte : that means to saturate the Chlorophyll with photolyte. Only from Chlorophyll that is combined with photolyte can absorbed light develop oxygen. Introduction 37 labeled but the oxygen of the carbon dioxide was not. It was observed that a part of the oxygen given off in light was tracer-labeled. In view of the rapid hydration of carbon dioxide in Chlorella, however, these experiments in no way constitute proof for the photolysis of water. Subsequently, R. Hill thought he had proved the photolysis ofwater, whenhe discovered that ferric Oxalate develops oxygen in light from chloroplasts, without addition of carbon dioxide. Hill's experiments, however, failed to prove the photo- lysis of water, since ferric Oxalate produces carbon dioxide in light and since, in other ways as well, carbon dioxide was not properly excluded from the experiments. It is a fact that for a long time, from 1944 to 1958, the only support for the the- ory of water photolysis could be found in our studies19. This work showed that quinone develops oxygen from green grana carefully washed with water, the reac- tion taking place in the presence of light and according to the equation 2 quinone — 2 HoO = 2 hydroquinone — Oo The inability of the grana to develop oxygen from added carbon dioxide seemed to block the oxygen-from-carbon dioxide pathway even more effectively. In 1959 and 1960, however, application of new methods to the quinone reactions made us realize that such reactions could not proceed without carbon dioxide. Only a very small quantity of carbon dioxide was needed, because the effect of carbon dioxide in these quinone reactions is catalytic rather than stoichiometric. Actually the only difference between quinone reactions and photosynthesis is with respect to the mechanism by which carbon dioxide is utilized : In quinone reactions, the reduced carbon dioxide is completely reoxidized to carbon dioxide by excess quinone; whereas, in photosynthesis, a part of the reduced carbon dioxide remains in the form of "fixed carbon dioxide." Thus, in 1960, went down the only sup- porting pillar of the theory of water photolysis, and with it, the entire edifice of theories based on the photolysis of water. We never took it seriously that the reduction of phosphoglyceric acid by dihydro- nicotinamide — a reaction we discovered (see page 30) in 1939 — should be the reac- tion by which carbon dioxide is reduced in photosynthesis. The appearance of phosphoglyceric acid in radiograms taken from Chlorella after exposure to light is adequately explained by the occurrence of light-induced respiration. 6. The real Photolyte of Photosynthesis If Chlorella is shaken with carbon dioxide, under aerobic conditions and in the dark, carbon dioxide is fixed chemically. If the uptake of carbon dioxide is allowed to proceed to completion and is then followed by illumination, the carbon dioxide disappears, with evolution of oxygen. This latter reaction proceeds until there is equilibration of the processes of degradation and uptake of carbon dioxide, that is until photosynthesis has reached a steady State. We call the carbon dioxide Compound accumulating in the dark, from which oxygen is liberated in light, the photolyte of photosynthesis. The maximum concentration of photolyte that can be obtained in Chlorella depends on the pressure of carbon dioxide and on the type of cells that are being 38 Introduction cultivated. In the A cells, which give the best quantum yields in light, Saturation with photolyte is reached when the carbon dioxide pressure equals 10 to 20° 0 of an atmosphere; the concentration of photolyte then usually equals the concentration of Chlorophyll. The photolyte arises only under aerobic conditions, when the cells are respiring ; it decomposes, giving off carbon dioxide, when the cells are deprived of oxygen. The formation of the photolyte is inhibited when the cells are suspended in arsenate instead of phosphate, but the amount of photolyte formed reverts to its normal value when phosphate is added to the arsenate Solution. The photolyte content is closely related to the glutamic acid content. If glutamic acid in living Chlorella is permitted to decompose into y-aminobutyric acid and carbon dioxide, the photolyte will also decompose and thereby give off carbon dioxide; if glutamic acid is resynthesized in living Chlorella, the photolyte is formed once more. In A cells, which give the best quantum yields, the photolyte concentration is usually found to equal the glutamic acid concentration. All the above-mentioned reactions of the formation and degradation of the pho- tolyte are very rapid; they are partial reactions of the mechanism of photosyn- thesis and have nothing in common with the slow reactions of protein synthesis, transaminations, etc. For example, the half-life period of the formation of photolyte during a change from anaerobic to aerobic conditions is 5 minutes at 20° C. The first reaction in the formation of photolyte may be the reversible phos- phorylation of carbon dioxide by ATP (adenosine triphosphate) H2CO3 + ATP ;= HCO3H2PO3 + ADP a reaction that explains the dependence on carbon dioxide pressure and on respi- ration. The carboxy-phosphate formed then enters into a reversible reaction with glutamic acid, the resulting glutamic acid Compound reacts reversibly with Chloro- phyll, (cf. Seite 567 und 627) 7. Light-induced respiration of grana The following properties of grana are here discussed : 1. Grana from leaves or from Chlorella have no dark respiration. 2. Grana although they develop oxygen in light cannot fix carbon. 3. Oxygen development by grana in light is not inhibited by hydrocyanic acid. It may be added that respiration in Chlorella can easily be destroyed, for instance by very small amounts of quinone, and that Chlorella by such treatment acquires the properties of grana inasmuch that it can no more fix carbon and that oxygen development in light is no more inhibited by hydrocyanic acid. It has been one of the main problems of the grana reactions how it is possible energetically, that grana develop oxygen from carbon dioxide, although they have no respiration at their disposal, the energy of which could transform carbon dioxide into the photolyte. The answer is that grana have no dark respiration but that they have light-induced respiration. Introduction 39 Let a quinone be the catalyst, then the equations of light-induced respiration are: 2 quinone — 2 H2O — C = 2 hydroquinone + CO2 O2 — 2 hydroquinone = 2 quinone + 2 H2O [1] [2] balance light c + o2 = co2 co2 = c + o2 [3] [4] balance 0 = 0 [5] But if the balance of light-induced respiration is zero, how can light-induced respiration be discovered ? In the dark it cannot be discovered, because in the dark it does not occur. In light it cannot be discovered, because in light the produced carbon dioxide is split according to equation [4] into C — O2. Yet it has been possible to discover and to measure light-induced respiration. If to a Suspension of illuminated grana as much hydrocyanic acid is added that the catalase of the grana is inhibited, then in reaction [2] the double amount of oxygen IS COnsumed : 2 02 - 2 hydroquinone = 2 quinone + 2 H202 and two molecules of hydroperoxide are formed for each molecule of oxygen devel- oped. Then the balance of the equations [1] to [5] is no more zero but becomes: 02 + 2 HoO = 2 H2O2 This means that light-induced respiration can be measured by the consumption of oxygen and by the production of the double amount of hydrogen peroxide ; a method that has been possible owing to the fact that oxygen development in illu- minated grana is not inhibited by hydrocyanic acid. In this way light-induced respiration of the grana has been discovered and the energy problem of the grana reactions has been solved. Light-induced respiration may also explain in a simple way why grana cannot fix carbon. Let us assume that in illuminated grana the oxidation of reduced carbon dioxide proceed quickly in comparison to the reduction of carbon dioxide and that, inversely, in illuminated cells, reduction proceed quickly in comparison to oxi- dation, then we may understand why darkening produces in cells, but not in grana, a gain of reduced carbon dioxide, that is, fixation of carbon. The third point — that oxygen development in illuminated grana is not inhibited by hydrocyanic acid — is still mysterious. We have no idea how to explain the dif- ferent behavior of cells and of grana toward hydrocyanic acid. 40 Introduction Literatur 1 Warburg, O., Pflügers Archiv f. d. ges. Physiologie 154 (1913), 599, 158 (1914), 19. 2 Warburg, O., Christian, W., und Griese, A., Bioch. Zschr. 282 (1935), 157, sowie Negelein, E., Haas, E., Bioch. Zeitschr. 282 (1935), 206. 3 Chorine Vital, Compt. Rend. Acad. des Sciences, 150, 220, Paris 1945. 4 Lummer, O., und Pringsheim, E., Verh. Deutsche Phys. Ges. 2 (1900), 163, 176. 5 Planck, M., ebenda 2 (1900), 202, 237. 6 Warburg, E., Sitz. Ber. Berl. Akad. 1911, Seite 249; 1914, Seite 881; 1916, Seite 314; 1918, Seite 881; usw. bis 1930. 7 Warburg, O., Ergebnisse der Enzymforschung 7 (1938), 210; Die Umschau, Heft 2, 1938. 8 Lipmann, F., J. Biol. Chem. 160 (1945) 173. 9 Lynen, F., Reichert, E., und Rueff, L., Liebigs Ann. 574 (1951), 1. 10 Stern, I. R., Ochoa, S., und Lynen, F., J. Biol. Chem. 198 (1952), 313. 11 Krebs, H. A., Les Prix Nobel, 1953, 139. 12 MacDonald, S. F., J. Am. Chem. Soc. 82 (i960), 3183. 13 Martius, C, und Mitarbeiter, Bioch. Zschr. 326 (1954) 26; 327 (1955), 1; 329 (1957), 450. 14 Harden, Abthur, Uppsala, 1938 (Almqvist und Wik- sells). 15 Warbubg, O., und Christian, W., Bioch. Zschr. 303 (1939), 40. 16 Wind, F., Bioch. Zschr. 159 (1925), 58. 17 Needham, D., Biochem. J. 49 (1951), 113. 18 Franck, J., und Gaffron, H., Advances in Enzym- ology 1 (1941), 199. "We know now that the high quantum efficiency is only apparent and that the true efficiency is probably only a third of it, namely 12 quanta per CO» molecule reduced." 19 Warburg, O., und Lüttgens, W., Die Naturwissen- schaften, April und Oktober 1944, sowie Warburg, O., Heavy Metals and Enzyme Action. Oxford, Claren- don Press, 1949. Otto Heinrich Warburg (19 5 8) Dean Burk Head Biochemist, National Cancer Institute, Bethesda (Maryland) Seit 1950 auswärtiges Mitglied des Kaiser -Wilhelm -Instituts für Zellphysiologie in Berlin-Dahlem. Entdeckte im Jahre 1950 im Kaiser -Wilhelm -Institut für Zellphysiologie die 1 -Quantenreaktion der Photosynthese (Dean Burk und Warburg, O., Die Naturwissenschaften 37 [ 1950], 560) 1 Otto Warburg, artisan of cell chemistry: By Dean Burk Otto Heinrich Warburg was born on October 8, 1883 in Freiburg in Baden. In 1896 he came with his parents to Berlin, where his father, Emil Warburg, had been called to the Chair of Physics in the University of Berlin and was later from 1905 to 1922 President of the Physikalische Reichsanstalt (Imperial Bureau of Physical Standards). The mother of Otto Warburg stemmed from a family of public officials and soldiers, her brother feil as a general in World War I. In two large official residences of his parents — the first at the Marschallbrücke in Berlin, the second in Marchstrasse in Berlin-Charlottenburg, and both built from plans prepared by Frau von Helmholtz — Otto Warburg grew up during the culminating period of the Germany of Wilhelm II. In the home of his parents, Theodor Wilhelm Engelmann told him about Bacterium photometricum and photosynthesis ; Emil Fischer about plans to fathom the secret of enzymes ; and Jakobus Hendricus Van't Hoff about the maximum work obtainable in chemical reactions. Thus the course of his life was already set in childhood. Later, at the university, he learned chemistry from Emil Fischer, with whom he worked for three years ; medicine in the clinic of Ludolf von Krehl, to whom he was an assistant for three years; thermodynamics from Walter Nernst, with whom he worked on oxidation-reduction potentials in living Systems in 1914; and physics and photochemistry from his father, with whom he worked on the quan- tum requirement of photosynthesis in 1920 in the Physikalische Reichsanstalt. In 1913 he became a Member of the newly founded Kaiser W'ilhelm Society. Since then, without interruption except for World War I, he has contributed increasingly to the fame and renown of this scientific Organization, from 1931 on as Director of the Institute whose name is known to all biochemists. He has never given a course of lectures to students. He is no administrator. He is no member of committees. Among the forty rooms in his institute he has no office, Conference room, or writing room, apart from the general library. He selects his staff on a basis of technical ability. In his opinion, the building of a research institute in the natural sciences must have for its main foundation a permanent staff of technically trained assistants. He is best characterized as an artisan, or even, by his own frequent say so in public, as a technician. He believes that, in the natural sciences, one can find out something new when one does something with one's hands that nobody did before. Thus, the fermentation of tumors was discovered when in the surrounding Ringer- solution the bicarbonate concentration was raised 20-fold. Iron-oxygenase was discovered when in biological experimentation with carbon monoxide the CO- pressure was raised 1000-fold. Acyl phosphate was discovered when in the oxi- * Aus Biochimica et Biophysica Acta 12 (1953): 9. 44 Otto Warburg, artisan of cell chemistry dation-reaction of fermentation the phosphate concentration was raised 20-fold The energy cycle and one-quantum reaction of photosynthesis was discovered when the light-dark time intervals measured in manometry were shortened from 5 minutes to 1 minute. Or, to mention an earlier classic example: the discovery of Planck's energy quanta was initiated when in 1899 Lummer and Prings- heim placed Kurlbaum's bolometer before a black body heated to different tem- peratures. Although Otto Warburg endeavors to advance science mainly through his own experimental works, it cannot be said that he fails to look out for the future of scientists. Thus, he very early recognized the native gifts of Richard Kuhn and Adolf Buten andt, and assisted notably in their obtaining research institutes of the Kaiser Wilhelm Society at relatively youthful ages; he is at present similarly concerned for younger colleagues. For all positions obtained by Otto Meyerhof in Germany — in Kiel, in Berlin, and in Heidelberg — he labored, successfully, against widespread Opposition. After 1933, he helped scores of political refugees to leave Germany and to obtain haven and positions elsewhere. But, like the Cowardly Lion of Oz, he was no "resistance-fighter" : he was not prepared to die as a defenceless scientist in combat with political dictators. Yet he has been ever ready to lose his life as a soldier in the army. In World War I, as an officer in the Prussian Horse Guards on the Russian front, he rode in many field patrols in advance of the infantry, and was eventually wounded in action. In the early years of this fighting, he was, by the by, armed with both pistol and — less effective but more sinister — mediaeval lance ! He has spent the greater part of his life in Berlin, the most restless city in a rest- less world. Here he was ever favored with luck. In World War II, during the years 1939 to 1945, he and his entire staffenjoyed the singular privilege of continuing to work on purely scientific problems without reference to war work. In 1943, as Berlin became dangerous because of air attacks, Prince von Eulenberg placed at his disposal the nearby Castle of Liebenberg, where he and his staff lived and worked, with transported equipment, undisturbed until 1945. In that year the Red Army took possession of the Island of Rügen in the Baltic, and immediately provided a military guard for his estate there, making it possible for him to con- tinue his studies still undisturbed. His only misfortune was that in June 1945 the Russians removed all the equip- ment from his institutes. It appears that this took place at the instigation of the local Dahlem communists, for shortly thereafter Marshai Zhukov, Commander-in- Chief of the Russian-occupied zone, invited Warburg for a visit to teil him, in the name of the Russian government, that the dismantling of his institutes had been a mistake, and a misfortune for science. The Marshai issued an order that the apparatus and books be returned, but alas, everything had already been scattered to the four winds. After the Yalta-Teheran agreement it became doubtful whether Warburg belonged to the Russian or to the American occupation zone, since he was domi- ciled partly in the Russian zone, on the Island of Rügen, and partly in the American sector of west Berlin; and, furthermore, his Liebenberg institute lay in the Russian Otto Warburg, artisan of cell chemistry 45 zone, while the mother research institute was in the American sector of Berlin. Warburg decided for the Americans, and in 1948 began anew to re-establish at Dahlem the Kaiser Wilhelm Institute* for Cell Physiology, the building of which had remained undamaged. From all sides he received help, as reward for not fleeing from Berlin, from neither Hitler nor Stalin. His efforts during the war years and after, to maintain his laboratory and experimental work, bore fruit in the uniquely early reconstitution of his institute, which, already in 1949, had become well equipped with apparatus and books. It was during this year of the re-equipment of his Dahlem institute that he availed himself of an opportunity to visit his American friends. Through the courtesy and generous support of the National Institutes of Health, United States Public Health Service, at Bethesda, Maryland, he was enabled, in Cooperation with the staff of the Cytochemistry Section there, and with Sterling Hendricks of the United States Department of Agriculture at nearby Beltsville, to develop modern methods of photosynthetic experimentation, and to "rediscover" the high efficiency of photosynthesis. As a conclusion to this important and memorable visit, the experimental set-up at Bethesda was transferred for the summer of 1949 to the Marine Biological Laboratory at Woods Hole, Massachusetts, where he had the privilege of demonstrating for many weeks, through the hospitality of Professor E. S. Guzman-Barron, the new methods to the rising generation of American biologists. Since these Woods Hole days he has been a member of the Institute for Muscle Research founded by Albert Szent-Györgyi and Stephen Rath. On May 8, 1950, General Maxwell D. Taylor**, then Military Commandant of the American Sector of Berlin, officially reopened the Dahlem institute. The re- birth of the Kaiser Wilhelm Institute for Cell Physiology, celebrated with cere- mony on that day, the fifth anniversary of the cessation of hostilities, was a signal event both for science and for the promotion of good relations among men of good will everywhere. Today, the Institute Stands at the crest of the biochemical institutes of the world, and, in addition, is probably the finest photochemical institute in existence. Its director expects to do his greatest and boldest experiments, as did his distinguished father before him, after passing the three score and ten mark. His genius may be likened to a positive first order reaction with an extended half-time, attained only after the Half-Century of Biochemical Discovery listed below. It would be superfluous here to give an extended list of the many honors received by Professor Warburg, such as the Nobel Prize in Medicine (1931, for iron- oxygenase), Foreign Membership in the Royal Society of London (1934), and, most recently (1952), Knighthood in the Order of Merit founded originally by Frederick the Great and restricted to thirty of Germany's most distinguished Citizens. A scientific appreciation of his work is probably best realized by the following appended table, which contains a list of experimental contributions regarded by him as his most important discoveries. Most of these were accomplished and accep- * Since July 1953: Max Planck Institute. ** Heute militärischer Chef berater des Präsidenten der USA John F. Kennedy. 46 Otto Warburg, artisan of cell chemistry ted only after long struggle, but this was no disadvantage. For the greater the resistance to a discovery, the more is the discoverer forced to fortify the new do- main of knowledge ; and the greater is the final victory. At the moment, battle rages over the energetics of photosynthesis. But the termination of this battle can no longer be in doubt when one reads the two Communications concluding this vo- lume. Indeed Time, the sovereign judge, has shown that all his published experi- ments have been right. Most of them were ahead of their time. Thus, their signi- ficance is still increasing. Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste* Von Otto Warburg Versucht man, unsre heutigen Kenntnisse über den Mechanismus der Gärung in wenigen Worten zusammenzufassen, so könnte man etwa sagen, daß Hexose im phosphorylierten Zustand zu Triosephosphat gespalten wird; daß Triosephosphat, nach Aufnahme eines zweiten Moleküls Phosphcrsäure, zur Stufe der Brenz- traubensäure oxydiert wird; und daß die Brenztraubensäure im dephosporylierten Zustand zu Milchsäure reduziert wird. Mindestens 11 Fermente wirken dabei zusammen, in Reaktionen, die alle rever- sibel und deren Gleichgewichte gut meßbar sind. In der folgenden Liste der Fer- mente der Milchsäuregärung ist die Richtung von links nach rechts die Richtung, in der die Fermentreaktionen bei der Gärung ablaufen und nach der die Gärungs- fermente zu benennen sind. Man darf also zum Beispiel das reduzierende Gärungs- ferment nicht „Milchsäuredehydrase" nennen**; die Enolase nicht „Desenolase" und die dephosphorylierenden nicht „phosphorylierende" Gärungsfermente; ob- wohl man, da die Gärungsreaktionen umkehrbar sind, aus chemischen Gründen dazu berechtigt wäre. Liste der Fermente der Milchsäuregärung 1. Zymohexase 1 Hexosediphosphat ^± 1 Aldotriosephosphat -\- 1 Ketotriosephosphat. 2. Isomerase Ketotriosephosphat ^t Aldotriosephosphat. * Aus O. Warburg, Wasserstoffübertragende Fermente, W. Saenger, Berlin. 1948 (vergriffen ) ** Zusatz 1961. Mit dem Namen Alkoholdehydrase wird heute in der biochemi- schen Literatur dasjenige Gärungsferment bezeichnet, das bei der alkoholischen Gärung den Alkohol nicht dehydriert, sondern den Alkohol erzeugt in einem Maß- stab, der alle anderen Umsätze der angewandten Biochemie übertrifft. Die Absicht bei dieser Umkehr der Nomenklatur war offenbar der Wunsch, das Neue auf etwas Altbekanntes zurückzuführen. Nun ist zwar wahr, daß vor der Entdeckung der reduzierenden Gärungsreaktion in Zellextrakten eine biologische Dehydrierung des Alkohols mehrfach beobachtet worden ist, aber niemand hatte vor der Ent- deckung des Nikotinsäureamids als Wirkungsgruppe der wasserstoffübertragenden Fermente eine Ahnung davon, 1. daß der Alkohol bei der alkoholischen Gärung durch eine Reaktion des Aldehyds mit hydriertem Nikotinsäureamid entsteht, 2. daß die biologische Dehydrierung des Alkohols die Umkehr der reduzieren- den Gärungsreaktion ist. Man hat also keinen sachlichen Grund, die reduzierenden Gärungsfermente Dehydrasen zu nennen und damit ihre Funktion als Gärungsfermente zu ver- schleiern. 48 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 2a. Phosphorylierung des Aldotriosephosphats, die wahrscheinlich keine Fermentreaktion ist: 3-Phosphoglycerinaldehyd -\- H3PO4 7± 1,3-Phosphoglycerinaldelyd. CH2OPO3H2 CH2OPO3H2 CHOH + H3PO4 i± CHOH CHO C ^OH XOP03H2 3. Oxydierendes Gärungsferment a) reversibel : 1,3-Phosphoglycerinaldehyd Pyridinnukleotid Ü 1,3-Phosphoglycerinsäure Dihydropyridinnukleotid. b) irreversibel, bei Gegenwart von Arseniat: Phosphoglycerinaldehyd -1 Pyridinnukleotid H^O 3-Phosphoglycerinsäure Dihydropyridinnukleotid. 4. Erstes dephosphorylierendes Ferment 1,3-Phosphoglycerinsäure - Adenosindiphosphat 7± 3-Phosphoglycerinsäure + Adenosintriphosphat. 5. Mutase 3-Phosphoglycerinsäure J± 2-Phosphoglycerinsäure. 6. Enolase 2-Phosphoglycerinsäure ^ Phosphobrenztraubensäure + H2O. 7. Zweites dephosphorylierendes Ferment Phosphobrenztraubensäure — Adenosindiphosphat 7^ Brenztraubensäure - Adenosintriphosphat. 8. Reduzierendes Gärungsferment Brenztraubensäure + Dihydropyridinnukleotid r- Milchsäure + Pyridinnukleotid. 9. Adenosintriphosphato.se Adenosintriphosphat — H2O ^ Adenosindiphosphat -j- H3PO4. 10. Erstes phosphorylierendes Ferment Adenosintriphosphat Hexose ^ Adenosindiphosphat + Hexosemonophosphat 1 1 . Zweites phosphorylierendes Ferment Adenosintriphosphat — Hexosemonophosphat ^ Adenosindiphosphat - Hexosediphosphat Weitere Gärungsfermente Wahrscheinlich sind zwischen (lö) und (11) noch 2 Fermente einzuschalten, eine Mutase, die Glukose-1 -Phosphat (Coriester) in Glukose-6-Phosphat verwandelt; und eine Isomerase, die Glukose-6-Phosphat in Fruktose-6-Phosphat umlagert. Im Fall der alkoholischen Gärung ist hinter (7) die Carboxylase einzuschalten: Brenztraubensäure = Acetaldehyd ; Kohlensäure und weiterhin Gleichung (8) zu ersetzen durch : Acetaldehyd -- Dihydropyridinnukleotid 7± Aethylalkohol Pyridinnukleotid. Von den 11 Fermenten der Milchsäuregärung sind das oxydierende und das reduzierende Ferment und ihre prosthetischen Gruppen zuletzt entdeckt worden, nämlich erst in den Jahren 1935 bis 1939. Vorher war es nicht möglich, den Me- chanismus der Gärung zu verstehen: wie das Triosephosphat zur Oxydations- stufe der Brenztraubensäure oxydiert wird und wie die Brenztraubensäure zu Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 49 Milchsäure reduziert wird. Die bis 1935 aufgestellten Gärungstheorien gingen mit Dismutationsgleichungen, die nur Bilanzgleichungen waren, über das Unbekannte hinweg. Viel früher, nämlich schon in den Jahren 1905 bis 1911, entdeckten Harden und Young die phosphorylierenden und die dephosphorylierenden Gärungsfer- mente. Es folgten nach einem langen Stillstand, an dem das Methylglyoxal nicht unschuldig war, Neuberg, Meyerhof, Lohmann und Kiessling mit der Ent- deckung der Carboxylase, Zymohexase, Isomerase, Mutase und Enolase. Weder Harden noch Meyerhof isolierten oder trennten Fermente. Um so mehr muß man den Scharfsinn bewundern, dem es gelang, ohne zu trennen soviel zu entwirren. Das folgende soll keine zusammenfassende Darstellung der Gärung sein, sondern lediglich ein Bericht über neuere eigene Arbeiten. Ich werde mit den optischen Testen beginnen, einem neuen technischen Hilfs- mittel, dem die Zukunft auf dem Gebiet der Gärungen gehört*. Verfolgt mit einem optischen Test, ist bisher noch kein Gärungsferment seiner Isolierung entgangen. Ich werde dann die Isolierung und Kristallisation von Gärungsfermenten be- schreiben und in jedem Fall hinzufügen, was sich durch die Isolierung an neuen Erkenntnissen und Problemen ergeben hat. Ein Gärungsferment, mit dem ich mich noch nicht beschäftigt habe, ist die Adenosintriphosphatase, die nach Arbeiten W. A. Engelhardt1 und A. v. Szent- Györgyi das wichtigste aller Gärungsfermente ist; soll es doch nichts anderes sein als das Muskel-Myosin und soll es durch die chemi- sche Reaktion, die es bewirkt, der Energietransformator sein, der die chemische Energie der Milchsäuregärung in Arbeit verwandelt. I. Prinzip der optischen Teste Da bei der Oxydationsreaktion und bei der Reduktions- reaktion der Gärung Dihydro-Pyridinnukleotid2 entsteht oder verschwindet; und da Dihydro-Pyridinnukleotid im ultraviolett um 340 m/t eine starke Bande hat, so kann man die beiden Gärungsreaktionen mit optischen Methoden nachweisen und messen. Aber auch die andern Gärungs- reaktionen kann man durch das Entstehen oder Verschwin- den der Dihydro-Pyridinbanden messen, da alle Gärungs- reaktionen als Glieder einer reversiblen Reaktionskette in ihrem Verlauf voneinander abhängen. Eine zweite Absorptionsbande, die bei der Gärung ent- steht und verschwindet, ist die Enolbande der Phospho- brenztraubensäure3. In dem aufsteigenden Ast dieser Bande ist bei 240 mn die Lichtabsorption so stark, daß man bei n Figur 1. Absorptions- trog aus Quarz. A: Vorderansicht. B: Seitenansicht, d: Schichtdicke. * Zusatz 1961. Diese Voraussage hat sich mehr als erfüllt. Statt Zukunft auf dem Gebiet der Gärungen hätte es „Zukunft auf dem Gebiet der Biochemie" heißen müssen. 4 Warburg, Zellphysiologie 50 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 240 m;< Gärungsreaktionen, bei denen Phosphobrenztraubensäure entsteht oder verschwindet, optisch messen kann. Zur Ausführung der optischen Teste benutzen wir Quarztröge von 3 cm3 Inhalt, deren planparallele Wände einen Abstand von 0,5 cm haben (Figur 1). Die Appa- ratur besteht aus Wasserstoffrohr als Lichtquelle, Monochromator, Kalizelle mit Argonfüllung und Fadenelektrometer oder bequemer, aber weniger vielseitig an- wendbar: aus Quecksilberlampe, Monochromator, Sperrschichtzelle und Multi- flexgalvanometer nach B. Lange. Wegen der Stärke der Banden braucht man für einen optischen Test nur wenig Substanz, von Pyridinnukleotid etwa 1 Mikromol und von Phosphobrenztrauben- säure etwa 3 Mikromole; und wegen der Genauigkeit der lichtelektrischen Meß- methoden genügt es im allgemeinen, die Lichtschwächungen in 2 aufeinander- folgenden Minuten abzulesen. Die Änderung des Logarithmus der Lichtschwä- chung pro Minute, dividiert durch die Konzentration des Fermentproteins F, war dann die relative Wirksamkeit W des Fermentproteins lln-^ w- i-.-i. Jt F Weitere Rechnungen waren nicht nötig, wenn der Test dazu dienen sollte, ein Isolierungsverfahren für ein Ferment auszuarbeiten. Wenn aber für andere Zwecke aus den Lichtschwächungen die Konzentrationen der lichtabsorbierenden Substanzen berechnet werden sollten, so wurden die folgenden molaren Lichtabsorptionskoefficienten /^34o des Dihydropyridinnukleotids : 1,39 • 107 * cm'" />24o der Phosphobrenztraubensäure (bei pH 7,4) : 4,0 • 103 in die Gleichung — = eß ■ c • d M.ole eingesetzt, in der c die Konzentration der lichtabsorbierenden Substanz in — r- bedeutet und d die Schichtdecke der Lösung in cm, die in auf i schwächt. Gemäß dieser Gleichung ist die Konzentration c der lichtabsorbierenden Sub- stanz In* ß-d IL Kinetik Wenn es auch für die Anwendung der Teste nicht notwendig war, so hat es sich doch bei der Ausarbeitung der Teste ergeben, daß die Kinetik der Fermentreak- tionen untersucht wurde. Die Ergebnisse sind wegen ihrer Einfachheit interessant. Wir gehen dabei von zwei vereinfachenden Bedingungen aus : daß die Ferment- proteine mit den Reaktionsteilnehmern — den prosthetischen Gruppen und den Substraten — gesättigt sind; und daß die verschwindenden und die entstehenden Stoffe gleich fest von den Fermentproteinen gebunden werden. Die erste Be- - cm- * Zusatz 1961. Wir rechnen heute mit ß34o = 1,42 • 10" — — = 14,2 Mole //Mole cm- Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 51 dingung ist, da die Bindungen fest sind, durch geeignete Wahl der Konzentrationen immer leicht zu erfüllen. Auf die zweite Bedingung hat man keinen Einfluß. Merk- würdigerweise aber ist sie so oft erfüllt, daß sie einen physiologischen Sinn zu haben scheint. Wenn nun nur die an das Ferment-Protein gebundenen Substanzen chemisch reagieren, so ist die Anfangsgeschwindigkeit in jedem Fall proportional der Pro- tein-Konzentration F , de , „ - — = ki • F [0] d t Da aber im Fortschritt der Reaktionen die Reaktionsprodukte entstehen, die gleichfalls von dem Protein gebunden werden, so nimmt im Fortschritt der Reak- tionen die Zahl der mit dem Ausgangsstoff verbundenen Proteinmoleküle ab und ist zum Beispiel bei halbem Umsatz auf die Hälfte gesunken. Allgemein ist der Q Bruchteil der mit dem Ausgangsstoff verbundenen Proteinmoleküle F • — 3 wenn C die Anfangskonzentration und c die Konzentration zur Zeit t bedeutet; so daß also für den gesamten Verlauf der Reaktion die Differentialgleichung gilt: de c dt C Ist die Reaktion umkehrbar, so ist die Rückreaktion von der Hinreaktion abzu- ziehen und wir erhalten : de c C — c ki • F • — — k2 • F • [2] dt C c wo — der Bruchteil der Proteinmoleküle ist, der mit dem Ausgangsstoff verbunden C — c ist und — — — der Bruchteil der Proteinmoleküle, der mit dem Reaktionsprodukt verbunden ist. Hat man nicht einen, sondern zwei Reaktionsteilnehmer, deren Konzentration sich im Verlauf der Reaktion ändert, so hat man, wenn die Ausgangskonzentration der beiden Reaktionsteilnehmer gleich C ist, anstatt [1] ki • F • (4T ■ [31 dt \C wo (— den Bruchteil der Proteinmoleküle bedeutet, der mit den beiden Ausgangs Stoffen verbunden ist. Setzt man in den Gleichungen [1] bis [3] c = c so geht jede der 3 Gleichungen über in d t das heißt, die Anfangsgeschwindigkeit ist immer unabhängig von C und nur ab- hängig von der Konzentration des Ferment-Proteins F. Setzt man in den Gleichungen [1] und [2] ki ' F _ , k2 • F „ r/1, — = Ri und — = = Ro [4] 52 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste und in Gleichung [3] so kann man schreiben : statt [1] statt [2] statt [3] ki • F C2 de dt de dt de R, dt = Ri • c Ri • c — R2 (C — c) Ri • c2 [5] [la] [2a] [3a] wo die Größen R die Bedeutung von Geschwindigkeitskonstanten haben und es nach der Form der Gleichungen scheint, als ob die Reaktionsteilnehmer nach dem Massenwirkungsgesetz in der Lösung reagierten. Variiert man aber C, dann zeigt sich, daß dies ein Irrtum ist. Denn die Anfangsgeschwindigkeiten bleiben kon- stant, während sie sich nach dem Massenwirkungsgesetz mit C ändern müßten, und die Größen R erweisen sich als umgekehrt proportional C oder C2, während sie bei Variationen von C konstant bleiben müßten, wenn sie Geschwindigkeits- konstanten im Sinn des Massenwirkungsgesetzes wären. Hat man R aus dem zeitlichen Verlauf einer Fermentreaktion in reziproken Minuten berechnet, so erhält man die Geschwindigkeitskonstanten k1 und k2, in- dem man F und C in die Gleichungen [4] oder [5] einsetzt. Drückt man dabei F und C in Molen/Volumeinheiten aus, so erhält k die Dimension Mole umgesetzter Substanz Mole Protein Minuten und wird deshalb im folgenden auch als die „molare Wirksamkeit" = W molar eines Ferments bezeichnet. Zum Schluß sei bemerkt, daß für jede der 3 Differentialgleichungen [1], [2] und [3] ausführliche experimentelle Belege vorliegen, insbesondere für Gleichung [1] Biochem. Z. 282, 206 (1935), für Gleichung [2] Biochem. Z. 310, 384 (1942), für Gleichung [3] Biochem. Z. 303, 40 (1939). Aus diesen Belegen wird man erkennen, daß die untersuchten Fermentreak- tionen strenger gesetzmäßig verlaufen, als die meisten einfachen chemischen Reaktionen; und daß es keine Methoden gibt, die für kinetische Untersuchungen geeigneter wären, als die ontisrhen Teste. III. Spezifizität Wenn bei der Gärung Pyridinnukleotid Wasserstoff überträgt oder wenn Adenin- nukleotid Phosphorsäure überträgt, so hätte es so sein können, daß sich die Über- tragung an einem für die Übertragung spezifischen Protein abspielte. Doch hat sich gezeigt, daß die Spezifizität noch weitgehender ist. Wenn Pyridinnukleotid bei der Gärung von dem diphosphorylierten Glycerinaldehyd an dem Protein des oxy- dierenden Gärungsferments hydriert worden ist, so wird es an einem andern Pro- tein, dem Protein des reduzierenden Gärungsferments, durch Brenztraubensäure Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 53 wieder dehydriert; und wenn Adenosindiphosphat an dem einen Protein durch Phosphobrenztraubensäure phosphoryliert worden ist, so wird es an einem andern Protein durch Hexose wieder dephosphoryliert. Offenbar ist dieser höhere Grad von Spezifizität nur möglich, wenn die prosthetischen Gruppen der wasserstoff- oder phosphatübertragenden Fermente nicht fest, sondern dissociierend gebunden sind. Dies ist die Theorie der „Kofermente", die ich 1935 aufgestellt habe und die heute allgemein angenommen ist. Anmerkung: Wenn jeder Teil Vorgang der Gärung durch ein spezifisches Ferment bewirkt wird, so folgt aus dieser physiologischen Spezifizität keineswegs, daß die spezifischen Gärungsfermente nicht auch unphysiologische chemische Reaktionen hervorrufen können. Die Oxydation des Glycerinaldehyds zu Glycerinsäure durch das oxydierende Gärungsferment, die Reduktion des Dioxyacetons zu Glycerin durch das reduzierende Gärungsferment sind Beispiele4 unphysio- logischer Reaktionen, die zwar 1000- bis lOOOOmal langsamer verlaufen als die physiologischen Gärungsreaktionen, aber bei großen Konzentrationen an Fermenten doch gut meßbar sind. Als weitere und allgemeinere Beispiele könnte man die pharmakologischen Wirkungen anführen. Was aber ist die Ursache der physiologischen Spezifizität der Fermente ? Ist die Bindung der Substrate spezifisch oder ist die chemische Reaktion der gebundenen Substrate spezifisch? Wir haben diese Frage geprüft, indem wir zu den Testen physiologische, aber nichtreagierende Substanzen zusetzten, zum Beispiel Brenztraubensäure zum Test des oxydierenden Gärungsferments und 3-Phosphoglycerinaldehyd zum Test des reduzierenden Gärungsferments; oder Triphospho-Pyridinnukleotid zum Test des oxydierenden Gärungsferments. Wären diese Substanzen gebunden worden, so hätten sie die Teste durch Verdrängung der Reaktionsteilnehmer hemmen müssen. Wir fanden in keinem Fall eine Hemmung und schließen daraus, daß die Ursache der spezifischen Wirkung die spezifische Bindung ist. Dieses Ergebnis ist methodisch und theoretisch wichtig. In einem ncch so kom- plizierten Gemisch von Substanzen und prothetischen Gruppen wird jede Fer- mentreaktion so ablaufen, als ob alle an ihr nicht teilnehmenden Stoffe nicht vor- handenwären. So kann im Leben keine physiologische Fermentreaktion eine andere stören. IV. Beschreibung der optischen Teste In der folgenden Liste der Teste stimmen die Nummern mit der Fermentliste in der Einleitung überein. Dort findet man auch die Gleichungen der Testreaktionen die deshalb in diesem Kapitel nicht wiederholt werden. 1. Zymohexase^ Hexosediphosphat, Pyridinnukleotid, Arsensäure und oxydierendes Gärungsfer- ment sind die Komponenten des Tests, der ohne Zymohexase reaktionslos ist. Gibt man Zymohexase hinzu, so entsteht Triosephosphat, dessen Aldoform durch das oxydierende Gärungsferment zu Phosphoglyzerinsäure oxydiert wird, während gleichzeitig Dihydropyridinnukleotid, also Lichtabsorption bei 340 m// entsteht. Ist dabei das oxydierende Gärungsferment im Überschuß, so ist die Spaltung des Hexosediphosphats geschwindigkeitsbestimmend und die Geschwindigkeit, mit 54 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste der der Logarithmus der Lichtschwächung zunimmt, ist der Konzentration der Zymohexase proportional. Das Gesagte gilt für Muskel-Zymohexase. Ist das zu bestimmende Ferment Hefe-Zymohexase, so ist zu den Komponenten des Test noch Zinksulfat und Cy- stein hinzuzufügen, wodurch eine sehr kleine, aber definierte Konzentration an freiem Zinksalz erzeugt wird. 2. Isomerase6 Zu einer Lösung von Phosphat, Phosphoglycerinaldehyd und Pyridinnukleotid gibt man soviel Protein des oxydierenden Gärungsferments, daß sich das Gleich- gewicht der Oxydationsreaktion Phosphat Phosphoglycerinaldehyd Pyridinnukleotid 1,3-Diphosphoglycerinsäure Dihydropyridinnukleotid schnell einstellt. Da bei der Reaktion hydriertes Pyridinnukleotid entsteht, so ent- steht Lichtabsorption bei 340 m//, die wir im Gleichgewicht messen. Geben wir dann Isomerase zu der Gleichgewichts-Lösung, so wird Phospho- glycerinaldehyd zu Phosphodioxyaceton isomerisiert, das Gleichgewicht wird ge- stört und es muß hydriertes Pyridinnukleotid zurückreagieren, also Lichtabsorption bei 340 m// verschwinden, bis zur Einstellung eines neuen Gleichgewichts. Aus der Geschwindigkeit, mit der das erste Gleichgewicht in das zweite Gleichgewicht übergeht, kann man die Wirksamkeit der zugefügten Isomerase berechnen. 3. Oxydierendes Gärungsferment7 Zum Nachweis und zur Messung des oxydierenden Gärungsferments benutzen wir nicht die physiologische, sondern die irreversible Oxydationsreaktion, bei der (bei Gegenwart von Arsensäure) 3-Phosphoglycerinaldehyd zu 3-Phosphoglycerin- säure oxydiert wird. Es sind also die Komponenten des Tests 3-Phosphoglycerinaldehyd, Pyri- dinnukleotid und Arsensäure. Gibt man das Protein des oxydierenden Ferments hinzu, so beginnt die Reaktion und es entsteht Dihydropyridinnukleotid, also Licht- absorption bei 340 rn.fi. Zu beachten ist bei dem Test, daß das oxydierende Gärungsferment durch sehr kleine Mengen von Schwermetallsalzen geschädigt wird. Z. B. hemmen die kleinen Mengen Kupfersalz, die im Blutserum normalerweise vorkommen, das Ferment schon sehr erheblich. Es ist deshalb zweckmäßig, bei dem Test Komplexbildner zuzusetzen, von denen sich Pyrophosphat besonders bewährt hat. Pyrophosphat hemmt das Ferment nicht nur nicht, sondern es fördert die Wirkung durch Be- seitigung hemmender Schwermetallsalze. Wenn aber das oxydierende Ferment bei den optischen Testen als Hilfsferment zur Bestimmung anderer Fermente benutzt wird, so kann man wegen der Kom- plexbildner in Schwierigkeiten geraten, zum Beispiel wenn die andern Fermente zu ihrer Wirkung Magnesium oder Zink oder Eisen benötigen. Dann würde durch den Komplexbildner das oxydierende Ferment zwar gefördert, aber die zu be- stimmenden Fermente würden gehemmt. In dem Test zur Bestimmung der Hefe- Zymohexase ist diese Schwierigkeit überwunden worden, indem wir Cystein als Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 55 Komplexbildner und außerdem Zinksulfat zusetzten; genug Zink, um die Hefe- Zymohexase zu aktivieren, aber so wenig Zink, daß das oxydierende Ferment, das bei diesem Test Hilfsferment ist, nicht geschädigt wurde. Die Spanne zwischen aktivierender und vergiftender Konzentration des Zinks war dabei durchaus nicht, wie man hätte befürchten können, eng; sondern lOmal soviel Zink, als zur Akti- vierung der Zymohexase notwendig war, vergiftete das oxydierende Ferment nicht. Doch ist bei der Verwendung von Cystein als Komplexbildner Vorsicht erfor- derlich, weil Cystein mit 3-Phosphoglycerinaldehyd unter Bildung von Thioace- talen oder Thiohalbacetalen reagiert. Trotzdem kann man beim Zymohexasetest Cystein als Komplexbildner verwenden, da hier der 3-Phosphoglycerinaldehyd in statu nascendi durch das oxydierende Ferment weggefangen wird; aber man könnte Cystein beim Test des oxydierenden Gärungsferments nicht verwenden, weil hier der Phosphoglycerinaldehyd, der hier zu den Komponenten des Tests gehört, Zeit hätte, mit dem Cystein zu reagieren. 4. Erstes dephosphorylierendes Ferment Wie beim Isomerase-Test erzeugt man zunächst das Gleichgewicht der Oxydations- reaktion. Anders als beim Isomerase-Test setzt man dabei so wenig Phosphat zu, daß nur wenig hydriertes Pyridinnukleotid, also nur wenig Lichtabsorption bei 340 mit entsteht. Entfernt man aber die 1,3-Diphosphoglycerinsäure aus der Lö- sung, indem man sie zu 3-Phosphoglycerinsäure dephosphoryliert, so geht die Oxydationsreaktion von links nach rechts weiter und es entsteht mehr hydriertes Pyridinnukleotid, also mehr Lichtabsorption bei 340 m//. Die Komponenten des Tests sind demnach: 3-Phosphoglycerinaldehyd, Pyri- dinnukleotid, Phosphat, Magnesiumsulfat und Adenosindiphosphat. Zunächst setzt man das Protein des oxydierenden Gärungsferments zu und mißt die nun auf- tretende Lichtabsorption bei 340 m/t. Hat man genug Protein zugesetzt, so wird diese Absorption sehr schnell (in einigen Sekunden) konstant. Fügt man dann das Protein des dephosphorylierenden Ferments zu, so nimmt die Lichtabsorption bei 340 m// zu, und aus der Geschwindigkeit dieser Zunahme kann man die Wirksam- keit des dephosphorylierenden Ferments berechnen. Mit Hilfe dieses Tests ist das Protein des ersten dephosphorylierenden Ferments unter meiner Leitung von Th. Bücher73 aus Hefe isoliert und kristallisiert worden. 5. Mutase8 Zu einer Lösung von 2-Phosphoglycerinsäure geben wir Magnesiumsulfat und soviel Enolase-Protein, daß sich das Gleichgewicht der Reaktion 2-Phosphoglycerinsäure ^ Phosphobrenztraubensäure + H^O schnell einstellt. Da die Phosphobrenztraubensäure (vergl. Test 6) bei 240 mu absorbiert, so entsteht bei der Reaktion Lichtabsorption bei 240 m/i, die wir im Gleichgewicht messen. Fügen wir dann Mutase zu der Lösung, so wird das Gleichgewicht durch die Reaktion 2-Phosphoglycerinsäure ü 3-Phosphoglycerinsäure 56 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste gestört, und Phosphobrenztraubensäure reagiert zu 2-Phosphoglycerinsäure zu- rück, das heißt, es verschwindet Lichtabsorption bei 240 m/i. Aus der Geschwindig- keit, mit der diese Absorption zurückgeht, kann man die Wirksamkeit der Mutase berechnen. 6. Enolase8 Gibt man zu einer Lösung von 2-Phosphoglycerinsäure und Magnesiumsulfat Enolase-Protein, so entsteht Phosphobrenztraubensäure, die als Enolverbindung bei 240 m// absorbiert. Aus der Geschwindigkeit, mit der diese Absorption zu- nimmt, kann man die Wirksamkeit der Enolase berechnen. Dies ist der einfachste unsrer optischen Teste. Doch hat er den Nachteil der Kurzwelligkeit. Bei 240 m// absorbieren die Nukleinsäuren, die Proteine und viele andere Stoffe und der Betrag dieser Absorptionen ist in jedem Fall durch Messun- gen zur Zeit Null zu bestimmen. Bei Testen, die auf der Dihydropyridin-Absorp- tion beruhen, sind derartige Nullpunktmessungen überflüssig, da Lichtabsorp- tionen im langwelligen ultraviolett bei 340 m// gegen die Dihydropyridin- Absorp- tion fast immer zu vernachlässigen sind. 7. Zweites dephosphorylierendes Ferment Das Ferment, das die Phosphobrenztraubensäure dephosphoryliert, kann man auf zweierlei Art optisch bestimmen, bei 240 m// und bei 340 mu. Bei 240 m/i. Die Komponenten des Tests sind: Phosphobrenztraubensäure, Magnesiumsulfat und Adenosindiphosphat. Gibt man das Protein des dephospho- rylierenden Ferments hinzu, so verschwindet Phosphobrenztraubensäure, die voll- ständig enolisiert ist, und an ihre Stelle tritt Brenztraubensäure, die bei neutraler Reaktion nur zu einem kleinen Teil enolisiert ist. Es verschwindet also Licht- absorption bei 240 m/t ; und aus der Geschwindigkeit, mit der dies geschieht, kann man die Wirksamkeit des dephosphorylierenden Ferments berechnen. Bei dem Test stört der hohe Nullwert der Lichtabsorption, hervorgerufen durch das Adenin des Adenosindiphosphats. Adenin absorbiert bei 240 m/u etwa doppelt so stark wie Phosphobrenztraubensäure. Bei 340 m//. Die Komponenten des Tests sind: Phosphobrenztraubensäure, Magnesiumsulfat, Adenosindiphosphat, Dihydropyridinnukleotid und Protein des reduzierenden Gärungsferments. Dieses Gemisch ist reaktionslos. Fügt man aber das Protein des dephosphorylierenden Ferments hinzu, so entsteht Brenz- traubensäure, die sofort von dem reduzierenden Ferment zu Milchsäure hydriert wird. Es verschwindet also Lichtabsorption bei 340 m//,und aus der Geschwindig- keit, mit der dies geschieht, kann man die Wirksamkeit des dephosphorylierenden Ferments berechnen. Mit Hilfe dieses Tests hat Negelein unter meiner Leitung das Protein des zweiten dephosphorylierenden Ferments aus Hefe isoliert und kristallisiert. 8. Reduzierendes Gärungsferment9 Brenztraubensäure und Dihydropyridinnukleotid sind die Komponenten des Tests, bei dem hydriertes Pyridinnukleotid, also Lichtabsorption bei 340 m/t, verschwindet. Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 57 Die Testreaktion ist zwar reversibel, aber sie verläuft, ihrem Zweck bei der Gärung entsprechend fast vollständig in der Richtung der Hydrierung der Brenztrauben- säure. Geht man von äquivalenten Mengen Brenztraubensäure und hydriertem Pyridinnukleotid aus, so macht die Reaktion erst halt, wenn mehr als 99% der Brenztraubensäure zu Milchsäure hydriert worden sind. Die Gleichgewichts- konstante der Reaktion ist 6 x 10~5 bei 22° und neutraler Reaktion. Mit Hilfe des optischen Tests sind die Proteine der reduzierenden Gärungs- fermente aus Muskeln und aus Tumoren der Ratte isoliert worden. Das Protein des reduzierenden Gärungsferment aus Hefe, dessen Substrat Acetaldehyd ist, kann Proteine, deren Substrat Brenztraubensäure ist, nicht ersetzen. 9. Adenosintriphosphata.se Gibt man zu Phosphobrenztraubensäure eine kleine Menge Adenosindiphosphat und das Protein des zweiten dephosphorylierenden Ferments, so wird eine kleine, dem Adenosindiphosphat äquivalente Menge Phosphobrenztraubensäure dephos- phoryliert, und es bildet sich eine kleine Menge Adenosintriphosphat. Fügt man dann Adenosintriphosphatase hinzu, so wird das Triphosphat zu Diphosphat und freier Phosphorsäure gespalten, und es kann neue Phosphobrenztraubensäure dephosphoryliert werden, bis schließlich die gesamte Phosphobrenztraubensäure in Brenztraubensäure und freie Phosphorsäure gespalten worden ist. Beobachten wir diese Vorgänge durch Absorptionsmessungen bei 240 mu, so verschwindet zunächst, da nur wenig Phosphobrenztraubensäure verschwindet, nur wenig Lichtabsorption. Nach Zusatz der Adenosintriphosphatase aber ver- schwindet die gesamte von der Phosphobrenztraubensäure herrührende Licht- absorption, und aus der Geschwindigkeit, mit der dies geschieht, kann man die Wirksamkeit der Adenosintriphosphatase berechnen. Es sei hervorgehoben, daß hier, anders als bei Test 7, die Absorption des Adenins des Adenosinphosphats nicht stört, da hier das Adenosinphosphat Katalysator und seine Konzentration so klein ist, daß sie optisch zu vernachlässigen ist. 10. Erstes phosphorylierendes Ferment Es bleiben noch die Reaktionen, die den Kreislauf des gebundenen Phosphats schließen; die stufenweise Phosphorylierung der Hexose durch Adenosintriphos- phat zu Hexose-6-Phosphat und Hexosediphosphat. Der optische Nachweis der bei- den Reaktionen gelang uns bisher nur für Lebedewsaft, aber nicht für Muskelsaft. Die Komponenten des ersten Tests waren Glukose, Adenosintriphosphat, Magnesiumsulfat und zwei gärungsfremde Substanzen, Triphospho-Pyridin- nukleotid und ein Protein, das ich, ehe wir die Bindung der Kofermente an die Proteine entdeckt hatten, „Zwischenferment" genannt habe. Es ist die Protein- Komponente des Ferments, das 6-Phospho-Glukose zu 6-Phosphohexonsäure oxydiert. Ohne das Protein des ersten phosphorylierenden Ferments ist der Test reak- tionslos. Fügt man aber das Protein hinzu, so entsteht 6-Phospho-Glukose, die sofort zu 6-Phosphohexonsäure oxydiert wird: Phospho-Glukose + Pyridinnukleotid + HoO = Phosphohexonsäure — Dihydropyridinnukleotid 58 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste Es entsteht also, wenn die Glukose zu Monophosphat phosphoryliert wird, Lichtabsorption bei 340 m/>, und aus der Geschwindigkeit, mit der dies ge- schieht, kann man die Wirksamkeit des ersten phosphorylierenden Ferments berechnen. Mit der gleichen Hilfsreaktion haben wir die Mutierung des Coriesters l-Phosphoglukose 5± 6-Phosphoglukose optisch nachgewiesen. Die Komponenten des Tests waren dabei Coriester, Triphospho-Pyridinnukleotid, Magnesiumsulfat und Zwischenferment. Bei Zu- satz des Mutase-Proteins entstand dann Lichtabsorption bei 340 m/t. 11. Zweites phosphory Her ende s Ferment. Um die Phosphorylierung von Hexosemonophosphat zu Hexosediphosphat optisch nachzuweisen, fügen wir Zymohexase, Arsensäure und oxydierendes Gärungs- ferment zu den Testlösungen hinzu. Sind die beiden Hilfsfermente im Überschuß, so wird das entstehende Hexosediphosphat sofort gespalten, und die Aldoform des Triosephosphats wird sofort zu Phosphoglycerinsäure oxydiert, wobei Dihydro- pyridinnukleotid, also Lichtabsorption bei 340 m/t entsteht. Aus der Geschwindig- keit, mit der diese Lichtabsorption zunimmt, kann man die Wirksamkeit des phosphorylierenden Ferments berechnen. Die Komponenten des Tests sind also Hexosemonophosphat, Magnesiumsulfat und Adenosintriphosphat ; und als Hilfssystem Zymohexase, Pyridinnukleotid, Arsensäure und Protein des oxydierenden Gärungsferments. Gibt man zu dieser Lösung, die reaktionslos ist, Protein des zweiten phosphorylierenden Ferments, so entsteht Hexosediphosphat, und die Spaltung und die Oxydation der Spaltungs- produkte beginnt. 12. Carboxylase. Der Vollständigkeit wegen sei erwähnt, daß man auch Carboxylase optisch be- stimmen kann. Wir lösen Brenztraubensäure in m/10 Acetatpuffer von pH 5,3 zu einer Konzentration von 1/200 molar, messen die Lichtabsorption bei 240 m/t für eine Schichtdicke von 0,5 cm und geben dann Carboxylase zu der Lösung. Dann verschwindet die Lichtabsorption in dem Maße, als die Brenztraubensäure zu Acetaldehyd und Kohlensäure gespalten wird. Die Methode beruht auf der Tat- sache, daß Brenztraubensäure bei pH 5,3 zwar nur zu einem kleinen Teil, aber doch optisch noch ausreichend enolisiert ist. (ßmoiar = 6 • 105 cm2/Mole Brenz- traubensäure). V. Vorbemerkung über die kristallisierten Fermente Die gut ausgearbeiteten Isolierungsverfahren von Gärungsfermenten sind ganz einfache Verfahren. Das oxydierende Gärungsferment der Hefe, die Enolase der Hefe, die Zymohexase des Muskels kann man heute grammweise mit einem Arbeitsaufwand von nur einigen Tagen in reinem Zustand gewinnen; und man kann die reinen Fermente, sofern sie von proteolytischen Fermenten völlig befreit Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 59 sind, bei 0° jahrelang ohne Wirkungsverlust aufbewahren. Die Unbeständigkeit der Fermente ist eine Schwierigkeit, die überwunden ist.* Will man ein Gärungsferment für katalytische Versuche benutzen, so kommt es darauf an, daß die andern Gärungsfermente entfernt worden sind; daß also zum Beispiel das oxydierende Gärungsferment frei ist von Isomerase und Zymohexase, die Enolase frei ist von Mutase usw. Der hierfür erforderliche Reinheitsgrad ist meistens nach einmaligem Umkristallisieren erreicht. Dagegen ist ein höherer Reinheitsgrad und vielfaches Umkristallisieren er- forderlich, wenn man die stöchiometrischen Reaktionen der Fermente, auf denen ihre katalytischen Reaktionen beruhen, untersuchen will. Dann sind wegen des großen Molekulargewichts der Fermente und wegen des kleinen Molekulargewichts der Wirkungsgruppen die reinsten Fermente noch zu unrein und Verunreinigun- gen von 0,1 %3 in der gewöhnlichen Chemie eine erlaubte Fehlergrenze, können Wirkungsgruppen vortäuschen oder die Entdeckung von Wirkungsgruppen ver- hindern. Nach dem Gesagten ist es auch klar, daß die Elementaranalyse keine Methode ist, mit der das Problem der Wirkungen der Fermente untersucht werden kann. Doch haben wir wegen der Klassifizierung der Ferment-Proteine unsere Kristalle analysiert; die Ergebnisse sind in den Originalarbeiten mitgeteilt. Erwähnenswert ist, daß wir in den meisten Fermentproteinen etwa 1 % Schwefel, in dem Enolase- protein aber nur 0,38 % Schwefel fanden. Die Ultraviolett-Banden der Fermentproteine, die von dem Tryptophan und dem Tyrosin der Proteine herrühren, fanden wir von bemerkenswert gleicher Höhe, Zum Beispiel : molarer Absorptionskoefficient bei 280 m// cm- Zymohexase aus Muskeln 2,0 10:! Enolase-Protein aus Hefe 2,06 10;! Protein des oxydierenden Gärungsferments aus Hefe 2,16 10:J VI. Kristallisation des Proteins des oxydierenden Gärungsferments7 Das Protein des oxydierenden Gärungsferments ist 1939 aus Hefe mit Hilfe des optischen Tests 3 isoliert worden. Zwei neue für die Fermentchemie wichtige Methoden sind dabei entwickelt worden: die Fraktionierung von Ferment-Pro- teinen als Nukleoproteide durch Variation der Konzentration der Wasserstoffionen und die Kristallisation von Ferment-Proteinen aus Ammonsulfat unter Zusatz von starkem Ammoniak. Wie die meisten Ferment-Proteine ist auch das Protein des oxydierenden Gärungsferments in Wasser sehr leicht löslich, während die Nukleinsäurever- bindung, die etwa 20% Nukleinsäure enthält, in salzarmem Wasser bei saurer Reaktion fast unlöslich ist. Befreit man also Hefesaft, der in der Regel reichlich * Zusatz 1961. Im wesentlichen nach diesen Methoden werden die reinen Stoff- wechselfermente gewonnen, die C. F. Böhringer (Mannheim -Waldhof), sehr zum Nutzen der Wissenschaft, seit einigen Jahren in den Handel bringt. 60 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste Nukleinsäure enthält, durch irgendeine Vorbehandlung von dem Hauptteil seiner Salze, setzt zur Sicherheit noch nukleinsaures Natrium hinzu und säuert mit Essig- säure an, so fallen Nukleoproteide aus und zwar je nach der Azidität, bis zu der angesäuert wurde, verschiedene Nukleoproteide. Bei pH 4,5 fällt das Nukleopro- teid des Proteins des oxydierenden Ferments. Man kann es ohne Wirkungs verlust auf der Zentrifuge waschen, es dadurch von vielen Begleitstoffen befreien und es auch, was methodisch oft von Vorteil ist, schnell beliebig stark konzentrieren. Um das Protein aus seiner Nukleinsäureverbindung wieder in Freiheit zu setzen, suspendieren wir das Nukleoproteid in wenig Wasser, lösen es durch tropfen- weisen Zusatz von Natronlauge bis pH 6 und fügen Protaminsulfat hinzu. Dabei fällt die Nukleinsäure als Protaminsalz aus, während das Protein in Lösung bleibt. Wegen der folgenden Kristallisation ist es wichtig, daß die Nukleinsäure mög- lichst vollständig abgetrennt wird. Wir prüfen den Erfolg unsrer Trennungs- methode optisch, indem wir die Lichtabsorption der Lösungen, die von Nuklein- säure befreit werden sollen, bei 260 m/< und 280 m/i vergleichen. Proteine haben ihr Maximum bei 280 m//, während das Maximum der Nukleinsäureabsorption bei 260 mit liegt. Zur Kristallisation versetzen wir eine 10%ige Lösung des Proteins bis zur Halb- sättigung mit Ammonsulfat und fügen zu der klaren Lösung 1/2obis 1/w ihres Vo- lumens Normal-Ammoniak. Dann erscheinen bald Nadeln und nach einigen Stun- den ist die Flüssigkeit zu einem Brei reiner Kristalle erstarrt. Auch in andern Fällen hat sich diese Methode der Kristallisation bewährt. Das Protein enthält keinen Phosphor. Es verbrennt ohne Rückstand, enthält also keine Metalle. Auch für dissociierende Bindung von Metallen haben sich bis- her keine Anhaltspunkte ergeben. Die prosthetische Gruppe des Ferments ist Diphospho-Pyridinnukleotid, dessen hydrierte und nicht hydrierte Formen gleich fest von dem Protein gebunden wer- den. Die Gleichgewichtskonstante dieser Bindungen hat bei 25° und pH 7,5 den Wert: Protein X Nukleotid . o « . in-; Proteid Mole Liter Die molare Wirksamkeit in der Richtung der Gärung beträgt bei 20° und pH 7,4, wenn wir mit dem von Bücher mit der Streulichtmethode gefundenen Mol. Gewicht 96000 rechnen: Wmoiar = 17000 Mole Substrat/Mole Ferment ; Minuten. VII. Oxydationsreaktion der Gärung Als wir das Nikotinsäureamid und seine wasserstoffübertragende Funktion bei der Gärung entdeckt hatten, war es sofort klar, und ließ es sich durch einfache Ver- suche beweisen, daß die Gärungsreaktion, in der das hydrierte Nikotinsäureamid seinen Wasserstoff wieder abgibt, die Hydrierung des Acetaldehyds oder der Brenz- traubensäure ist: Dihydro-Nikotinsäureamid + Acetaldehyd == Nikotinsäureamid + Aethylalkohol Dihydro-Nikotinsäureamid -j Brenztraubensäure = Nikotinsäureamid ! Milchsäure. Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 61 Dagegen wurde die Gärungsreaktion, in der das Nikotinsäureamid den Wasser- stoff aufnimmt — die Oxydationsreaktion der Gärung — erst aufgeklärt, nachdem das Protein des oxydierenden Ferments isoliert worden war. Warum diese Iso- lierung die notwendige Vorbedingung war, wird sich aus dem folgenden ergeben. Der Schlüssel-Versuch für die Oxydationsreaktion, ausgeführt mit kristalli- siertem Protein, ist in Figur 2 graphisch dargestellt. Man erkennt aus der Figur, daß die Oxydationsreaktion eine reversible Reaktion ist; daß die Phosphorsäure an der Reaktion beteiligt ist; und daß die Oxydation des Substrats um so voll- ständiger verläuft, je höher die Konzentration der freien Phosphorsäure ist. Qualitativ kann man die Beteiligung des Phosphats an der Oxydationsreaktion der Gärung durch einen einfachen Versuch demonstrieren. Im Licht der Queck- silberlinie 366 m/t zeigt das Dihydro-Pyridinnukleotid eine lebhafte weiße Fluo- rescenz, während die andern Teilnehmer der Oxydationsreaktion hier nicht fluorescieren. Läßt man also die Oxydationsreaktion vor dem Schwarzglas einer Analysen-Quecksilberlampe vor sich gehen, so kann man den Verlauf der Reak- tion durch Beobachtung der Fluorescenz sehen. Man löse zum Beispiel einige mg 3-Phosphoglycerinaldehyd und einige 1/10 mg Pyridinnukleotid in 3 cm3 m/100 Pyrophosphat von pH 7,9 und bringe die Lösung vor das Schwarzglas der Lampe. Die Lösung bleibt dunkel, auch wenn man einige y des Proteins des oxydierenden Gärungsferments hinzufügt. Läßt man aber einen Tropfen einer m/10 Orthophosphatlösung vorsichtig in die Lösung hineinfallen, so sinkt der Tropfen hell leuchtend zu Boden und schüttelt man dann um, so leuchtet die ganze Lösung hell auf. Figur 2. Oxydationsreaktion der Gärung 3-Phosphoglycerinaldehyd f- Pyridinnukleo- tid - Phosphat. Bei t(l 3/ des Proteins des oxydierenden Gärungsferments. In —7-, der i Logarithmus der Lichtschwächung, ist der Konzentration des Dihydro-Pyridinnukleotids proportional. /. 340 m/r, d == 0,557 cm; 20°. Kurve I : 0,87 • 10-6 Mole Phosphat pro cm3 • pH 7,4. Kurve II: 1,68 • IO-5 Mole Phosphat pro cm:! • pH 7,4. Kurve III: 3,36 ■ 10-5 Mole Phosphat pro cm3 • pH 7,4. Kurve IV: 3,36 • IO-5 Mole Phosphat pro cm3 • pH 8,45 2,2 2,0 1,8 1.6 1,1 12 K 0,8 0,6 0,1 02 """ In -?-für vollständige Reduk fion des Pyridins n^. m_^ #., c < > c >— — —0 /„ r 2 15 6 Minuten 10 Zur Erklärung der Phosphatwirkung habe ich angenommen*, daß sich zunächst Phosphorsäure an die Aldehydgruppe des Phosphoglycerinaldehyds anlagert, unter Bildung eines Phosphorsäureesters des Orthoaldehyds : * Zusatz 1961. Ist inzwischen bewiesen worden. Vergl. Arbeiten 23 und 24 die- ses Buchs. 62 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste CH0OPO3H2 CH2OPO3H2 I I CHOH + H3PO4 ^ CHOH [1] /H CHO ce-OH XOP03H2 Wahrscheinlich ist dies keine Fermentreaktion, sondern eine in der Lösung von selbst verlaufende Reaktion. Zur Begründung führe ich an10, daß nicht phosphory- lierter Glycerinaldehyd in wässriger neutraler Lösung — also ohne Mitwirkung eines Ferments — mit Phosphat reagiert und daß durch diese Reaktion die Aldehyd- gruppe des Glycerinaldehyds gegen Oxydationsmittel aktiviert wird. Ist durch die Reaktion [1] der diphosphorylierte Glycerinaldehyd entstanden, so wird er von dem Protein des oxydierenden Gärungsferments gebunden und wird hier von dem Pyridinnukleotid zu diphosphorylierter Glycerinsäure oxydiert: CH0OPO3H0 CH2OPO3H2 I " I CHOH + Pyridinnukleotid ^ CHOH + Dihydropyndinnukleotid [2] ceoH C00PO3H2 XOP03H2 Die 1,3-Phosphoglycerinsäure haben wir isoliert11. Sie ist unbeständig, zerfällt schon in wäßriger Lösung bei neutraler Reaktion und reagiert so schnell an dem Ferment zurück, daß man einen merklichen Umsatz von links nach rechts nur durch relativ große Konzentrationen an Phosphat und 3-Phosphoglycerinaldehyd erzielen kann. Deshalb ist es notwendig, daß das Protein des oxydierenden Gärungsferments rein ist. Enthält es Isomerase oder Zymohexase, so wird der 3-Phosphoglycerin- aldehyd fast vollständig zu Phospho-Dioxyaceton isomerisiert und zu Hexose- diphosphat kondensiert und die noch übrigbleibende Konzentration des3-Phospho- glycerinaldehyds reicht nicht mehr aus für einen merklichen Umsatz von links nach rechts in der Reaktion [2]. Die Arsensäure kann die Phosphorsäure bei der Oxydationsreaktion insofern ersetzen, als 3-Phosphoglycerinaldehyd auch bei Zusatz von Arsensäure oxydiert wird. Aber das Oxydationsprodukt, von dem man erwarten sollte, daß es eine in 1 -Stellung arsenylierte 3-Phosphoglycerinsäure wäre, ist gewöhnliche 3-Phospho- glycerinsäure; und da 3-Phosphoglycerinsäure nicht zurückreagiert, so ist die Oxydationsreaktion bei Gegenwart von Arsensäure eine nicht reversible voll- ständig verlaufende Reaktion. Wahrscheinlich reagiert die Arsensäure in den Reaktionen [1] und [2] genauso wie die Phosphorsäure, aber die in 1- Stellung arsenylierte 3-Phosphoglycerinsäure ist so unbeständig, daß sie schon in statu nascendi in Arsensäure und 3-Phospho- glycerinsäure zerfällt. So kommt es, daß die Arsensäure, thermodynamisch be- trachtet, kein Teilnehmer, sondern Katalysator der Oxydationsreaktion ist. Dies ist nur eine Theorie. Aber es spricht für die Theorie, daß sie die bisher völlig rätselhafte Wirkung der Arsensäure bei der Oxydationsreaktion einfach und einleuchtend erklärt. Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 63 VIII. Harden-Youngsche Gleichung Wenn bei der Oxydationsreaktion der Gärung die 1,3-Phcsphoglycerinsäure ent- standen ist, so folgt im weiteren Verlauf der Gärung die Dephosphorylierung der Säure in zwei Schritten: in dem ersten Schritt wird sie in 1-Stellung dephosphory- liert und es entsteht 3-Phosphoglycerinsäure, die dann über 2-Phosphoglycerin- säure in Phosphobrenztraubensäure übergeht. In dem zweiten Schritt wird die Phosphobrenztraubensäure zu Brenztraubensäure dephosphoryliert. Jede der bei- den Dephosphorylierungen geschieht durch Adenosindiphosphat, das selbst dabei zu Adenosintriphosphat phosphoryliert wird. Im ganzen entstehen jedesmal, wenn 1 Molekül Hexose zu Milchsäure oder Alkohol und Kohlensäure gespalten wird, 4 Moleküle Adenosintriphosphat. Gehen wir, indem wir den Kreislauf der Gärungsreaktionen verfolgen, von diesen 4 Molekülen Adenosintriphosphat aus, so werden in gärenden Zellen 2 Moleküle zu Adenosindiphosphat und Phosphorsäure hydrolysiert, während die andern beiden 1 Molekül Hexose zu Hexosediphosphat phosphorylieren. Würde diese Zweiteilung der Reaktionen des Adenosintriphosphats im Leben nicht ein- gehalten, so würde die Gärung schnell zum Stillstand kommen : durch Mangel an gebundenem Phosphat, wenn zuviel Adenosintriphosphat hydrolysiert würde; oder durch Mangel m freiem Phosphat, wenn zuviel Adenosintriphosphat zur Phosphory- lierung der Hexose verwendet würde. Wird aber die Zweiteilung eingehalten und haben sich die 4 Moleküle Adenosin- triphosphat, von denen wir ausgingen, im Kreislauf der Gärungsreaktionen wieder zurückgebildet, so sind das freie und das gebundene Phosphat konstant geblieben, während 1 Molekül Hexose verschwunden ist und 2 Moleküle Milchsäure oder Alkohol und Kohlensäure entstanden sind. In der lebenden Zelle ist also das Phosphat, thermodynamisch betrachtet, Katalysator, sowohl das gebundene als auch das freie Phosphat. Anders in Zellextrakten, zum Beispiel in Lebedewsaft von Hefezellen, in dem die Adenosintriphosphatase im wesentlichen fehlt. Hier reagieren von den 4 Molekülen Adenosintriphosphat nicht 2, sondern alle 4 Moleküle mit Hexose und es entstehen nicht 1 Molekül, sondern 2 Moleküle Hexosediphosphat. Verfolgt man unter diesen Umständen die Gärungsreaktionen bis zur Wiederbildung der 4 Moleküle Adenosintriphosphat, so sind hier weder das freie noch das gebundene Phosphat konstant geblieben; sondern das freie Phosphat hat (bei der Oxydations- reaktion) um 2 Moleküle abgenommen, während das gebundene Phosphat um 2 Moleküle, nämlich um 1 Molekül Hexosediphosphat, zugenommen hat. Die Bilanz für einen Kreislauf der Gärungsreaktionen ist also : 2 Phosphat — 1 Hexose = 1 Hexosediphosphat :- 2 Wasser 1 Hexose = 2 Kohlensäure + 2 Alkohol Bilanz : 2 Phosphat - 2 Hexose = 1 Hexosediphosphat - 2 Wasser + 2 Kohlensäure - 2 Alkohol. Dies ist die berühmte Gleichung von Harden und Young12, die man heute nach langen Jahren endlich versteht. Heute weiß man auch, warum es kein Einwand gegen die physiologische Bedeutung der Phosphorylierung war, daß lebende Hefe in phosphatfreier Lösung beliebige Mengen Zucker vergären kann. Denn im 64 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste Leben wirkt das Phosphat katalytisch; in Hefesaft wirkt es stöchiometrisch, weil in Hefesaft das Ferment fehlt, das die bei der Oxydationsreaktion gebundene Phosphorsäure wieder frei macht. Diesem glücklichen Umstand, daß in Hefesäften von den 12 Gärungsfermenten der Hefe eines fehlt, verdankt man also die weit- tragende Entdeckung von Harden und Young. Anmerkung: Den Versuch von Harden und Young, der die stöchiometrische Wirkung der Phosphorsäure bei der Gärung demonstriert und den man jedem Studenten der Biochemie zeigen sollte, führen wir folgendermaßen aus : In einem Manometergefäß mit Ansatzbirne werden 2 cm3 Lebedewsaft, der 5",, Glukose enthält und dessen pH 6 ist, solange geschüttelt, bis die Gärung sehr schwach geworden ist. Gibt man dann aus der Ansatzbirne 5 Mikromole Phosphat in den Hauptraum (wobei pH 6 bleiben soll), so setzt alsbald eine stürmische Entwicklung von Gärungs- kohlensäure ein, die wieder aufhört, wenn 5 Mikromole Kohlensäure entwickelt worden sind, also geradesoviel als man Phosphat zugegeben hatte. Würde hier die Phosphorsäure katalytisch wirken wie in lebenden Zellen, so würde die schnelle Gärung erst aufhören, wenn der gesamte Zucker des Lebedewsaftes vergoren wäre; wenn also nicht 5, sondern 1100 Mikromole Kohlensäure entwickelt worden wären. IX. Kristallisation des Enolase-Proteins8 Das Enolase-Protein ist mit Hilfe des optischen Tests 6 aus Hefe isoliert worden. Eine neue Methode der Kristallisation von Ferment-Proteinen ist dabei entdeckt worden: die Kristallisation der Proteine als Quecksilbersalze. Ich kam auf die Methode bei Versuchen, das Enolase-Protein durch Fällung mit Ammonsulfat zu kristallisieren. Dabei waren den amorphen Niederschlägen immer dann vereinzelte Kristalle beigemischt, wenn die Proteinlösungen vorher mit Mercks Faserton geschüttelt worden waren. Da nun Mercks Faserton unter Zusatz von Quecksilbersalzen hergestellt wird, und da Proteinlösungen in Berührung mit diesem Faserton Quecksilbersalze aufnehmen, so setzten wir bei unsern Kristalli- sationsversuchen Quecksilbersalze zu. Tatsächlich fiel nach Zusatz von viel Mer- curisulfat zu einer Lösung von Protein in ammoniakalischem Ammonsulfat das gesamte Enolase-Protein als kristallinisches Quecksilbersalz aus. Kein anderes Metall, auch nicht Cadmium, konnte hierbei das Quecksilber vertreten. Die Methode ist seitdem mit Erfolg auf andere Ferment-Proteine angewandt worden, ist also nicht spezifisch für Enolase-Protein. Bücher und Lüttgens fanden in dem Quecksilbersalz der Enolase 0,3 % Queck- silber, also in 66000 Gramm 1 Grammatom Quecksilber. Dies stimmt zu Mole- kulargewichtsbestimmungen mit der Streulichtmethode, bei denen Bücher für das Enolase-Protein 68000 fand. Das Quecksilbersalz der Enolase ist katalytisch unwirksam. Entfernt man aber das Quecksilber durch Dialyse gegen Kaliumcyanid oder gegen Cystein, so findet man die volle Wirksamkeit des Ausgangsmaterials wieder, falls es rein war; oder eine höhere Wirksamkeit, falls das Ausgangsmaterial noch unrein war. Bei der Isolierung des Enolase-Proteins war die Kristallisation als Quecksilbersalz der letzte Schritt; die Wirksamkeit des Proteins stieg dabei auf das doppelte. Später habe ich beobachtet, daß man das Quecksilbersalz des Enolase-Proteins auch direkt, ohne das Quecksilber vorher zu entfernen, im Enolase-Test verwen- den kann, wenn man der Testlösung eine kleine, etwas mehr als äquivalente Menge Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 65 Cystein zusetzt. Dann entzieht das Cystein dem Quecksilbersalz sofort das Queck- silber, und die Ferment-Wirkung setzt ohne nachweisbare Verzögerung ein. Es sei darauf hingewiesen, daß Cystein und das Quecksilbersalz des Cysteins bei der Wellenlänge des Enolase-Tests (240 m//) stark absorbieren; daß aber diese Ab- sorption wegen der sehr kleinen Cysteinmengen, die zur Zerlegung der Queck- silberverbindung notwendig sind, nicht stört. Schon bei unsern ersten Vorversuchen mit roher Enolase fanden wir, daß an der Enolasewirkung eine dialysierbare Substanz beteiligt ist. Tatsächlich ist die aktive Enolase ein dissociierendes Magnesium-Proteid, dessen Dissociationskonstante bei 20° und pH 7,4 den Wert hat: Mole Mg Protein K = cjjg ■ = 0,6 • 10 J Proteid Liter Unter den gleichen äußeren Bedingungen ist die molare Wirksamkeit der Eno- lase in der Richtung der Gärung, berechnet mit dem Molekulargewicht 68000 Wmoiar = 6800 Mole Substrat/Mole Ferment • Minuten. X. Fluoridhemmung der Enolase Seit Effront im Jahre 1890 entdeckte, daß Fluoride die Gärung hemmen, ist die Fluoridhemmung viel diskutiert worden, zuletzt von Meyerhof und Lohmann, die fanden, daß die Enolase besonders fluoridempfindlich ist und die daran die richtige Vermutung knüpften, die Fluoridhemmung der Gärung beruhe auf der Fluoridhemmung der Enolase. Niemand aber konnte den chemischen Mechanis- mus der Fluoridhemmung erklären, ehe der Aktivator der Enolase gefunden war. Gehen wir bei unsern Erklärungsversuchen von dem physiologischen Aktivator der Enolase, dem Magnesium aus, so liegt die Annahme nahe, daß Fluorid das freie Magnesiumsalz der Lösungen zu Magnesiumfluorid binde und dadurch die Dissociation des Ferments in inaktives Protein und Magnesiumsalz bewirke. Dann müßte um so mehr Fluorid zur Hemmung der Enolase notwendig sein, je größer die Konzentration des Magnesiums wäre. Wir fanden das Gegenteil. Zum Beispiel waren die Fluorid-Konzentrationen, die halbe Hemmung der Eno- lase bewirkten, bei pH 6,74 in m/20 Phosphat: MgS04 [Mole/ Liter] 1 x 10"3 2,7 • lO-3 27 ; 10-3 Halbwerts-Konzentration des Fluorids [Mole/Liter] 3,9 x 10"4 2,0 x 10"4 0,6 x 10-4 Es war also um so weniger Fluorid zur Hemmung der Enolase notwendig, je höher die Konzentration des Magnesiums war. Waren 27 Millimole Magnesium- sulfat im Liter Lösung, so hemmten 0,06 Millimole Fluorid die Enolase zur Hälfte, 5 Warburg, Zellphysiologie 66 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste während offenbar in diesem Fall die Konzentration des Magnesiumsulfats durch das Fluorid nicht vermindert werden konnte. Ein zweites merkwürdiges Ergebnis war es, daß wir gar keine Hemmung durch Fluorid fanden, wenn wir den Phosphatpuffer durch Bikarbonatpuffer ersetzten. Wurde aber Phosphat zu dem Bikarbonat hinzugefügt, so trat die Fluoridhemmung wieder auf. Zum Beispiel fanden wir bei pH 7,34 in m/20 Bikarbonat : Mole/Liter Mole /Liter Mole/Liter CMg cFluorid • cPhosphat 2,7 X 10"3 0 1,0 10-3 1 keine Hemmung 2,7 x lO-3 1,7 ■ lO-3 0 I Y keine Hemmung 2,7 1,7 1,0 10 3 lO"3 lO"3 71% Hemmung Aus derartigen Versuchen ergab sich, daß die Fluoridhemmung der Enolase durch eine Substanz bewirkt wird, die Phosphat, Magnesium und Fluorid ent- hält und zwar wahrscheinlich im Verhältnis 1:2:2; und daß dieses komplexe Magnesiumsalz das Magnesium von der Enolase verdrängt, etwa: Magnesiumfluorophosphat Magnesiumenolase ^ Magnesiumfluorophospho-Enolase Ma- gnesiumsalz Indessen muß ich erwähnen, daß ich eine Erscheinung beobachtet habe, die zu dieser Theorie nicht zu stimmen scheint. Bringt man Enolase-Protein in eine Testlösung, die Phosphat, Magnesium und Fluorid enthält, so dauert es etwa 1 Minute, bis die Fluoridhemmung voll entwickelt ist; und bringt man das ge- hemmte Ferment in eine fluorid freie Lösung zurück, so dauert es etwa 1 Minute bis die Fluoridhemmung wieder völlig verschwunden ist. Eine gegenseitige Ver- drängung von Salzen sollte nicht so lange Zeite beanspruchen. XI. Kristallisation der Muskel-Zymohexase5 Muskel-Zymohexase wurde mit Hilfe des Tests 1 isoliert und aus ammoniakali- schem Ammonsulfat kristallisiert. Das Molekulargewicht fand Bücher mit der Streulichtmethode etwa 150000. Bezogen auf diesen Wert, beträgt die molare Wirksamkeit des Ferments in der Richtung der Gärung: Wmoiar bei 20°: 2 000 Mole Hexosediphosphat / Mole Ferment :■; Minuten Wmciar bei 38°: 11000 Mole Hexosediphosphat / Mole Ferment X Minuten Dies ist die kleinste molare Wirksamkeit eines Gärungsferments, die wir bisher gefunden haben. Vielleicht hängt dies damit zusammen, daß die Zymohexase Kohlenstoffverbindungen trennt, während die bisher isolierten Gärungsfermente Phosphat übertragen oder Wasserstoff übertragen oder Wasser abspalten. Aus Gründen, die sich aus dem Folgenden ergeben werden, haben wir die Frage der Beteiligung von Schwermetallen an der Wirkung der Muskel-Zymohexase untersucht. Wir fanden: Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 67 1. Muskel-Zymohexase kann gegen die Komplexbildner Blausäure, Cystein und Pyrophosphat ohne Wirkungsverlust dialysiert werden. 2. Muskel-Zymohexase wird durch Zusatz von Komplexbildnern zur Test- lösung nicht gehemmt. 3. Muskel-Zymohexase, zweimal umkristallisiert, enthielt in 100 mg 2 y Kupfer, 2 y Zink und 1 y Eisen. Addieren wir die drei Metalle und rechnen die Metalle und das Ferment in Mikromole um, so ergibt sich, daß 0,67 Mikromole Ferment etwa 0,08 Mikromole Schwermetall, also keine stöchiometrischen Mengen Schwermetall enthalten. Die drei Ergebnisse ergänzen sich und scheinen zu beweisen, daß an der Wirkung der Muskel-Zymohexase Schwermetalle nicht beteiligt sind. XII. Das Problem der Wirkungsgruppe Es ist bisher ein Ergebnis unsrer Untersuchungen über Fermente gewesen, daß die Wirkung der Fermente auf chemischen Zwischenreaktionen beruht; und daß die Ferment-Proteine keine Teilnehmer dieser chemischen Zwischenreaktionen sind. Wenn zum Beispiel die Phenoloxydase Brenzkatechin zu Orthochinon oxydiert, so wäre es möglich gewesen, daß das Ferment-Protein das Brenzkatechin oxydierte und daß das reduzierte Ferment-Protein durch molekularen Sauerstoff reoxydiert würde. In Wirklichkeit jedoch oxydiert Kupfer, an Protein gebunden, das Brenz- katechin; und in Wirklichkeit wird Kupfer, an Protein gebunden, durch moleku- laren Sauerstoff reoxydiert. Das entsprechende gilt für die rein organisch auf- gebauten sauerstoffübertragenden Fermente, die gelben Fermente, sowie für die sehr große Zahl der wasserstoffübertragendsn Fermente, die Pyridin-Proteide. Deshalb wird man, wenn man ein Ferment isoliert hat, nicht ruhen, bis man den Nichtproteinteil gefunden hat : das „Koferment", wenn der Teil dissociierend ge- bunden ist oder die „prosthetische Gruppe", wenn er fester gebunden ist. Erst dann kann man hoffen, die Zwischenreaktionen, auf denen die Fermentwirkung be- ruht, zu entdecken und damit die Fermentwirkung chemisch zu verstehen. Die Muskel-Zymohexase ist das erste Ferment gewesen, dessen Nichtprotein- teil wir gesucht, aber nicht gefunden haben. Würden wir aber diesen Fall als Aus- nahme hinnehmen, so würden wir sofort eine zweite noch bedenklichere Annahme hinzufügen müssen: daß der Mechanismus der Zymohexasewirkung im Muskel und in Hefe verschieden ist. Denn einen Nichtproteinteil der Hefe-Zymohexase haben wir gefunden. Hefe-Zymohexase ist kein Protein, sondern ein dissociieren- des Schwermetallproteid. XIII. Hefe-Zymohexase5 Hefe-Zymohexase wurde nach einer 1942 veröffentlichten Vorschrift vorgereinigt. Zur weiteren Reinigung adsorbierten wir das Ferment bei pH 6,5 an Aluminium- hydroxyd, eluierten das Aluminiumhydroxyd mit viel Wasser, wobei das Ferment adsorbiert blieb und eluierten dann das Ferment mit m 50 Pyrophosphat bei pH 68 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 7,1. Es folgte Verdünnung des Eluats auf m/100 Pyrophosphat, Ansäuren mit Essigsäure bis pH 4,9, wobei ein unwirksamer Niederschlag fiel, und Fällen des Ferments mit 1/3 Volumen Alkohol. Der Ferment-Niederschlag wurde dann in wenig Wasser suspendiert, mit Natronlauge neutralisiert und in gefrorenem Zu- stand zu einem haltbaren Pulver getrocknet. Die so gewonnene Hefe-Zymohexase hatte, in Test 1 geprüft, etwa die gleiche Wirksamkeit, wie die kristallisierte Muskel-Zymohexase. Doch kristallisierte diese Hefe-Zymohexase nicht* und so können wir über ihren Reinheitsgrad keine An- gaben machen. Mißt man die Wirkung so gereinigter Hefe-Zymohexase im optischen Test 1 unter Zusatz von Cystein, so findet man starke Hemmung. Da auch andere Kom- plexbildner wie Dipyridyl, Phenanthrolin und Pyrophosphat hemmen, so muß die Hefe-Zymohexase eine dissociierende Schwermetallverbindung sein. Dies kann man beweisen, indem man zu dem durch Cystein gehemmten Fer- ment Schwermetallsalze zusetzt, wenig im Vergleich zu dem Cystein, aber genug, um das Ferment-Protein mit Metall zu sättigen. Dann findet man, daß 3 Metalle die Wirkung des Ferments wiederherstellen können : Zink-, Ferro- und Kobalto- Salze. Auf die Reaktivierung des Ferments durch Zink hat Sauerstoff keinen Einfluß. Die Reaktivierung durch Eisen jedoch ist vom Sauerstoff druck abhängig; sie ist am größten bei Abschluß von Sauerstoff und sehr gering bei Sättigung der Test- lösungen mit Sauerstoff von Atmosphärendruck. Die Erklärung ist, daß nur das zweiwertige Eisen reaktivieren kann. In einer Cysteinlösung, die wenig Eisen ent- hält, ist das gesamte Eisen bei Abschluß von Sauerstoff zweiwertig und bei Sätti- gung mit Sauerstoff von Atmosphärendruck ist fast das gesamte Eisen dreiwertig. Wenn nun von den beiden Oxydationsstufen des Eisens nur das zweiwertige Eisen die Zymohexase aktiviert, und wenn Eisen in Cysteinlösungen bei Abschluß und Zufuhr von Sauerstoff seine Valenz wechselt, so kann man hier wie in leben- den Zellen, aber hier durch einen chemisch klaren Mechanismus, Spaltung von Zucker entstehen lassen oder zum Verschwinden bringen, indem man Sauerstoff abschließt oder zuführt. Ist damit der Schlüssel zu der Pasteurreaktion gefunden, jener Reaktion, durch die in lebenden Zellen die Sauerstoffatmung die Gärung hemmt ? Zwar könnte es im Leben nicht der molekulare Sauerstoff sein, der die aktive Ferro-Zymohexase zu der inaktiven Ferri-Zymohexase oxydierte; aber es würde zu allem, was über die Pasteurreaktion bekannt ist, stimmen, wenn das Eisen des sauerstoffübertragenden Ferments durch die Reaktion Ferri-Oxygenase + Ferro-Zymohexase ^ Ferro-Oxygenase + Ferri-Zymohexase die Zymohexase inaktivierte. Wie die Pasteurreaktion wäre diese Reaktion in weiten Grenzen vom Druck des Sauerstoffs unabhängig, weil die Konzentration der Ferri-Oxygenase in weiten * Zusatz 1961. Die Hefezymohexase ist inzwischen kristallisiert worden. Siehe Arbeit 21 dieses Buchs. Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 69 Grenzen vom Sauerstoffdruck unabhängig ist. Wie die Pasteurreaktion würde diese Reaktion durch Kohlenoxyd und durch Blausäure gehemmt, weil die Konzen- tration der Ferri-Oxygenase durch Kohlenoxyd und Blausäure vermindert wird. Wie die Pasteurreaktion könnte diese Reaktion, ohne gleichzeitige Atmungs- hemmung, durch Carbylamin gehemmt werden, wenn Carbylamin durch An- lagerung an das Ferro-Eisen der Zymohexase die Ferro-Zymohexase vor der Oxydation schützte. Trotzdem nun auf die angedeutete Weise vieles, was bisher chemisch unver- ständlich war, erklärt werden könnte, so muß doch zunächst abgewartet werden, wie das Problem der Muskel-Zymohexase gelöst werden wird. Denn ebenso wie in Hefe gibt es im Muskel eine Pasteurreaktion und keine Erklärung kann befriedi- gen, die die Pasteurreaktion nicht einheitlich, unabhängig von der Zellart erklärt. Wahrscheinlich wird man hier am schnellsten durch eine Untersuchung der Hefe-Zymohexase zum Ziel kommen, also die negative Frage beiseite lassen, warum die Muskel-Zymohexase durch Schwermetalle nicht aktiviert wird und statt dessen die positivere Frage untersuchen, warum die Hefe-Zymohexase durch Schwer- metalle aktiviert wird. Da Zink zu den aktivierenden Metallen gehört, kann die Wirkung der Schwermetalle hier nicht wie in den sauerstoffübertragenden Fer- menten auf einem Valenzwechsel beruhen. Offenbar liegt hier ein anderer Me- chanismus biologischer Schwermetallwirkungen vor.* XIV. Kristallisation der Proteine der beiden dephosphorylierenden Fermente73 Das Protein des ersten dephosphorylierenden Ferments ist unter meiner Leitung von Th. Bücher mit Hilfe des Tests 4 aus Hefe isoliert und aus Ammonsulfat unter Zusatz von Pyrophosphat kristallisiert worden. Die Methode der Isolierung bestand im wesentlichen aus einer Fraktionierung der Zellproteine als Nukleo- proteide mit Säure; neu war dabei, daß unter Zusatz von Alkohol fraktioniert wurde. Das Protein zeichnet sich vor andern Ferment-Proteinen der Gärung durch seine große Wirksamkeit aus. Im optischen Test genügt eine Protein-Konzentra- tion von 0,01 y pro cm3. Rechnen wir mit einem Molekulargewicht von 100000, so beträgt die molare Wirksamkeit in der Richtung der Gärung bei 25° : Wmoiar = 320 000 [Mole Substrat / Mole Ferment Minuten]. Das Protein des zweiten dephosphorylierenden Ferments ist mit Hilfe des Tests 7 aus Hefe isoliert und aus Ammonsulfat kristallisiert worden. An Einzelheiten des Isolierungsverfahrens, das Negelein ausgearbeitet hat, kann ich mich nicht mehr erinnern. Die Proteine der beiden dephosphorylierenden Fermente sind streng spezifisch * Zusatz 1961. Inzwischen ist diese Schwermetallwirkung zweiter Art, wie wir sie nennen wollen, sehr häufig in Fermenten gefunden worden, ohne daß eine Er- klärung für den Mechanismus der Metallwirkungen gefunden worden wäre. 70 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste für ihre Teste, können sich also in ihren Testen nicht vertreten. Es ist weiterhin eine Folge der strengen Spezifizität, daß die beiden Teste nach Zusatz ihrer spezi- fischen Proteine reaktionslos bleiben, wenn man statt der stöchiometrischen Men- gen katalytische Mengen Adenosindiphosphat zusetzt und außerdem viel Hexose oder Hexosemonophosphat. Es geht daraus hervor, daß die Dephosphorylierung und die Phosphorylierung der Substrate an verschiedenen Proteinen vor sich geht; daß also die phosphatübertragenden Fermente, ebenso wie die wasserstoffüber- tragenden Fermente, aus je 2 Proteinen mit gemeinsamer prosthetischer Gruppe bestehen. Dies ist schon in Kapitel III hervorgehoben, aber dort nicht experi- mentell begründet worden. Im ganzen gibt es in gärenden Zellen 4 an der Phosphatübertragung beteiligte spezifische Proteine, von denen jedes mit Adenosinpolyphosphat und Magnesium- salz zu Proteinen zusammentritt, die ich in Analogie zu den Alloxazin- oder Pyri- din-Proteiden als „Adenosin-Proteide" bezeichnen möchte. Die 4 Adenosin-Proteide, die also thermodynamisch betrachtet nicht Fermente, sondern Halb-Fermente sind, kann man paarweise zu 4 phosphatübertragenden Fermenten folgender Funktionen zusammensetzen : 1. Ferment, das Phosphat von der 1 -Stellung der 1,3-Diphosphoglycerinsäure auf Hexose überträgt. 2. Ferment, das Phosphat von der 1 -Stellung der 1,3-Diphosphoglycerinsäure auf Hexosemonophosphat überträgt. 3. Ferment, das Phosphat von der Phosphobrenztraubensäure auf Hexose über- trägt. 4. Ferment, das Phosphat von der Phosphobrenztraubensäure auf Hexosemono- phosphat überträgt. XV. Kristallisation des Proteins des reduzierenden Gärungsferments aus Tumoren9 Wenn das Protoplasma der Zellen der Inbegriff ihrer Fermente ist, dann sollte man annehmen, daß die Fermente gleicher Funktion verschiedener Organe eines Tieres verschieden sind. Da die prosthetischen Gruppen gleich sind, so wird man die Verschiedenheiten in den Proteinkomponenten suchen müssen. Man wird also beispielsweise erwarten, daß die Proteine der reduzierenden Gärungsfermente von Muskeln und Leberzellen derselben Tierart verschieden sind. Wir haben die Untersuchung dieses wichtigen Problems in unsystematischer Weise mit einem Vergleich von Muskel- und Tumorfermenten begonnen. Das Versuchstier war die Ratte, der Tumorstamm war das Jensensarkom, die Fer- mente waren die reduzierenden Gärungsfermente, deren Proteine unter meiner Leitung von Kubowitz und Ott aus Muskeln und aus Tumoren isoliert und als Quecksilbersalze kristallisiert wurden. Wir haben keine Unterschiede der Kristallform, der elementaren Zusammen- setzung, des Ultraviolettspektrums und der Drehung der Polarisationsebene ge- Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste 71 funden, die wir als außerhalb der Fehlergrenzen betrachten könnten. Bei der Größe des Proteinmoleküls mag dies nicht viel bedeuten. Wir haben identische Zerstörungskurven beim Erhitzen in neutraler wäßriger Lösung, beim Bestrahlen mit 303 und 334 mit und beim Abbau durch Dünn- darmsekret erhalten. Wir haben die gleichen Konstanten der Dissociation der Fermente in Protein und prosthetische Gruppe gefunden, nämlich K = 5 • 10"6 Mole/Liter bei neu- traler Reaktion und 20°. Für die bemerkenswerteste Übereinstimmung der beiden Fermente aber halte ich, daß ihre chemischen Wirksamkeiten numerisch gleich gefunden wurden. Die molaren Wirksamkeiten in Richtung der Gärung, berechnet mit einem Molekular- gewicht* von 100000, betrugen bei Variation der äußeren Bedingungen: Muskelferment W molar Tumorferment Wmolar 20° pH 8,15 39° pH 8,16 20° pH 7,36 39° pH 7,38 30 000 46 000 23 000 73 000 31 000 45 000 23 000 73 000 XVI. Gärungsfermente im Blut von Tumortieren13** Wenn bei der Entwicklung der Tumoren im Körper ein humoraler Faktor be- teiligt ist, so sollte sich das Serum von Tumortieren von dem Serum normaler Tiere unterscheiden. Wegen der Gärung der Tumoren haben wir an Gärungsfer- mente gedacht und haben mit den optischen Testen im Serum von Tumortieren Gärungsfermente gesucht. Zum Vergleich dienten normale Tiere und gravide Tiere. Gibt man 0,1 bis 0,2 cm3 Serum oder Plasma zu den 3 cm3 Testlösung, die wir für unsern Quarztrog brauchen, so kann man die meisten der 11 Fermente der Milchsäuregärung in Normalserum, in Gravidenserum und in Tumorserum von Ratten nachweisen. Zwei dieser Fermente waren in Serum von Tumorratten ver- mehrt: die Zymohexase und die Isomerase. Die Tumoren waren Jensensarkome oder Walker-Carcinome, die unter die Haut oder in das Abdomen geimpft worden waren. Waren die Tumoren groß, so betrug der Gehalt an Zymohexase und Isomerase das 10- bis 20fache des Normal- werts. An eine klinische Anwendung als „Krebsreaktion" ist wegen der erforderlichen Größe der Tumoren nicht zu denken. Theoretisch aber ist die Erscheinung interes- sant. Stammt die Zymohexase im Serum der Tumortiere, was am nächstliegenden wäre, aus zerfallenen Tumorzellen? Oder bewirken die Tumoren, daß normale * Bücher fand mit der Streulichtmethode für beide Proteine 90000. ** Zusatz 1961. Ausgehend von dieser Arbeit hat sich in den letzten Jahren eine klinische Enzymologie des Blutserums entwickelt. 72 Über die Kristallisation von Gärungsfermenten und ihre optischen Teste Körperzellen Gärungsfermente an den Kreislauf angeben ? Und können Tumor- zellen solche Gärungsfermente in ihr Protoplasma einbauen ? Dann würde man das Wachstum der Tumoren im Körper und ihren parasitischen Charakter besser ver- stehen; und man würde auch verstehen, warum die Gewebekultur keine Auskunft über das Verhalten der Tumorzellen im Körper gibt.* Literatur 1 Engelhardt, W. A., The Yale J. of BiolTa. Med. 15 (1942), Nr. 1. 2 Biochem. Z. 286 (1936), 81. 3 Bioch. Z. 310 (1941), 384. 4 Biochem. Z. 303 (1939), 231. 5 Biochem. Z. 314 (1943), 149. 6 Biochem. Z. 314 (1943), 149. 7 Biochem. Z. 303 (1939), 40. 7a Biochimica et Biophysica 1 (19471, 292. 8 Biochem. Z. 310 (1941), 384. 9 Biochem. Z. 314 (1943), 94. 10 Biochem. Z. 159 (1925), 58. 11 Biochem. Z. 303 (1939), 132. 12 Harden, A., und Young, W. J., Proc. Chem. Soc. (1905), 189; Proc. Roy. Soc. B. 80 (1908), 299. 13 Biochem. Z. 314 (1943), 399. 21 * Zusatz 1961. Antwort in Arbeit 22 dieses Buchs. 3 Über den Quantenbedarf der Kohlensäureassimilation.* Von Otto Warburg Nach Robert Emerson, James Franck und Hans Gaffron1 wird die photo- chemische Reduktion der Kohlensäure in grünen Pflanzenzellen durch einen photochemischen „Ausstoß" von Kohlensäure eingeleitet. Belichtet man also vor- her verdunkelte grüne Zellen in Gegenwart von Kohlensäure, so soll in den ersten Belichtungsminuten keine Kohlensäure von den Zellen absorbiert, sondern um- gekehrt Kohlensäure aus den Zellen entwickelt werden. Da mich die Versuche nicht überzeugten und mir das Ergebnis unwahrscheinlich erschien, habe ich eine Methode ausgearbeitet, um den assimilatorischen Quotienten Kohlensäure absorbiert V = Sauerstoff entwickelt für Zeitintervalle von einigen Minuten zu bestimmen. Das Prinzip der manometrischen Methode ist in der Fig. 1 angedeutet. Chlorella, suspendiert in Knopscher Lösung und gesättigt mit 10 Vol. % CO2 in 0>, wurde hintereinander in demselben Gefäß in wenig und in viel Flüssigkeit belichtet, wo- bei die Intensität des Lichts konstant und die Absorption des Lichts vollständig Fig. 1. Manometergefäß von etwa 15 ccm Gesamtvolumen. Die Flüssigkeitsmenge beträgt 5 ccm oder 8 ccm, während die Zellmenge konstant bleibt. Belichtet wird mit rotem Licht des Bezirks 635 bis 675 m//. war. Waren die Flüssigkeitsvolumina verschieden, so waren auch die Druck- änderungen verschieden und aus dieser Verschiedenheit konnte der assimila- torische Quotient y — für Zeitintervalle von 3 bis 5 Minuten — berechnet werden. * Aus: Die Naturwissenschaften 33 (1946): 122. Zusatz 1961. Bei einem Besuch in Emersons Laboratorium in Urbana 'Illinois im Jahr 1948 war Emerson nicht imstande, trotz eines Aufenthaltes von mehreren Monaten, mir den Ausstoß der Kohlensäure durch ein Experiment zu zeigen. Der Ausstoß der Kohlensäure bei den früheren Experimenten Emersons war vorge- täuscht worden durch zu langsames Schütteln der beiden Gefäße bei der 2-Gefäß- Methode. Das erste Erfordernis dieser Methode, Konstanz der manometrischen Ausschläge bei Vermehrung der Schüttelgeschwindigkeit, war von Emerson nicht beachtet worden. 74 Über den Quantenbedarf der Kohlensäureassimilation Ich fand y = 0,95, sowohl in den ersten Belichtungsminuten nach längerer Ver- dunkelung, als auch bei fortgesetzter Belichtung. Es wurde also zu keiner Zeit Kohlensäure aus den Zellen photochemisch entwickelt; sondern es wurde, dem Sinn der Kohlensäureassimilation entsprechend, immer Kohlensäure absorbiert und etwa das gleiche Volumen Sauerstoff entwickelt. Wäre es wahr gewesen, daß die photochemische Reduktion der Kohlensäure mit einem Ausstoß von Kohlensäure anfängt, so wären die meisten neuzeitlichen Assimilationsmessungen falsch gewesen und es wäre vor allem der Energieumsatz bei der Kohlensäureassimilation falsch berechnet worden. So aber bleibt es dabei, daß von dem Chlorophyll der grünen Pflanzen 4 Lichtquanten (gleichgültig wel- cher Wellenlänge) absorbiert werden müssen, damit 1 Molekül Kohlensäure unter Entwicklung von Sauerstoff reduziert wird : CO-2 + H20 + 4 h • v = CH20 + 02. In der ausführlichen Arbeit wird außer der Methode der y-Bestimmung auch eine neue und wesentlich vereinfachte Methode zur Bestimmung des Energie- umsatzes beschrieben werden. Literatur 1 Emerson, R., und Lewis, Ch. M., Amer. Journ. of 2 Warburg, O., und Negelein, E., Z. f. physikalische Botany 26 (1939), 808. James Franck und Hans Gaf- Chem. 106 (1923), 191. fron, Advances in Enzymology 1 (1941), 199. 4 A Manometric Actinometer for the Visible Spectrum7' Otto Warburg and Victor Schocken The actinometer to be described in this paper is based upon the work of H. v. Tappeiner1, who discovered the sensitization of photooxidation processes by dyes; upon that of S. E. Sheppard"2, who discovered the role of sulfur Compounds, especially of allyl thiourea, in the photochemical process of photography ; and upon the manometric and bolometric method developed at Dahlem for the measurement of the quantum yield of photosynthesis3a* b. In 1926, Warburg and Gaffron4 determined the quantum yield of photooxidation of allyl thiourea when sensitized by Chlorophyll or porphyrin by these methods. The result was that 1 molecule of oxygen reacts, if 1 light-quantum is absorbed by the sensitizers, that means that the quantum yield was <p = - — = l. h- v Due to many circumstances, the technical procedure of 1926 was too complicated to be used for practical actinometric purposes. We have simplified the procedure in such a way that quantum intensities can now be measured in the greater part of the visible spectrum by the chemical process of photooxidation wherever simple manometrie equipment is available. We replaced the differential manometer by the simple Haldane-Barcroft manometer; Acetone, which because of its high vapor pressure, is unsuitable for manometric experiments, was replaced by pyridine, which, thus far, is the most appropriate solvent we have found. Allyl thiourea was replaced by unsubstituted thiourea, a simplification by which we eliminated a slow dark reaction. We have tried many substances as reductants in our system but none equaled thiourea. Even substances such as hydroquinone, which are easily oxidized by many oxidants, could not be photooxidized at all. Thus, Sheppard's discovery of the specific reactivity of certain sulfur Compounds proved as important in photo- oxidation as in photography. We have tried many dyestuffs but none equaled Chlorophyll or prophyrin as sensitizers. We used crystalline ethyl chlorophyllid and crystalline Protoporphyrin. As light absorbers they are complementary, the Chlorophyll transmitting the green and the Protoporphyrin transmitting the red. If mixed together they absorb the greater part of the visible spectrum. Photooxidation of Thiourea One mg. of thiourea (13.2 micromoles) was dissolved in 5 cc. of pyridine. One-tenth mg. of Proto- porphyrin was added. The mixture was introduced into a rectangular vessel of 14 cc. volume which was connected to a manometer. The gas Space contained air. When shaken in the thermostat at 20° C. and illuminated with a 200 w. incandescent lamp at 20 cm., 135 mm.3 Oo were absorbed * Aus Archives of Biochemistry 21 (1949): 363. 76 A Manometric Actinometer for the Visible Spectrum during the first 10 min. When, after 230 min., the oxygen uptake had become very slow, 735 mm.3 02 had been absorbed, that is, 2.5 moles 02/mole of thiourea. Only 2 moles of oxygen are calculated when the thiourea is oxidized according to the equation : NHo / CS + 2 Oo = CNNH2 + H2SO4 . \ NH-2 (Cyanamide) The pyridine Solution was evaporated in vacuo, the residue taken up in water, and the insoluble porphyrin removed by filtration. In the filtrate, about 74% of the calculated amount of H2SO4 was precipitated by BaCl2. To another portion of the Solution AgNOs and ammonia, or copper acetate and ammonia, were added to test for cyanamide. Silver produced a dark yellow precipitate and cop- per a black precipitate. Another portion of the Solution was tested for urea by urease, which was added from the sidearm of a manometer vessel to the acidified Solution (pH 5.5). Seventeen per cent of the thiourea was recovered as urea. This urea may have been formed by hydrolysis of cyanamide: NH2 / CNNH2 + H20 = CO \ NH2 Finally, it may be mentioned that the proporphyrin is slowly photooxidized in the Solution Spectroscopic examination showed the appearence of a band in the red at about 675 m//. Very probably this is the first step in the transformation of blood pigment to bile pigment discovered in 19305. Actinometer Two hundred mg. of thiourea, dissolved in 5 cc. pyridine ("medicinal" grade, Mallinckrodt), are introduced into a rectangular vessel of about 14 cc. volume. Two mg. of crystalline ethyl chlorophyllid are added, if red, yellow, or blue light is to be measured. Ten mg. of crystalline Protoporphyrin are added if green or blue light is to be measured. The vessel is then connected to a simple manometer of the type used for respi- ration measurements. Pure oxygen is introduced into the gas-space. The vessel is shaken in the thermostat at 20°C. in the dark, until the pressure remains constant for at least 15 min. If the vessel then is illuminated by light which is absorbed by the Chlorophyll or the porphyrin, thiourea is oxidized and the oxygen pressure in the vessel decreases. It is an essential feature of this arrangement that the concentration of the Chloro- phyll or the porphyrin is so high that light entering in a vertical direction through the bottom of the vessel is completely absorbed, even when the vessel is in motion. To test this condition it must be shown that the oxygen consumption remains constant if the concentration of the dyes is increased. Quantum Yield The light beam leaving the slit of a monochromator was collimated by lenses and reflected by a mirror vertically into the vessel. The cross-section of the beam A Alanometric Actinometer for the Visible Spectrum 77 entering the vessel was about 2 cm.2, whereas the bottom area of the vessel was about 9 cm2. The light beam was adjusted to the middle of the vessel. Thus, when the vessel was shaken, no part of the beam passed outside the vessel. The total intensity of the light beam was measured bolometrically as described elsewhere5. The bolometer had been calibrated against a Standard lamp of the U. S. Bureau of Standards. The quartz window, which protected the Strips of the bolometer, was 2 mm. thick and transmitted 82.5% of the radiation of the Stand- ard lamp. The actinometer was shaken in the ordinary shaking-machine3 -1 with horizontal (not circular) motion. Foaming never occurred. When equilibrium was reached in the thermostat in the dark at 20° C, the pressure was noted. The manometer was then taken out of the thermostat and the shak- ing continued in air at about 20° C. Here the actinometer was illuminated with light of measured intensity. After periods of 10 — 30 min., the illumination was interrupted, the manometer was again placed in the thermostat and, after shaking 5 min. in the dark, the pressure was read. The purpose of this procedure was to avoid uncertain corrections for the light transmission of the Windows of the thermostat and of the water in the thermostat. The same mirror which reflected the light beam in a vertical direction into the actinometer, by rotation could reflect the same light beam into the bolometer. If / was the total intensity of the beam which reached the Strips of the bolometer, 1.04 • /was the total intensity which entered the actinometer. Thus, the corrections for the different paths of the light were reduced to a minimum. We have tried to determine whether shaking is necessary during illumination, and always found distinctly smaller quantum yields when resting vessels were illuminated. The layer of the Solution in which the main part of the light is ab- sorbed is very thin and it seems that here, in the resting vessels, concentrations decrease to such a degree that light energy is lost. Here follows an example of determination of the quantum yield: 20°C; 100% 02; 585— 615 m// (600 m//). V = 14.10 cm.3 vF = 5 cc. vG = 9.10 cc. K0.2 = 0.893. 200 mg. thiourea. 2 mg. ethyl-chlorophyllid, dissolved in pyridine. The solubility of O2 at 20° C. in the actinometer Solution was determined manometrically. a = 0.092 was found and used for 273 vg \- vf ■ a T the calculation of the vessel-constant Kq2 = - - (mm.2). The total light intensity entering the vessel was / = 0.109 micromoles of quanta/min. The manometer readings were: 20 min. dark 0 15 min. light 5 min. dark — 39 mm. 34 8 = — 34.8 mm.3 = — = 1.55 micromoles Oo. 22.4 1-55 1.55 nnMB w = = = 0.945. 15 x 0.109 1.64 In the following table are presented the results of a continuous series of experi- ments, the time of illumination being 30 min. in the blue or 15 min. in the other spectral regions. In each of the four spectral regions mentioned in the table, the light was tested for unabsorbed light, especially for infrared. Between the exit slit of the monochromator and the bolometer we placed an absorption cell of 1 cm. thickness. When the cell contained acetone or pyridine, it transmitted 91% of the 78 A Manometric Actinometer for the Visible Spectrum light, the loss being effected only by reflection. When 0.2 mg. of ethyl-chloro- phyllid per cc. of acetone were added, the transmission in the blue, the yellow or the red was nearly zero; when 1 mg. of Protoporphyrin per cc. of the pyridine was added, the transmission in the green was nearly zero. It follows, from the data recorded in the table, that the accuracy of the method is sufficient for most photochemical experiments, inorganic or biological. The light intensities mentioned in the table should not be exceeded. One micromole of quanta entering the vessel in a period of 15 min., is about the right intensity. The pressure changes then are about 20 mm. and can be read with an accuracy of 5%. Wavelength Light absorbed (micromoles quanta) Oxygen consumed (micromoles 02) micromoles 02 (m/0 micromoles quanta 640—660 (red) 1.98 1.82 0.92 640—660 (red) 0.99 1.02 1.03 505—525 (green) 1.14 1.10 0.96 420—450 (blue) 0.36 0.42 1.16 585—615 (yellow) 1.90 1.79 0.94 585—615 (yellow) 0.95 0.96 1.01 420—450 (blue) 0.44 0.46 1.04 640—660 (red) 1.65 1.47 0.89 640—660 (red) 0.825 0.78 0.94 640—660 (red) 0.83 0.83 1.00 585—615 (yellow) 1.64 1.55 0.95 505—525 (green) 0.88 0.84 0.95 Average = 0.98 We started our experiments with dioxane as solvent. If it was pure and free of peroxide, the quantum yield seemed to be one. Otherwise, the yield was greater and could be decreased by Cyanide or increased by copper salts. When peroxide- free dioxane, was kept overnight in a bottle which was not airtight it gave a strong peroxide reaction with KJ. Therefore, dioxane was discarded as a solvent. Thus far we have not found a more satisfactory solvent than pyridine, which has a sufficiently low vapor pressure and dissolves thiourea, ethyl chlorphyllid and Protoporphyrin sufficiently. Applications The actinometer seems particularly suitable for determinations of the quantum yield in photosynthesis. We first place the actinometer in the path of a light beam whose intensity is unknown and measure the oxygen uptake. In the same position we then place a vessel of the same dimensions filled with living green cells which also absorb the light completely. If we compare equal periods of irradiation, we obtain the quantum yield of photosynthesis by the simple equation: O2 developed O2 O2 absorbed hv. The general usefulness of the actinometer becomes apparent if we bear in mind that the instrument integrates the light intensities over time and number of quanta. A Manometric Actinometer for the Visible Spectrum 79 If, for example, the vessel is shaken in light whose intensity and spectral distribu- tion change with time, then one single manometric reading taken at the end of a given period gives the number of quanta which have entered the vessel during the whole period. There is one limitation of the instrument : i.e., that the light entering the vessel must be completely absorbed. Under the conditions given above, the instrument can be used from 670 mit in the red to the blue end of the visible spectrum. How far it can be used in the ultraviolet must still be investigated. Quartz vessels must be used instead of glass vessels. Direct Photooxidation of Thiourea Two hundred mg of thiourea, dissolved in 5 cc. pyridine, were introduced into the rectangular glass vessel and illuminated — without addition of Chlorophyll or por- phyrin— by a 100 w. mercury vapor lamp in a "black glass" envelope, at about 15 cm. distance. In 45 min., 24 mm.3 0> were taken up. Summary A chemical actinometer has been described, by which quantum intensities in the greater part of the visible spectrum can be measured manometrically. References 1 Tappeiner, H. v., Ergeb. Physiol. 8 (1909), 698. 4 Gaffron, H., Chem. Ber. 60 (1.927), 755. 2 Sheppard, S. E., Phot. J. 65 (1925), 380. 5 Warburg, O., and Negelein, E., Chem. Ber. 63(1930), 3a Warburg, O., Biochem. Z. 100 (1919), 230. 1816. lemberg, R., Biochem. J. 29 (1935), 1322; 3b Warburg, O., and Negelein, E., Z. physik. Chem. Stier, E., Z. phvsiol. Chem. 275 (1942), 155. 102 (1922), 236; 106 (1923), 191. 5 The Quantum Efficiency of Photosynthesis* By Otto Warburg, Dean Burk, Victor Schocken and Sterling B. Hendricks Photosynthesis is a unique endothermic photochemical reaction in which chemical energy is gained from visible light energy by the combined action of several quanta. Nothing similar is known in the nonliving world. It was first reported a quarter of a Century ago1 that in photosynthesis the greater part of the absorbed visible light energy could be converted into chemical energy under optimum condi- tions. Indeed, no more than four quanta of red light seemed to be necessary to produce one molecule of oxygen gas, which is close to the thermodynamic require- ment of three quanta. It is easy to understand that this result, lacking any analogy, has sometimes been doubted by theoreticians, and it is a fact that certain investi- gators have raised methodological objections2. For this reason we have reinvesti- gated the question of the minimum quantum requirement of photosynthesis as measured by oxygen and carbon dioxide gas exchange. The present paper is a short summary of our findings by new and simplified methods. I. Cultivation of Cells A strain of Chlorella pyrenoidosa, isolated in New England and identified by Dr. Florence Meier of the Smithsonian Institution, and for many years in laboratory use, was cultivated in tall Drechsel gas washing bottles containing 200 ml of the following salt Solution: 5 g MgS04 ■ 7 H20, 2.5 g KNOs, 2.5 g KH2P04, 2 g NaCI, and 5 mg FeS04 • 7 H20, in 1 liter of filtered, unsterilized well water (pH 4.5—5). The cultures were maintained at a room temperature of 25 — 30° C, and were aerated with 5% C02 in air at a rate (-500 ml per minute) rapid enough to prevent cell settling, and were constantly illuminated with a 100-watt incandescent lamp at a distance of about 30 cm. Cells cultivated by this method gave more uniform material and more regulär manometric results than when cultivated by the older method Ci> p- 427) in which slowly aerated cells settled down in Erlenmeyer-shaped flasks and became partially anaerobic until reshaken up, and in which lowered light intensities were employed for the terminal cultivation phase. The cultures were used for the experiments in the present work after 2—10 days growth, when they contained 200—1000 u\ cells, depending upon the amount of initial inoculation. Usually 50—100 /d cells per 200 ml medium were employed as inoculum, grown as just indicated. Bacterial growth during either cell culturing or manometric experiments was found with a haemocytometer to be negligible, due to the low pH, the lack of added organic matter in the synthetic medium, and possible antibiotics produced by the Chlorella. The cells for experimental use were centrifuged in an International No. 2 Centri- * Aus Biochimica et Biophysica Acta 4 (1950): 335. The Quantum Efficiency of Photosynthesis 81 fuge at the lowest possible speed giving nearly complete settling in 10 minutes and were taken up, with or without further washing, in fresh nutrient medium at a concentration of 30 — 50 //l cells per ml. II. Monochromator A Steinheil glass 3-prism spectrograph operated with a focal lenght of 195 mm at F 3.5 for the collimator and a focal length of 710 mm for the telescope was used as a monochromator. The slit was illuminated with a 750-watt projection lamp. The image of the coiled filament at about 20° to its plane was projected onto the slit with an auxiliary lens. A 1000-watt voltage regulator was used to supply power to the lamp which operated at constant current. The width of the entrance slit was about 2 mm, corresponding to about 20 mi< in the red. A slit was placed in the focal plane of the telescope and was adjusted to have a width of about 30 m// covering the region 630 to 660 m/i. A lens was placed behind this slit to throw, in a weakly convergent beam, an image of the exit prism face on the bottom of the manometer vessel. The area of the beam at the vessel was about 3 cm2 and the energy flux was about 0.6 microeinsteins/min. This intensity was decreased when desired by placing in the light beam, just before the exit slit, blackened wire screens cali- brated by the National Bureau of Standards. III. Measurement of Light Energy The energy of the light beam was measured by the recently developed chemical actinometer3 whereby for each quantum of visible light absorbed one molecule of O2 is consumed. In the same or similar rectangular vessel as used for the yield determinations were placed 2 mg ethyl chlorophyllide, 200 mg thiourea, 7 ml Pyridine, and Oz gas. The actinometer vessel was shaken in the thermostat at 20° C in the same manner and in the same cross-section of the light beam as the vessels with the cell suspensions were shaken during the yield determination. The total intensity of light, absorbed by the actinometer, should not exceed 0.3 micro- einsteins per minute under our working conditions. Higher intensities, as used for the yield determinations, were diminished for this purpose by the calibrated screens. Several 10 minute periods were observed for every actinometer determination. When in t minutes the pressure change in the actinometer vessel is ho2 tnm, the total energy flux in the light beam in t minutes is °02 °2 or -~~- microeinsteins (micromole quanta), where the vessel constant ko2 is expressed in mm2. Then, when the oxygen developed by illuminating the green algae is n u\ and the oxygen absorbed in the actinometer for the same time and beam of light is n' ///, the quan- tum requirement per mol of 0> developed in photosynthesis is simply I/9? = n'jn. 6 Warburg, Zellphysiologie 82 The Quantum Efficiency of Photosynthesis IV. Comments on the 2-Vessel Manometric Method If the yield q> and the assimilatory quotient, y = ^ ' , are to be determined simultaneously, two vessels must be employed. If H be the pressure change in vessel I and H' that in vessel II, the xo2 and jcco-2 values can be calculated by well known equations (see 1 and section 8). The 2-vessel method, simple when the gas-exchanges in the dark are deter- mined, requires special attention when applied to illuminated cells. As will be shown later, the illumination of the cells is an illumination with intermittent light. This intermittency should be equal in the two vessels, and this is attainable if the liquid volumes are equal in both vessels. Furthermore, the respiration in most cell suspensions gradually changes with time, so that the pressure changes in light will also change with time, Thus the two vessels should be darkened and illuminated simultaneously so that the conditions of the aforementioned equations are fulfilled, namely 3 Xo2 = x o2 xco2 = x'co2 where the primed magnitudes refer to one vessel and the non-primed to the other. These conditions may be satisfactorily met by the method of alternately shifting the mirror under the two vessels at periods of, e.g., 10 minutes, as indicated in Fig. 1, and discussed in the next section. After two or more cycles, the pressure readings for each vessel for light and dark periods may be averaged and the light action calculated from the differences between the pressure changes in light and dark. A possible error involving noncomparability of time periods is thus eliminated. This error has been one of the main sources of difficulty in C///on?//a-photosynthesis experiments with the 2-vessel method. V. Procedure Simple Haldane-Barcroft constant-volume manometers with small capillaries (0.8 mm diameter) with rectangular vessels attached were shaken horizontally (not by are motion) at 140 — 180 (usually 150) cycles per minute at an amplitude of 2.0 cm in a water bath at 20°C. The two rectangular vessels of about 2.2 ;■; 3.8 cm inside width and length and 13 — 14 and 18 — 19 ml volume respectively, were filled with 200 — 400 u\ cells in 7 ml, thus the liquid volumes were identical and the gas spaces differed. The vessels (with capillary sidearm vents) were gassed on the bath, simultaneously with aid of a manifold, and with shaking. The horizontal (not are) shaking was so effective that physical after-effects of gas equilibration in the transition periods of dark to light and vice versa were not appreciable even when the illumination produced photosynthesis far above the compensation point and pressure changes of 5 — 10 mm per minute were involved. The manometers were usually read without stopping. The end of the manometer male Joint was not flat rough but coneave and polished, so that bubble formation in the cappillary did not oeeur; nor did foaming. As indicated in Fig. 1 a beam of red light (630 — 660 m/i) of about 3 — 4 cm2 area, The Quantum Efficiency of Photosynthesis 83 produced by means of the Steinheil monochromator, entered the side of the ther- mostat through a two walled window and was reflected by a mirror onto the bot- tom of a vessel, alternately in the one or the other by either shifting the mirror or the manometers, depending on the design of the experiment. The red light entering the vessel was completely absorbed. To accomplish this, the amount of cells must be sufficiently great. The amount depends upon the Chlorophyll content of the cells. It was found safe, to avoid loss of light, to have 300 /i\ of cells in each vessel. 100 Watt incandescent (White hght) Winao»/ ot thermoitct Rea light ot measurea intensity To manometer vented Stoppers- Q= Mirror No influence of the cell concentration on the yield was observed when light ab- sorption was complete and shaking adequate. By this method, both Oi and CO2 exchanges were obtained simultaneously and independently for any and every desired period of measurement, and every yield determination was connected with an experimental determination of the relationship CO2/O2, so that earlier uncer- tainties concerning this ratio (}') were eliminated. VI. Intermittency of Illumination The cross-section of the light beam entering the vessels was about 3 cm2, that is, 3/8 of the bottom area of the vessel. It can be calculated, if we disregard the scat- tering of light, that the major part of the red light (75%) is absorbed within a distance of about 1 mm from the bottom of the vessel. This means that the light absorbing volume is only about 1 20 of the 7 ml of the cell-suspension. Let now the intensity of the red light be so strong, that the oxygen consumption of the whole cell Suspension is compensated by the oxygen evolution (compensa- tion point for O2). Then the oxygen development in the absorbing volume of the cell Suspension may approach 20 times the point where the cells become saturated with light and the increment yield zero (with our cell conditions the Saturation intensity is about 30 — 40 times the compensation intensity). But we obtain maxi- mum or high yields when the vessels are shaken as described at not only compen- sating but even considerably higher intensities, when the latter are provided by white light. This proves that under our shaking conditions the cells alternate so 84 The Quantum Efficiency of Photosynthesis frequently between darkness and illumination that the concentrations of the parti- cipants of all dark reactions virtually retain their dark values — a consideration which shows the methodological importance of the kind and rate of shaking. VII. Yield Determinations above the Compensation Point A limiting feature of most earlier yield determinations was the low total light intensity, so low that only a fraction of the respiration was compensated for by the light action. Thus the yield determinations were in a sense determinations of inhi- bited or diminished respiration. We have changed this Situation by illuminating the vessels from above the thermostat by a 100-watt constant-voltage incandescent lamp (as diagrammed in Fig. 1), at such a distance that the pressure changes in the vessels become zero or positive ; yield determinations were then made with measured amounts of red light added in the usual manner from below the vessel. The intensity of the white light at the vessel surface was considerably smaller per unit area than that of the red light but covered a many fold greater area and hence provided much more total effective light than did the red beam. Owing to this relationship of inten- sives it was possible to eliminate repiration as an experimental quantity, and to Start the yield experiments at positive rather than negative pressures, and yet still obtain (as experience showed) virtually as good yields from the red light, whether the base line were darkness or the white light. Another limiting feature of the earlier yield experiments was the short duration of not only the periods of illumination (lOminutes) but also the total length of the experiment (commonly less than one hour). By the use of white light we have now succeeded in extending the duration of the manometric yield experiments up to at least 10 hours, if not indefinitely. The effects of this important advance are several. In general, the yields may now be determined under nearly the same conditions as obtain during the growth and cultivation of the cells, since the light intensity, temperature, medium, and gas phase during the growth and manometry are essen- tially the same, and furthermore we have found that the shaking does not change the cells under these conditions. VIII. Examples of Data Protocols 1, 2, and 3 provide examples of the data obtained. PROTOCOL No. 1 Experiment of V-26-49. 20r,C. 630—660 mu. 5% C02 in air. 260 //l of cells per vessel. Each vessel alternating 10' in dark and 10' red light; thus when vessel No. 5 was dark, vessel No. 3 was illuminatid, and vice versa. Vessel No. 5 Vessel No. 3 V = 13.913 ml V = 17.993 ml vf = 7.000 ml Vf = 7.000 ml k'o2 = 0.665 k'co2 = = i.235 ko2 = 1.046 kco2 = 1-634 80' dark— 91.5 mm 80' dark —26.5 mm 80' light + 1.5 mm 80' light -1 15.0 mm 80' H' + 93.0 mm 80' H + 41.5 mm The Quantum Efficiency of Photosynthesis H • kC02 -- H' ■ k'o2 85 (Equation 1) Action of light in 80' xo2 = kco2 ko2 k' CQ2 k' o2 {Equation 2) H • k<>, — H' • kco2 xco2 = ko2 k' + 151 /d 168 »1 o2 kc Actinometer : 8.83 //l O, per minute 1 80 • 8.83 Quantum efficiency for 02, 1 Quantum efficiency for CO,, 151 80 • 8.83 Assimilatory quotient, } CO, <p 168 CO, -168 •o2 = 4/7_ = 4.2 k' co2 — 1.11 If V O, O, + 151 1-11 is determined for a given cell Suspension, then .\o, and .\'co, can be obtained by the pressure changes in light and dark in each Single vessel. For example, in vessel No. 5, the following figures, taken immediately prior to the readings above, were obtained upon illumination with light of an actinometer value of — 5.07 /d O, per minute: Vessel No. 5 10' dark— 12.5mm 10' light-- 2.5 mm J. 10' ] 10' dark — 13.0 mm 10' light- 1.5 mm 10' dark — 10.0 mm 10.2 mm 10' : + 10.0 mm 20' H' = 20.2 mm (Equation 3) Action of light in 20'; xo, == H'— ' 2, - .20.2-1.62= -32.8 v ^ ^ COo + 7 k o2 Quantum efficiency for O2, Quantum efficiency for CO,, co2 -t- y xco2= -1.11 -xo,= - 32.8- -1.11 = -36.4 20 ■ 5.07 1_ 9 32.8 20 • 5.07 36.4 3.1 2.8 PROTOCOL No. 2 Experiment of V-30-49. 20°C. 630—660 m/i. 5% CO, in air. 270 ,/d of cells per vessel. Experiment I. Alternately dark and light each 10'. Actinometer for the red light (total) 5.4 //l O2 per minute. When vessel No. 5 was dark, No. 3 was illuminated and vice versa. No. 5 Constants as in Protocol 1 10' dark — 10.5 mm 10' light + 0.5 mm 10' dark 10.0 mm 10' 1 10' dark 9.0 mm 10' 1 10' dark 10' dark 10' dark 8.5 mm 10' light 9.0 mm 10' 1 ght 0 mm ght 1.5 mm ght - 0 mm 1.0 mm 8.0 mm 10' light 1.0 mm No. 3 Constants as in Protocol 1 10' dark - 2.0 mm 10' light - 3.0 mm 10' dark 3.5 mm 10' light -2.0 mm 10' dark 2.5 mm 10' light 3.5 mm 10' dark 2.5 mm 10' light - 3.5 mm 10' dark 0 mm 10' light - 3.0 mm 10' dark 1.0 mm 10' light - 5.0 mm 60' dark 55.0 mm 60' light - 4.0 mm 60':H' = 4 + 55 = - 59 mm 60' dark — 11.5 mm 60' light - 20.0 mm 60':H == 20 11.5 = 31.5 mm Experiment II: Both vessels were now constantly illuminated with a 100-watt incandescent lamp of nonmeasured* light intensity and red light of measured intensity added for alternating periods of 5'. Actinometer for the red light (total) 5.4 id O2 per minute. * But kept constant by a 500-watt voltage regulator. 86 The Quantum Efficiency of Photosynthesis No. 5 5 'white— 18.5mm 5 '(white + red) + 22.0mm 5'white-; 18.0mm 5 '(white + red) + 22.5mm 5 'white— 16.5mm 5 '(white — red) + 22.0mm 5'white — 17.5mm 5 '(white + red) + 20.5mm 5'white- 17.0mm 5 '(white + red) + 23.0mm 25'white + 87.5mm 25'( white + red) + 110 mm No. 3 5'white + 14.0mm 5 '(white + red) - 15.0mm 5'white — 14.0mm 5'( white — red) — 16.5mm 5'white + 12.5mm 5 '(white ; red) — 16.5mm 5'white -1- 14.0mm 5 '(white + red) + 14.0mm 5'white + 11.5mm 5 '(white + red) + 15.0mm 5'white + 12.0mm 5 '(white ! red) + 14.5mm 25':H' = 110 -87.5 22.5 mm 30 ' white + 78 mm 30 '( white -| 30:H = 91.5 — 78 - + 13.5 25':H = 11.3 mm red) mm 91.5mm Calculation of quantum efficiency for experiment I (Dark ± Red) In 60': H + 31.5 mm H' + 59 mm Applying equations (1) and (2), protocol (1) In 60'xoo + 70.4 /d | CO2 xco2 = — 56.0 //l Quantum efficiency for O2, Quantum efficiency for CO2, o2 1 60 • 5.4 xp 70.4 1 60- 5.4 0,8 4.6 5.8 q> 56 Calculation of quantum efficiency for experiment II (White ± Red) In 25':H i 11.3 mm H' f 22.5 mm Applying equations (1) and (2), protocol (I) In 25' xo2 XCO-2 30.3 ,/d \ 27.2 /d | Quantum efficiency for O2, Quantum efficiency for CO-j V CQ2 Oo 25 0.90 5.4 30.3 25- 5.4 27 4.5 5.0 Experiment III, with the same cells, was performed between experiments I and II, the white light being, however, of somewhat lower intensity. Here only one vessel (No. 5) was used; but if we take as y the average value of experiments I and II, that is — 0.85, xo2 can be calculated according to equation (3), protocol (1). The readings in vessel (5) were: No. 5 5' white ! 5.0 mm 5 '(white 5' white ! 6.5 mm 5'(white 5' white 6.5 mm 5 '(white 5' white f 5.5 mm 5 '(white 5' white + 7.0 mm 5 '(white red) + red) + red) + red) + red) + 11.5 mm 9.5 mm 9.5 mm 13.0 mm 15.0 mm and with y 0.85 25' white + 30.5 mm 25'(white + red) + 58.5 mm 25':H' == 58.5 — 30.5 = + 28 mm 25' xo, = + 34 /d The quantum efficiency with the actinometer value of experiments I and II (5.4 /d O2 per minute) was 25 • 5.4 34 = 4.0 for O2 The total duration of these experiments was 7 hours from the time of initial equilibration until 1 the last yield determination that gave a value — 4.5 for oxygen, which was obtained at approxi- mately 4 times the compensation point. The final pH in the cell suspensions was 5.4. The Quantum Efficiency of Photosynthesis 87 PROTOCOL No. 3 Comparison of the yield in carbonate-bicarbonate mixtures and in culture medium Experiment of VI-1-49. 20° C. 630 — 660 m/t. Three vessels, in each 7 ml cell Suspension, containing 200 /d of cells. Cultures centrifuged, then washed once in, and taken up in, carbonate- bicarbonate mixture. Intensity 5.4 /d O? per minute. I. Vessel No. 7. V = 13.824 ml Vf = 7.00 ml ko2 = 0.657 Gas space air. Solution 85 parts M/10 NaHC03 tion point with white ligin. 15 parts M/10 K2CO3; pH 9.2. At compensa- 15' white light 0 15' white light | red light 11.5 mm 15' white light 0 15' white light — red light 11.5 mm 15' white light 0.5 mm Light action 30' 23 + 0.5 + 23.5 r 1 30 • 5.4 162 cP 15.4 15.4 = 10.5 15.4 /d II. Vessels Nos. 3 and 5, containing 7 ml culture medium, pH 4.9, with 200 //l of cells each. Cultures centrifuged, then washed once in, and taken up in, fresh culture medium. Gas Space 5% CO2 in air. Mirror shifted every 10' from one vessel to the other; actinometer 5.4 /d O2 per minute for red light. No. 3 No. 5 V = 17.993 ml V = 13.913 ml Vf = 7.000 ml Vf = 7.000 ml ko2 = 1.046 k'o2 = 0.665 kco2 1.634 k'co2 = 1-253 15' white light + 11.0 mm 15' white light + red light + 29.5 mm 15' white light red light + 17.0 mm 15' white light 15.5 mm 15' white light 10.5 mm 15' white light -f red light + 29.0 mm 15' white light red light 16.0 mm 15' white light 17.5 mm 30' H = I 11.5 mm 30' H' = + 25.5 mm xo2 XCO2 : = + 41.3 -43.0 mm \y = - 1.04 mm ) ' 1 <P 30 • 5.4 41.3 162 41.3 -3'9 III. Vessel No. 7, with same cells as before but without white light (below compensation-point). pH 9.2 10' dark — 33.5 mm 10' red light — 23.5 mm 10' dark — 30.5 mm 10' red light — 22.5 mm 10' dark — 30.0 mm 20' dark — 60.5 mm 20' dark 62.7 mm, 20' red light — 46.0 mm Light action 20' 62.7 — 46 = + 16.7 mm = 11 /d 1 20 • 5.4 ~ 11 9.8 88 The Quantum Efficiency of Photosynthesis IV. Again Nos. 3 and 5, but no white light (under compensation point) pH 4.9 No. 3 No. 5 10' dark 4.0 mm 10' red light - 5.0 mm 10' red light - 1.5 mm 10' dark 5.0 mm 10' dark - 12 mm 10' red light - 4.5 mm 10' red light - 1.5 mm 10' dark 13 mm 10' dark 5.0 mm 10' red light - 4.0 mm 30' dark - 14.0 mm 30' dark - 37.6 mm 30' red light - 4.5 mm 30' red light --- 13.5 mm Light action H - — 9.5 mm H' = + 24.1 mm 30' *°2 xco2 = — 45.6 { 53.0 ) y = — 1.18 1 30 • 5.4 45.6 = 3.6 V. Again No. 7, but with half light intensity (Actinometer, 2.75 fi\ O2 per minute), pH 9.2. 10' red light — 24 mm 10' dark — 28 mm 10' red light — 24.5 mm 10' dark — 27.0 mm 10' red light — 23 mm Light action 10' 27.5 — 23.8 = + 3.7 mm --- 2.42 /A 1 10- 2.75 = = 11.3 v 2.42 The total duration of these experiments was 8 hours. IX. Summary and Conclusion Since development of the new methods and procedures described, in a sequence of thirty experimental days, almost without exception quantum efficiencies of 3 to 5 quanta per molecule of O2 produced by the action of red light have been obtained. The simultaneously observed quotients of Q 2 for light action lay between —0.8 ancl _1.3, which means that the quantum efficiencies for CO2 consumption in red light were essentially the same as those for O2 production. These results were obtained not only with low light intensities below the com- pensation point and for short periods of time (minutes), but also with light intensi- ties well above the compensation point (several fold), and in experiments lasting many hours. It is important to emphasize that with the same cell Suspension the same quantum yields may be obtained both below and far above the compensation point. The new results resolve several uncertainties left open by the experiments of 1923. At that time the light intensities were so low that only a fraction of the respi- ration was compensated by the light. Thus the objection could never have been refuted that light inhibited respiration anticatalytically, that is, without expenditure of energy. But now, in the experiments above the compensation point, this question is eliminated, and chemical energy, corresponding to positive 02 production and CO2 consumption, is in fact clearly gained. The Quantum Efficiency of Photosynthesis 89 It was a further shortcoming of the experiments of 1923, that the yields had been determined only for short periods of time (e.g., 10 minutes). But now, in the ex- periments above the compensation point, the cells are so nearly under their natural culture conditions, that there is no evident time limit to yield determinations. Thermodynamically this is a noteworthy advance since the longer the experiments the surer becomes the necessary condition of all calculations of yield : that the absorbed light energy is the sole source of energy for the photosynthetic processes. Finally, we may point out that the methodology has been so simplified that effi- ciency determinations can be carried out wherever simple manometric equipment and a suitable light source are available, without the need of a bolometer, thermopile, cathetometer or special differential manometer. In fact, demonstration of the high quantum efficiencies reported in this paper may readily be made in the labora- tory class-room. Acknowledgements Valuable aid in these experiments was provided by Mrs Lois B. Macri, Mrs Clara F. Smith, and C. R. Newhouser. The culture of Chlorella pyrenoidosa was provided by Dr F. E. Allison of the Plant Indastry Station, United States Depart- ment of Agriculture, Beltsville, Maryland. We wish to thank E. Machlett and Son, New York City, for special facilitation of provision of the manometric glassware, and the American Instrument Company, Silver Spring, Maryland, for the specially adapted thermostat and shaking mechanism employed. Resume et Conclusions Depuis le developpement des nouvelles methodes et des nouveaux procedes decrits, nous avons trouve, ä peu pres sans exception, une efficience de 3 ä 5 quanta par molecule d'oxygene produite co2 par l'action de la lumiere rouge. Les coefncients observes simultanement pour l'action de la lumiere se trouvaient entre — 0.8 et — 1.3, ce qui signifie que l'efficience en quanta pour la lumiere rouge est ä peu pres la meme pour la consommation de CO2 que pour la production de O2. Ces resultats ont ete obtenus non seulement pour de faibles intensites et de courtes periodes, mais aussi pour des intensites bien au-dessus du point de compensation (plusieurs fois) et pour des experiences durant plusieurs heures. II est interessant de noter que l'on peut obtenir les memes rendements en quanta pour une meme Suspension cellulaire au-dessous et au-dessus du point de compensation. Les nouveaux resultats resolvent plusieurs incertitudes qui avaient subsistees apres les expe- riences de 1923. A cette epoque, les intensites de lumiere etaient si faibles que seule une fraction de la respiration etait compensee par la lumiere. C'est pourquoi, l'objection n'a jamais pu etre refutee selon laquelle la lumiere empecherait la respiration anticatalytiquement ,c.ä.d. sans depense d'ener- gie. Actuellement cette question se trouve eliminee par les experiences au-dessus du points de com- pensation et on a vraiment un gain en energie chimique correspondant ä une production positive de O2 et une consommation de CO2. Une autre insuffisance des experiences de 1923 est due au fait que les rendements avaient ete determines seulement pour des periodes breves (p. ex. 10 minutes). Actuellement, oü l'on travaille au dessus du points de compensation, les cellules se trouvent si pres de leurs conditions de culture naturelles qu'il n'y a pas de temps limite evident pour les determinations de rendement. C'est un serieux avantage du point de vue thermodynamique, car plus les experiences sont longues, et plus sürement la condition necessaire pour toute determination de rendement sera remplie, c.ä.d. que la lumiere absorbee soit la seule source d'energie pour le Processus photosynthetique. Finalement, nous avons, tellement simplifie la methodologie que des determinations d'efficience simplifiees peuvent etre effectuees facilement partout oü l'on dispose d'un manometre et d'une 90 The Quantum Efficiency of Photosynthesis source de lumiere adequate. On n'a pas besoin de bolometre, de thermopile, de cathetometre, ni de manometre, differentiel special. En effet l'on peut demontrer l'efficience quantique elevee, rapportee dans ce memoire, dans un laboratoire de classe. Zusammenfassung und Schlußfolgerungen Seit die hier beschriebenen neuen Methoden und Verfahren entwickelt worden sind, haben wir in einer Reihe von 30 Arbeitstagen fast ohne Ausnahme Quantumsleistungen von 3 bis 5 Quanta pro Molekül O2 (gebildet unter der Einwirkung von rotem Licht) gefunden. Gleichzeitig wurden Quotienten für die Lichtwirkung gefunden, die zwischen - 0.8 und - 1.3 lagen; dies be- 0-2 deutet, daß die Quantenleistung in rotem Licht für COs-Aufnahme und Oo-Abgabe ungefähr gleich war. Diese Ergebnisse wurden nicht nur für niedrige, unter dem Kompensationspunkt gelegene Lichtintensitäten und für kurze Zeitspannen (Minuten) gefunden, sondern auch für hohe, weit über dem Kompensationspunkt gelegene Lichtintensitäten und für Versuche von mehreren Stunden. Mit der gleichen Zellsuspension kann man unter- und oberhalb des Kompensationspunktes dieselbe Quantumausbeute erhalten. Die neuen Ergebnisse beheben einige Unsicherheiten der Versuche von 1923. Damals waren die Lichtintensitäten so gering, daß nur ein Teil der Atmung durch das Licht kompensiert wurde. Der Einwand, daß das Licht die Atmung antikatalytisch, also ohne Energieverbrauch hemme, konnte daher nie widerlegt werden. Nun aber, in den Versuchen oberhalb des Kompensationspunktes, ist diese Frage erledigt; es wird wirklich Energie entsprechend der Abgabe von O2 und Aufnahme von CO2 gewonnen. Ein anderer Mangel der Versuche von 1923 bestand darin, daß die Ausbeuten nur über eine kurze Zeitspanne (z. B. 10 Minuten) bestimmt wurden. Nun aber, in den Versuchen oberhalb des Kompensationspunktes, befinden sich die Zellen so nahe den Bedingungen einer normalen Kultur, daß eine offensichtliche Zeitgrenze für Bestimmungen der Ausbeute nicht besteht. Thermodyna- misch gesehen ist das ein wichtiger Fortschritt, denn je länger die Versuchszeit, desto sicherer wird die für alle Berechnungen der Ausbeute notwendige Bedingung erfüllt sein : daß nämlich die absor- bierte Lichtenergie die einzige Energiequelle für den photosynthetischen Vorgang sei. Endlich können wir darauf hinweisen, daß wir die Methodologie so vereinfacht haben, daß Leistungsbestimmungen mit einem einfachen Manometer und einer passenden Lichtquelle, ohne Bolometer, Thermoelement, Cathetometer und Spezial-Differentialmanometer, ausgeführt werden können. So können die hier mitgeteilten hohen Quantumsleistungen im Schullaboratorium nachge- wiesen werden. Appendix Emerson has objected2- 5 to the yield determinations of 19231 and 19484 on the ground that the assimilatory y == CO2/O2 was not determined simultaneously with the yield cp; i.e., that the value of y employed, — 0.91, which had been determined gas analytically, may not be the y during the different (/-determinations carried out for different periods of time, light intensities, and cell cultures. As has been mentioned, we have observed experimental fluctuations of y from — 0.8 to — 1.3 If we had used these y-values in 1923 for the computation of cp, let us see what the values of <p would have been. The volume of our vessel was 37.0 ml and the volume of the liquid phase 16.53 ml. For 10°C Therefore kco2 — 5.67 ko2 = 1-70 ^C02 * ^02 5.67 • 1.70 5.67 + y 1.70 Ko2 - kco2 + V ko2 1 Koo Quantum requirement 2.24 4.20 2.34 4.00 —0.8 -0.91 —1.3 2.78 3.40 The Quantum Efficiency of Photosynthesis 91 where the underlined values are the values used and obtained in 1923. This calculation shows that Emerson's objection was not very significant and could not explain the divergent quantum requi- rements of 4 against 10 to 12. II. In an effort to avoid difficulties caused by fiuctuations of y. Emerson and Lewis made quantum-efficiency measurements in carbonate-bicarbonate Solutions at pH 9.1, which kept the COi-pressure constant instead of using culture medium at pH 4.9. They claimedJ that in such alkaline Solutions the quantum-efficiency was the same as in the acid culture medium: "then we find the yields measured in acid phosphate culture medium are in good agreement with those measured in carbonate mixture". But the experimental data were not presented to substantiate this important Statement. We can confirm Emerson's finding that in the carbonate-bicarbonate mixtures the quantum-requirement is 10 to 12, but we cannot confirm that the same quantum efficiency is obtained in the acid culture medium. Data presented in protocol 3 show that very different quantum-efficiencies are obtained if we determine the quantum efficiency of aliquot portions of a cell Suspension in carbonate mixture at pH 9.1 and in culture medium at pH 5. The quantum values observed in the following time se- quence were <P In carbonate mixture at pH 9 10.5* In culture medium at pH 5 3.9* In carbonate mixture at pH 9 In culture medium at pH 5 In carbonate mixture at pH 9 where the asterisked values were obtained above the compensation point and the others below the compensation point. Maximum yields should therefore not be determined in the carbonate mixture, as has been done frequently during the last 10 years. References 1 Warburg, O., Über die katalischen Wirkungen der le- 3 Warburg, O., and Schocken, V., Arch. Biochem. 21 bendigen Substanz, Julius Springer, Berlin 1928. (1949), 363. 2 Franck, J., and Loomis, W. E., Photosynthesis in 4 Warburg, O., Am. J. Botany 35 (1948), 194. Plants, The Iowa State College Press, Arnes, Iowa 5 Emerson, R., and Lewis, C. M., Am. J. Botany 28 1949. (1941), 789. 9.8 3.6 11.3 6 The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery* Dean Burk, Sterling Hendricks, Mitchell Korzenovsky, Victor Schocken and Otto Warburg It was reported in 19234 that in photosynthesis 4 light quanta, absorbed by Chloro- phyll in green cells, can produce one molecule of oxygen under favorable condi- tions. This means that with red light about 65 percent of the absorbed radiant energy can be transformed into chemical energy. Quanta of red light are of low energy (~ 44,000 cal/mole) and several such quanta must therefore cooperate to develop one molecule of oxygen, which requires ~ 112,000 cal/mole. No analogy is known in the nonliving world, where most photochemical reactions, although simpler and effected by quanta of higher energy, are far less efficient in energy transfor- mation, and are indeed usually exothermic. It became clear that an unknown principle, active in nature, awaited elucidation by physics and chemistry. It is well known how the anticipated study of this new principle was interrupted about 1938, when almost every investigator in the field came to accept as the maxi- mum efficiency of the energy transformation low values of 20 to 25 percent, that is to say, quantum values of 10 to 12 with red light. The development of this revocation has been extensively summarized in a book just published in the last few months by James Franck and Walter Loomis1 and contributed to by a series of investigators. We have reinvestigated the problem and have rediscovered the high efficiency of energy transformation in photosynthesis. The data obtained are conclusive. In the course of this reinvestigation the methods have been simplified and im- proved in such a way that determinations of quantum requirements are no longer the privilege of the few. On the contrary, anyone who has a suitable light source and simple manometric equipment can now determine quantum requirements and convince himself that in green cells the greater part of the absorbed light energy can be transformed into chemical energy (see Addendum). Improvements in Technique Culture of cells. A strain of Chlorella pyrenoidosa, used in various institutes for many years and originally isolated and identified by Florence Meier, of the Smith- sonian Institution, was cultivated in 300-ml gas wash bottles of the Drexel type. The culture medium was 5 g MgS04 ■ 7H20, 2.5 gKN03, 2.5 gKH2P04, 2 gNaCl, and 5 mg FeSOa • 7 HoO, dissolved in 1000 cm3 of nonsterilized well water (pH 4.5 to 5.0). Approximately 100 mm3 of cells suspended in 200 cm3 culture medium was added to each bottle, and aerated with 5 percent CO2 in air so rapidly (/*»> 500 ml/min) that no Sedimentation of the cells occurred. They were illuminated with a 100-w incandescent lamp that raised the temperature in the bottles to 25 — 30° C. * Republished from Science 110 (1949): 225 by permission. The Maximum Efnciency of Photosynthesis : A Rediscovery 93 After several days, when the cells had multiplied several fold, and the pH had risen 0.5 to 1 unit, the cultures were used for yield experiments. Such cells gave stable respiration values and high yields without exception. This culture method, which had been employed by one of us (D.B.) for many years in Washington, was found to be an important improvement over the method of 1923 l followed by most later investigators but which we have now discarded. In the earlier method, slowly aerated cells settled down in Erlenmeyer flasks in Sediments that were inadequately illuminated and inadequately supplied with carbon dioxide and oxygen until reshaken up. Manometry. Approximately 300 mm3 of cells, resuspended in 7 cm3 of a fresh culture medium of pH 4.9, were put into rectangular vessels of 14 to 20 cm3 volume and saturated with 5 percent CO-2 in air. Two vessels were used to deter- mine, as described in 19243, the oxygen as well as the carbon dioxide exchange The gas volumes in the two vessels were different, but the volumes of the Solutions and therefore the concentrations of the cells were equal. The vessels were shaken at 20° C. by horizontal motion, with an amplitude of 2 cm. and a frequency of 150 per min. In spite of this rapid motion, which moved the vessels 600 cm. per minute, no splashing or foaming occurred, even in experiments of more than 20 hr. duration. It was a further improvement owing to this motion that physical tran- sition effects were not observed upon change from dark to light and vice versa, that is, the gas equilibration was virtually perfect for our purposes. The well known requirement of the two-vessel method, that the metabolism in the two vessels must be identical (jco2 = x'o* and xcoo = x'coo) was complied with by eliminating a dangerous differential time factor as nearly as possible.The light beam of measured intensity (630 to 660 m//) was shifted by a mirror alternately from one vessel to the other at intervals of 10 — 60 min. or these vessels were shifted alternately into and out of the fixed light beam. Thus in every case the one vessel was illuminated when the other vessel was dark and vice versa, and when many light and dark periods followed each other and the pressure changes of all dark periods and of all light periods were summed, the metabolism in the two vessels was virtually identical for the same periods of elapsed time. The total pressure changes effected by light were usually of the order of magnitude of + 20 to + 50 mm. These figures were differences between two rates of oxygen consumption (negative pressure changes) in the experiments with noncompensated respiration. But when the respiration was compensated by white light (see following section) the figures + 20 to -) 50 mm. were the directly observed positive pressure changes, produced by the added red light. To measure such great pressure changes simple Haldane-Barcroft blood-gas manometers could be used instead of the special differential manometer heretofore employed. Measurement of the quantum intensity. The bolometer used in 1923 was replaced by the chemical actinometer described a few months ago(i. This resulted not only in a simplification but in an improvement in accuracy. When the oxygen produced by the red light been measured, the vessel containing the cells was replaced by a similar vessel containing 2 mg. of ethyl chlorophyllide, 200 mg. of thiourea and 94 The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery 7 cm.3 of pyridine, with tank oxygen as the gas phase. The light absorption being complete in the cell Suspension as well as in the ethylchlorophyllide Solution, the quantum requirement per molecule oxygen was obtained by the very simple equation : 1 h • v O2 consumed by the actinometer, 0 ~ O2 O2 produced by the cells where the consumption and the production of the oxygen must be calculated for equal time periods. Complete absorption is the only method so far devised by which the absorption of the light and the action of the light can be measured manometrically under the same conditions. Thus far all manometric determinations of quantum requirements using incomplete absorption are contradictory and uncertain. On the other hand, the main objection against the method of complete absorption was the existence of too great a respiration relative to the measured light action; this objection is no longer valid because today respiration can be eliminated by compensating with white light or components thereof (see the following section). A New Principle Let us consider a Chlorella Suspension, shaken in a beam of red light that is absorbed completely, to be a machine that transforms light energy into chemical energy. The efficiency of this machine will be known if we know the light energy entering the vessel and the amount of oxygen developed in it, one mole of oxygen being equi- valent to the production of about 112,000 cal. Notheory ofthe mechanism of this energy transformation can alter the observed result of such an efficiency determi- nation. Yet there are possible objections to be answered. When at low light intensities respiration still exceeds photosynthesis, then our machine does not produce a net gain of chemical energy, and it might be considered that the light merely inhi- bits the loss of chemical energy. Since respiration is a catalytic process. conceivably its inhibition by light could be merely anticatalytic, requiring no expenditure of energy. Hence the calculation of the efficiency might be safe thermodynamically only when the light intensities are so high that oxygen is in fact given off from the cell suspensions into the gas space. To comply with this requirement we illuminated the cell suspensions with white light (of nonmeasured intensity) over the greater part of the vessel surface, the light intensity per unit area being relatively small, but the influx of light energy through the total area ofthe vessel being sufficient to compensate or overcompen- sate the respiration ofthe cell suspensions. As the compensating light intensity we define here that light intensity which effects the result no oxygen enters or leaves the cell Suspension. It is very likely that in this State the oxygen exchange of all cells in the Suspension is zero, owing to the rapid motion ofthe cells. It is obvious that our compensating light intensity varies with the amount of cells in the vessel and is not to be confused with the compensating light intensity for very thin cell suspensions. The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery 95 When the steady State in the white light was reached, a beam of red light of measured intensity was sent through the bottom of the vessel into the cell Suspen- sion, the cross section of the beam being 3 cm.2 and the total energy flux about 0.25 microeinsteins/min. It was completely absorbed in the cell Suspension. The increase of positive pressure efTected by the red light and the intensity of the red light were the two magnitudes from which the efficiency of the energy transforma- tion of the added red light was calculated. The efficiency so found with red light proved to be as high, at and several fold above the compensation point with white light, as the efficiency at zero or low white light intensities below the compensation point (3 to 5 quanta per Oz molecule developed; see Examples 1 — 5). This result raised the whole level of certainty in this field of investigation, and is probably owing in large part to the rapid motion of a great amount of cells. The time of illumination with red light of relatively high intensity must be so short for every cell that no Blackman or other dark reaction limits the action of the light; in other words the product of light intensity and time (i X t) must be tco small to alter the concentrations of dark reactions. The observed efficiency is, of course, a fact that is independent of all theories about what happens in the cell suspensions, chemically or physically. Another factor that might limit the certainty of efficiency determinations is time of illumination. The shorter the time periods, the greater is the danger that the energy of some dark reaction contributes to the oxygen production. The longer the time periods, the more certain are we that we have reached the thermodynamically desirable State in which the concentrations of all cell constituents are kept constant. From 10 min. in 1923 * and 15 min. in 19485 we have now extended the time periods to more than 20 hr. of continuous illumination with white light, producing contmuous positive pressure, and have varied the periods of the efficiency deter- minations with added red light from 5 to 60 min. This great improvement was possible because the horizontal motion of the rectangular vessels did not damage the photosynthetic capacity of the cells and because the white light, when it over- compensated respiration, stabilized the chemical conditions in the cells. In fact, the efficiency of the energy transformation has now been measured under the conditions of growth, so that very likcly the experiments can be extended to any length of time. Nonaction of Light on Respiration If the manometric efficiency of the red light is the same when the respiration of the cell suspensions is noncompensated, compensated, or several fold overcompensated by added unmeasured white light, then obviously every theory should be rejected that assumes that light acts on the process of respiration anticatalytically or stoichio- metrically. This conclusion has now been confirmed independently by the follow- ing type of experimentation : A rectangular vessel was set up to contain NaOH and glass beads in two side arms, 300 mm.3 of cells in 7 ml. of culture medium (pH 4.5—5) in the main com- partment, and air in the gas phase. The vessel was shaken at 20° C. slowly or ra- 96 The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery pidly, and in the dark or in the light. By changing the rate of shaking the steady- state pressures of CO2 in liquid and gas phases were changed, but in the dark this had no effect on the observed rate of respiration. In the light, the rate of oxygen consumption decreased in the slowly shaken vessel ; but in the rapidly shaken vessel, where the steady-state pressure of CO2 was lower, no action of light on the rate of oxygen consumption was observed when the intensity of the light entering the vessel was about 0.25 microeinsteins/min., an intensity that with adequately high CO2 pressures gave high photosynthetic efficiencies (3 to 5 quanta per molecule of O2 developed). The shaking effect was reversible, the action of the light alternately appearing or disappearing with decreasing or increasing shaking rate. The experiments may be extended to higher light intensities, but the higher the light intensity the more effective must be the removal of the carbon dioxide, for which the light and the alkali compete. The CO2 pressure required to yield maxi- mum respiration is clearly below that needed for effective photosynthesis where CO2, functions as subtrate and not merely catalytically. Such experiments prove that the light did not interfere with the process of respiration, either anticatalytically or stoichiometrically by reduction of inter- mediates.* Light, when it compensated respiration, did so by producing oxygen, and because the gas exchange of photosynthesis happens to be the reverse of the gas exchange of respiration. Thus a question, old as the science of photosynthesis, has been answered by the most simple of experiments. Examples 1. Manometric pressure changes effected by red light when respiration was not compensated by white light. Two-vessel method, culture medium pH 5, gas phase 5% CO> in air. 20° C Vessel I Vessel II v == 13.913, vF = 7.00 v' = 17.993, v'F = 7.00 Actinometer 5.4 mm.3 CWmin Vessel I 10 min dark — 26 mm 10 min dark — 23 mm 10 min dark — 23 mm 10 min dark -23 mm Vessel II 10 min dark — 12 mm 10 min dark — 10 mm 10 min dark — 11 mm 10 min dark —11 mm 40 min dark — 95 mm 40 min dark — 44 mm 10 min light 10 min light 10 min light 10 min light -17 mm -15 mm — 14 mm — 15 mm 10 min light 10 min light 10 min light 10 min light — 7 mm — 7 mm — 7 mm — 7 mm 40 min light — 61 mm 40 min light -28 mm Light action 34 mm Light action ; 16 mm xo2 in 40 min — 51.6 mm.3 *co2 m 40 min — 53.7 mm.3 1 hv 40 ■ 5.4 ~0 ~ O., 51.6 CQ2 4.2 1.04 * Zusatz 1961. Aber vergleiche Arbeit 11 dieses Buchs. The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery 97 2. Manometric pressure changes effected by red light at 20nC, when respiration was over- compensated by white light. pH 5.0. gas phase 5% CO-j in air. Actinometer for red light 5.4 mm3. 0> min. TT Vessel I Vessel II v = 13.913, vf = 7.00 v' = 17.993, v'¥ = 7.00 Vessel I 5 min white 18.5 mm 5 min white - red -22 mm 5 min white 18.0 mm 5 min white red - 22.5 mm 5 min white 16.5 mm 5 min white red - 22 mm 5 min white f 17.5 mm 5 min white red 20.5 mm 5 min white r 17.0 mm 5 min white red - 23.0 mm 25 min white 87.5 mm. 25 min white - red = -j 110 mm. Action of red light - 22.5 mm in 25 min. Vessel II 5 min white -j- 14 mm 5 min white red 15 mm 5 min white -\- 14 mm 5 min white red 16.5 mm 5 min white + 12.5 mm 5 min white red 16.5 mm 5 min white -f- 14.0 mm 5 min white red 14.0 mm 5 min white — 11.5 mm 5 min white red 15.0 mm 5 min white -f- 12.0 mm 5 min white red 14.5 mm 30 min white 78 mm 30 min white - red = 91.5 mm Action of red light - 13.5 mm in 30 min. xo» in 25 min 30.3 mm3 | CO2 XCO2 m 25 min — 27.2 mm3 | ' O2 1_ hv_ 25 ■ 5.4 0 " Oo 30.3 = 4.5 0.9 For the same culture, when the respiration was not compensated by white light, we obtained 1 hv 60- 5.4 3> == oT = 70.4 4.6 and CO2 02 0.8 3. Manometric vessels continuously illuminated for 27 hr. by white light of approximately compensating intensity. — — , for the added red light, at the beginning and end of the expe- riment. In hours 1 to 4 respiration compensated, In hours 20 to 22, respiration compensated, ~0 1 = 4.5 (;- = - 1.0) = 4.5 (-/ = - 1.0) In hours 27 to 28, respiration not compensated, — = 3.5 (y 1.27) 4. Comparison of same culture in M/10 carbonate buffer (pH 9) and in culture medium (pH 5). * It may be gathered from this example that the efficiency in the unnatural carbonate buffer is only a fraction of the efficiency in culture medium. Many investigators believed that the efficiencies in both solutions were equal, and this was one of the reasons why the quantum requirement of 4 was denied by them and the figures 10 to 12 accepted. 7 Warburg, Zellphysiologie 98 The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery Red light, 630 — 660 m //. I ~ 0.25 microeinsteins/min 20° C. 1 hv Quantum requirement — = for the added red light. 1 In carbonate buffer, respiration compensated by white light, — = = 10.5 In culture medium, respiration compensated by white light, — = 3.9 (y = - 1.04) In carbonate buffer, respiration not compensad — = 9.8 In culture medium, respiration not compensated 0 3.6 (y = 1.18) In carbonate buffer, respiration not compensated — =11.3 5. Results by 2-vessel method for a series of experiments that were carried out from May 26 to June 16 of this year, at 20° C, in culture medium at pH 5, with an intensity of red light not exceeding 0.25 microeinsteins/min. No experiment is omitted. 1 0 hv O, 3.2 4.6 4.5 3.9 3.6 4.2 2.8 2.8 2.5 4.5 4.7 3.5 4.2 3.0 CO-2 o2 - 1.08 - 0.80 -0.90* - 1.04 - 1.18 -0.97 — 1.16 -1.23 - 1.25 1.00** -0.93** - 1.27 - 1.00 - 1.33 Average 3.7 1.08 It may gathered from Example 5 that the quantum requirement for carbon dioxide consumed can be equal to or somewhat greater or smaller than the require- ment for oxygen produced. For we have 1 1 hv 02 j™_ " co2 ' 0 O, CO., a magnitude which here for the first time, to our knowledge, has been determined in nutrient medium at low pH (about 5), and has been found to approximate hv_ ~<X 3to 5. Yet the quantum requirement for oxygen is the more fundamental energy measure, because there is only one reaction in photosynthesis that produces oxy- * Respiration overcompensated by white light from above. ** Respiration compensated by white light from above. The Maximum Efficiency of Photosynthesis : A Rediscovery 99 gen — the photochemical reaction (decomposition of water)*; but there are many different dark reactions that consume carbon dioxide to form a great variety of products. Thus if, as an extreme case, oxalic acid were formed from water and carbon dioxide y for this Compound would be - - 4 and the quantum requirement for carbon dioxide would be only one-fourth of the requirement for oxygen. Conclusion It follows from the data obtained** that in thespectral region 630 to 660 mu no more than 4 quanta are required to produce one molecule of oxygen gas. A require- ment of 3 quanta is open to serious consideration, although thus far the average value in our experiments has been nearer 4 than 3. A quantum requirement of 4 means that the efficiency of the energy transfor- , 112,000 100 mation in our experiments was approximately - — — T^^p =65 percent, whereas the quantum number 3 would mean an efficiency of about 85 percent. In any event, under favorable conditions the greater part of the absorbed light energy can be transformed in green cells into chemical energy, and this is, to quote the man who laid the foundation of quantitative photochemistry, "a marvellous achievement of nature-". Addendum Quantum requirement determinations were demonstrated to, and carried out with the aid of, the students of the physiology class at the Woods Hole Marine Biological Laboratory on July 19 and 20. Requirements of 3 to 5 quanta per molecule of oxygen gas produced in photosynthesis were observed on these two days. The respiration was overcompensated several fold by light of unmeasured intensity from an incandescent lamp used with or without red filter (cut-off at ^ 560 m//). In two closely comparable, consecutive experiments, quantum requirements of 3.0 and 3.5 were obtained from measured red light (630 — 660 m//). The aid of students Jack Dureil, Richard Klein, Burlyn Michel, and Martin Schwartz in carrying out various of the class experiments is acknowledged gratefully. References 1 Franck, James, and Loomis, Walter E., Photosynthe- 4 Reprinted in Katalytische Wirkungen der lebendigen sis in plants. Arnes, Iowa: Iowa State College Press, Substanz. Berlin: J. Springer, 1928. 1949. 2 Warburg, Emil, Photochemic. Handbuch der Experi- mentalphysik 18 (1928), 655. 6 Warburg, Otto, and Schocken, Victor, Arch. Bio- 5 Amer. J. Bot. 35 (1948), 194. 6 Warburg, Otto, and 3 Warburg, Otto, Biochem. Z. 152 (1924), 51. chem- 21 (1949)> 363- * Zusatz 1961. „Decomposition of water" ist beim heutigen Stand der Wissen- schaft zu streichen. ** Reported in greater experimental detail in Biochem. et Biophys. Acta, October 1949 (Meyer- hof-Festschrift volume); Arch. Biochem., September 1949; and at meeting of Society of General Physiology, Woods Hole, Massachusetts, June 1949. 7 Does Light Inhibit the Respiration of Green Cells?* By O. Warburg, D. Burk, V. Schocken, M. Korzenovsky and St. B. Hendricks It is well known that the oxygen consumption of green cells may be decreased by illumination. The light intensity at which the oxygen exchange of a given culture becomes zero may be termed "compensating." Above this light intensity positive evolution of oxygen gas is observed. The mechanism ofcompensationby light has until now remained uncertain, but the simplest explanation is obviously the pro- duction of oxygen gas by photosynthesis ; that is, since light clearly produces oxygen gas above compensation it is reasonable to suppose that it also does so below compensation. However, the idea, old as the science of photosynthesis, still persists that light inhibits respiration per se, either anticatalytically (as by inactivating respiratory enzymes), or by reducing intermediates of respira- tion. If this idea were true, most computations of photosynthetic efficiency would be invalidated because they have been carried out below the compensation point. A decision on this much-discussed problem has been obtained from the follow- ing type of experimentation, performed many times. In the main compartment of a rectangular vessel, with two side-arms containing alkali, was placed a Suspen- sion of Chlorella pyrenoidosa cells in acid culture medium (pH 4.8), with air as gas phase. The vessel, attached to a manometer, was rapidly shaken and alternately darkened and illuminated from below with a beam of completely absorbed red light of the same intensity (— 0.25 microeinsteins/min./3 cm.2 area) as employed in simultaneous quantum efficiency determinations on aliquot suspensions by the 2-vessel method with 5% CO2 in air as gas phase. In the vessel with low CO2 pressure, negligible light action was observed, the oxygen consumption in the dark and in the light being practically identical, whereas, with aliquots of the same Suspension under otherwise identical conditions except for adequate CO2 pressure, high efficiencies of 3 to 5 quanta absorbed per molecule of O2 produced were observed both below and well above the compensation point, with no change in dark respiration at the widely different CO2 pressures involved (see example). This absence of light action on respiration at low CO2 pressures may appear to contradict the experience of other investigators who, since the use of manometry in photosynthesis, have observed, in vessels containing alkali in side-arms or middle compartments, that the respiration of Chlorella could be compensated by light. The explanation for this apparent discrepancy is that such experiments were carried out with too high light intensities that were not controlled quantitatively by means of simultaneous efficiency determinations. Light and alkali compete for the small amount of CO2 formed in respiration, so that, for every CO2 pressure, Aus Archives of Biochemistry 23 (1949): 330. Does Light Inhibit the Respiration of Green Cells? 101 however low, a light intensity exists that will compensate respiration, as we have confirmed when we have used light of sufficiently high intensity. Our experiments show conclusively that red light does not inhibit the respiration per se when light intensities are employed that yield high photosynthetic efficiencies. When light compensates respiration it does so by the independent process of photosynthesis, the gas exchange of which happens to be the opposite of that of respiration. This result has been confirmed in a different way by determination and comparison of photosynthetic efficiency below and above the compensation point. Under the conditions of our experiments, reported in detail elsewhere*, the same high quantum efficiencies of 3 — 5 quanta per O2 are obtained up to intensities at least five times the compensating intensity. That is, one molecule of oxygen deve- loped above the compensation point, or one less molecule of oxygen consumed below the compensation point, as the result of light action, represents the same gain in chemical energy. All theories of light action should be in harmony with this nowestablished thermodynamic fact. Example Each of three vessels contained 230 mm.3 aliquots of Chlorella pyrenoidosa cells suspended in 7 cc. of culture medium (5 g. MgS04 ■ 7H20, 2.5 g. KN03, 2,5 g. KH2PO4, 2 g. NaCl, and 5 mg. FeSOi • 7H'iO in 1 1. of filtered, unsterilized well water at pH 4.5 — 5). Temperature, 20° C. Horizontal shaking at the rate of 150 cycles/min. at 2 cm. amplitude. Total intensity of red light beam (630 — 660 »i,k), 0.254 microeinsteins/min., equivalent actinometrically to 5.7 mm.3 Oe/min. No. I. 0.2 cc. N NaOH in each side-arm, gas phase air. (Vessel volume 18.87 cc, liquid volume 7.40 cc, ko2 1.09) 20' dark 20' red light hv Ö2, — 40 mm. — 39 mm. 20' red light action + 1 mm. 20 x 5.7 1.09 X02 *02 43.5 mm.3 1.09 mm.3 105 No. II. Gas phase 5% CO2 in air, respiration not compensated by white light. Vessel 3 Vessel 5 Total volume 17.99 13.91 Liquid volume 7.00 7.00 &o2 1.046 0.665 &CO2 1.634 1.253 20' dark - 13 mm. - 27.5 mm. xo2 - 40.6 mm.3 20' red light — 2 mm. — 7.0 mm. 20' red light action 11 mm. f.vo, 23.8 mm.3] 20.5 mm. \y = (*co2 = 19 mm.3) hv 20 x 5.7 — — 4 8 CO2 Oo O2 23.8 — 0.8 * In press, Science and Biochim. Biophys. Acta (Meyerhof Festschrift, October, 1949); and report delivered at meeting of Society of General Physiologists, Woods Hole, Mass., June 22. 1949. 102 Does Light Inhibit the Respiration of Green Cells ? No. III. Gas phase 5% C02 in air, respiration overcompensated several-fold by white light. Vessel 3 20' white light 39 mm. 20' white + red light \- 48 mm. Vessel 5 20' red light action 9 mm. 57.5 mm. + 76 mm. 18.5 mm. f *o2 \ *C02 hv 20 >: 5.7 02 " 26 = 4.4 26 mm.3 26 mm.3 CQ2 Oo 1.0 It will be observed that the oxygen consumption in the dark in Nos. I and II is essentially the same (about 42 mm.3/20'). This means that the C02 pressures used did not influence respiration, and that the CO2 pressure required to obtain maximum respiration is below that required for effective photosynthesis, where CO2 is required as Substrate and not merely catalytically. 8 The Maximum Eff iciency of Photosynthesis* Otto Warburg and Dean Burk Introduction 1. Early Experiments The efficiency of the energy transformation in photosynthesis chemical energv gained E = light energie absorbed was first determined with the unicellular green alga Chlorella in 1922 — 23 1. Also introduced into investigations of photosynthesis at that time was manometry founded upon the different solubilities of Oz and CO> in aqueous media. The well known equations of the one-vessel method were derived &CO2 • ko2 roi [1] Äcoo • &o„ xCo2 = h — [2.] where h is the observed pressure change and y is the assimilatory quotient:x:co2/:*:02= = cmm CO2 exchanged cmm. O2 exchanged. h was measured with an accuracy of a few hundredths of a millimeter by a special cathetometer-microscope focused on a differential manometer that was kept in rapid circular motion. y, which had to be known for the computation of the gas exchange xo2 and *co2 by the above equations, was determined by gas analysis; the value of -- 0.91 was obtained and used in Eqs. 1 and 2. The problem of the scattering of light by the algal cells, the main source of difficulty in cell-photochemistry, was overcome by the introduction of complete light absorption. Thus, when the intensity of the light entering the manometric vessels had been measured, the absorbed light was obtained by the equation absorbed light = entering light. * Aus Archives of Biochemistry 25 (1950): 410. For publications on earlier aspects of this investigation, with various collaborators, see Refs. 20, 21, and 22. Zusatz 1961. Dies ist der Beginn der modernen Manometrie der Photosynthese. Alle möglichen Einwände sind diskutiert und experimentell geprüft worden. Mit den in den folgenden Jahren weiterentwickelten Methoden ist zum Beispiel ent- deckt worden: der Quantenbedarf 1 der Sauerstoffentwicklung bei der Photosyn- these; der Quantenbedarf 2,9 der Kohlensäurespaltung beider Photosynthese; die Photokatalyse des blaugrünen Lichts bei der Photosynthese ; die Glutaminsäure, ihr schneller Zerfall und ihre aerobe Rückbildung in Chlorella; die funktionelle Kohlensäure, ihr anaerober Zerfall und ihre aerobe Bildung in Chlorella. Die Diskussion der vielen Einwände gegen den hohen Energieumsatz in Chlorella erscheint heute wie ein Kampf gegen Windmühlen, war aber damals, so kurz nach Beendigung des Krieges, notwendig. Heute würde man sagen, daß Emerson den Quantenbedarf 12 statt 3 fand, weil er seine Messungen bei einem Kohlensäuredruck von 20 mm statt bei 200 mm Brodie ausführte. 104 The Maximum Efficiency of Photosynthesis To measure the entering light, a bolometer was constructed with a light-absorb- ing area greater than the cross section of the light beam used. The total light inten- sity entering the vessel was then obtained by one single bolometric measurement, and the difficult and inaccurate Integration of light intensities over the cross section of the light beam was avoided. When the foregoing technique had been worked out, a series of 37 efficiency determinations were performed in 3 regions of the visible spectrum, and the manometric and bolometric readings obtained were presented. If the number of quanta absorbed by the Chlorophyll of the cells was compared with the O2 developed, the average quantum number of the series was 4, per molecule of O2. Thus, in the red at 660 m/(, where the molar quantum energy is 43,000 cal., about 112,000 v 100 — fi"i0/ 4x 43,000 X lüü-b5'° of the absorbed light energy was transformed into chemical energy. It may be emphasized that it is more important to compare the absorbed light with the Oo developed rather than with the CO2 consumed. The energy gained per molecule of O2 is very much the same for most any of the possible end products of photosynthesis, whereas the gain of energy per molecule of CO2 absorbed could be quite different for various possible end products. As an extreme example, one may note that if one of the end products of photosynthesis were oxalic acid, as in the equation 2H20 + 4 C02 : nhv = 2 (COOH)2 + 02, the gain of energy per molecule of oxygen developed here would obviously be four times the gain of energy per molecule of carbon dioxide consumed. Efficiencies as high as 65°,, have thus far not been obtained in any endothermic photochemical reaction. Only one other photochemical reaction is known2 to have an efficiency approaching that of photosynthesis, the ozonization of molecular oxygen by the wavelength 207 m//, 3 O2 + 1 hv = 2 O3, 68,000 with an efficiency of 100 = 50%. But this exceptionally high elficiency was obtained with quanta of the high energy of 137,000 cal./mole, whereas the high efficiency of photosynthesis was obtained with quanta of the low energy of 43,000 cal./mole, in a reaction that thermodynamically requires at least three such quanta. Because the photosynthetic efficiency reported in 1923 was very high, doubts arose as to whether the results were correct. Some investigators, in fact, working with different methods3, succeed- ed only in realizing much lower efficiencies. The doubts increased when4' 5 an error was claimed to have been discovered in the method of 1923. It was alleged: that when Chlorella, pre- viously kept in the dark, was illuminated for short periods (e.g., 5 — 10 min.), CO2 burst out of the cells, and was reabsorbed when the cells were darkened again; that a large part of the pressure changes observed in 1923 in light and in dark were outbursts and inbursts of CO2 and that only a fraction (one-third to one-half) could have been due to photosynthesis; and that the assimila- tory quotient, y = CO 2 exchanged/O-2 exchanged, was not approximately minus one (— 0.91) as determined by gas analysis in 1923 for experimental periods of several hours, but that its real value must have approached r 4. Therefore, the real minimum quantum requirement of photo- synthesis must have been not 4 but nearer 12, and the real maximum efficiency not 65° 0 but nearer 22° 0. This allegation seemed to have been further confirmed by experiments performed not in acid medium as in 1923 but at pH 9 in carbonate buffer; this kept the pressure of CO2 invariant and therefore manometrically avoided the supposed errors caused by the outburst and inburst of CO2. In such nonphysiological buffers, which had been introduced in 19181 for simpli- fication of certain types of experiments, but avoided for determinations of maximum efficiency, quantum requirements of 10 — 12 per molecule of O2 were reported0. However, the proposed "CO2 outburst", at variance with the experience of the previous Century and a half, was never actually demonstrated in published ex- periments involving quantum yield measurements. In the only completely detailed efficiency experiment in which the light-dark time course was reported4 (p- 821>, calculations, not performed by the authors, show that the pressure changes for The Maximum Efficiency of Photosynthesis 105 the second 5-minute periods of illumination were actually more positive (less negative) than for the first 5-minute periods (-- 1.86 for the second period com- pared with — 2.17 for the first; + 0.11 for the second period compared with — 2.13 for the first). This result, offered as a typical experimental example, was a direct contradiction of an outburst and of4(Fig-2) provided to illustrate an initial pressure burst graphically. In a later paper5, in which identification of the pressure burst with a burst of C02 was attempted, the only data again available5(Figs2and3 were obtained by the two-vessel method in which the two vessels were studied not simultaneously but 5 hours apart, and the vessel-constant data necessary to calcu- late cmm O2 and CO2 from pressure changes were unfortunately not supplied so that it is not possible for the reader to check the calculations independently or to arrive at an estimate of the error involved; the latter ordinarily may be shown to become large as values of y approach — 0.5 to 0,and extremely large for positive values (0 to + 4). 2. Later Experiments In 1945,! the assimilatory quotient y == CO2/O2 was redetermined for Chlorella suspended in acid culture medium, but this time the manometric instead of the gas analysis method was employed, and the illumination periods were of the order of 10 min., not hours. Again a y value of about minus one (— 0.93) was obtained. A new series of efficiency determinations was then carried out with the method of 1923, but this time with different volumes of fluid and gas phases in the vessels. While the relation, zjf/*>g = = volume of fluid/volume of gas, had been 2.24 in 1923, this time it was 1.24. Again an average quantum requirement of 4 was obtained, when again the experiments were computed with a y value of - - 0.9. According to the principle of the two-vessel method7, the same quantum requirement could not have been obtained in 1923 and 1945, if the true y value had differed markedly from minus one. At the end of 1948, a few two-vessel efficiency experiments were carried out by us at the Botany Laboratory of the University of Illinois, Urbana, through the courtesy of Dr. Robert Emerson, with cultures of Chlorella provided by him. The cells, when washed in fresh acid culture medium and strongly illuminated with an incandescent lamp, produced 02 like normal cells, i.e., the Blackman reaction was normal. But at low-light intensities of red light, where the photochemi- cal reaction was the limiting reaction, the O2 production was at first often small or zero, or even negative (O2 being absorbed in light instead of being produced). Evidently the photochemical reaction was abnormally ineffective, or some photo- öxidation process was superimposed. After a time, when the cells had been shaken for many hours in the fresh acid culture medium, the photochemical reactivity often recovered. On 3 of 10 days when experiments were carried out, quantum requirements of 4 — 6/molecule of O2 produced or CO2 consumed were obtained after long "latent" periods. Such experiments left little doubt that quantum requirements as low as 4 — 6/mo- lecule of O2 produced or CO2 consumed were experimentally observable by the 106 The Maximum Efficiency of Photosynthesis two-vessel method under favorable conditions. But the irregulär behavior of the cells employed, especially their long latent periods, seemed to us so unsatisfactory that we decided to reinvestigate from the beginning the problem of the efficiency of photosynthesis. While our new investigation was proceeding in Bethesda in early 1949, a series of papers on the efficiency problem appeared in book form in "Photosynthesis in Plants"8. The results reported in this volume seemed to be conclusive and final: with three different and independent methods — manometric, Polarographie, and calorimetric — minimum quantum requirements of 10 — 12/molecule of O2 pro- duced were obtained. New Experiments 1. Cültivation of Chlorella A strain of Chlorella pyrenoidosa, isolated and identified many years ago by Dr. Florence Meier of the Smithsonian Institution, was eultivated in Drechsel gas washing bottles containing 200 ml. of the following sah Solution: 5 g. MgS04 ■ 7 H-jO, 2.5 g. KNO3, 2.5 g. KHTO4, 2 g. NaCl, and 5 mg. FeSOi • 7 H^O containing Zn impurity, in 1 1. of filtered unsterilized well water (pH of the Solution 4.5 — 5.0). The eultures were maintained at room temperatures of 25 — 30 C. and were aerated with 5% CO2 in air at a rate of about 500 cc. gas/min., rapid enough to prevent cell Sedi- mentation, and were constantly illuminated with a 100-watt incandescent lamp at a distance of about 30 cm. The inoculum was 100 cu. mm., sometimes even 200 cu. mm., of cells per flask. When after a few days the cells had multiplied to 600 — -800 cu. mm., they were washed in fresh eulture medium in a No. 2 International Centrifuge at the lowest speed giving nearly complete settling in about 10 min., and were then either reinoculated or used for efficiency determinations. Bacterial growth was found to be negligible, due to the aeid reaction, the lack of added organic matter — in the salt Solution, and possibly antibiotics produced by the Chlorella. Cultivated by this method, used for many years by one of us (D. B.), the Chlorella had a relatively stable respiration and gave high photosynthetic efficiencies. The main drawback of the old eulture method1 was very likely the cell Sedimentation, which unfortunately was praised as an advantage in 1922 and was therefore favored by later investigators. In the course of the years the tall Erlen- meyer flasks originally employed became broader, and the aeration became so slow that the greater part of the cells sedimented and suffered in the Sediments from lack of oxygen*, carbon dioxide, and light. There still remains the question as to the seeming superiority of well water over distilled water. Thus far, high photochemical efficiencies have been reported only for Chlorella cultivated with tap, well, or lake water, the active substances of which, if any, must be widely distributed, since equally efficient yields have been obtained with waters from Berlin, Liebenberg, Bethesda, and Woods Hole. It is probably safer, for the present, and in the absence of specific investigation, to continue with the use of well or natural waters for the eultures. 2. Intermittency of Illumination When Chlorella in optically thin suspensions is illuminated with increasing light intensities, the rate of O2 produetion at first increases proportionally to the light intensity, then increases more slowly, and finally, at "saturation intensity", be- *In a recent paper" on the eulture of Chlorella, carried out by the methods of 1922, damage from lack of oxygen was cited as being due to nitrite poisoning. This is not true generally, but only when the salt medium contains free nitric aeid1 (p- 385)- The Maximum Efficiency of Photosynthesis 107 comes constant. Thus, with increasing light intensities the efficiency of photo- synthesis decreases, owing, as is generally assumed, to the limiting influence of a dark reaction. It has long been considered as a major difficulty of efficiency deter- minations, that the maximum efficiency can only be obtained at very low light intensities ; this maximum has to be computed from small pressure changes that involve important "corrections for respiration". It will be shown in the following that this difficulty may be overcome by taking advantage of intermittent Illumi- nation with high light intensities. In the steady State at light Saturation, our Chlorella produces about 30 times its own cell volume of oxygen gas/hr. at 20 C. ; and in the region of proportional intensities it produces several times its cell volume of 02/hr. As earlier indicated11- 12, Chlorella and most plants may commonly show a rectangularly hyperbolic function of rate of photosynthesis against light intensity, which means Virtual proportionality up to at least 20 — 30",, of maximum rate under favorable conditions1 (pp. 2893 329). The Chlorella suspensions used for our efficiency determinations were not optically thin, but so dense that the red light was virtually completely absorbed in the suspensions. For example, 300 cu. mm. of cells suspended in 7 ml. of culture medium, were placed in shaken rectangular vessels of 8 cm.- bottom area. Imagine now a device whereby the 300-cu. mm. cells could be homogeneously illuminated as in optically thin suspensions, then the 300-cu. mm. cells at Sa- turation intensity would produce 30 300 9000 cu. mm. of O2 gas/hr., and hence at pro- portional intensities, at the very least, 1000 cu. mm. O2 gas/hr. This means that maximum efficien- cies could be determined at light intensities that produced as much as 1000 cu. mm. of O2 /hr. This is not the case, when the cell Suspension is at rest during the illumination. Then the cells in the outer layers of the Suspension are more strongly illuminated than in the inner layers and the oxygen production is unequally distributed over the 300-cu. mm. cells. The cells in the inner layers might produce no O2 at all, and some cells in the outer layers would produce much more O2 than three times their cell volume per hour. Thus in the outer layers the rate of O2 pro- duction may be less than proportional to the light intensity, and the efficiency, determined for the total cell Suspension, could not be the maximum efhciency. But when the cell Suspension is shaken and the cells move in cycles from higher to lower inten- sities and vice versa, then in a time that is large compared with the duration of a 1-cell cycle, all of the 300-cu. mm. cells may absorb the same amount of light, and produce, proportional to the light intensity, the same amount of oxygen. In this State the maximum efficency can be ob- tained. To reach this State the motion of the cells must be so rapid that the light energy absorbed in any fraction of time in any part of the cell Suspension does not diminish the concentrations of the limiting dark reactions. The more a given total light intensity is concentrated in space and the stronger the spectral region of the light is absorbed by the cells, the smaller will be the illuminated space inside the cell Suspension, and the more rapid therefore must be the shaking to distribute the light evenly over the cells of the Suspension. For example, when a narrow beam of red light was sent into a Suspension of 300-cu. mm. cells, maximum efficiency was obtained in one instance up to an O2 production of 70 cu. mm./hr., but less than maximum efficiency was obtained when the light intensity of the narrow beam was doubled, the motion of the cells being insufficient for the higher light intensity. When on the other hand the greater part of the cell Suspension was illuminated with diffuse white light, maximum efficiency was obtained from the initial beam of red light up to an over-all O2 production of 500 cu. mm./hr. as effected by both light sources. This approached an oxygen production of two times the cell volume per hour, a value up to which proportionality to the light intensity may be readily observed in the steady State in experiments with optically thin suspensions. These facts suggest that the efficieny of photosynthesis should be determined by illuminating cell suspensions from all sides in diffuse light of a spectral region that is only weakly absorbed by the cells. But even with the help of the new actino- metric technique13, this procedure would not allow a correct measurement of the absorbed light. Only when a collimated narrow light beam enters the cell suspen- 108 The Maximum Efficiency of Photosynthesis sion, and the spectral region is strongly absorbed by the cells, is a correct measure- ment possible. Thus, as a compromise, diffuse white light whose intensity was not measured was used to compensate or overcompensate the respiration, and then we measured the efficiency of additional photosynthesis induced by a relatively narrow beam of red light of measured intensity. This section may be concluded with an equation that clarifies the advantageous nature of the intermittency of the illumination in rapidly shaken, dense cell suspensions. If cells are illuminated quanta continuously by light of the intensity i0, ix is given by the equation , then the equivalent intermittent intensity minutes < cm.J In = ly Jfl+ Ati where .\t\ is the time of illumination and . Ifj is the time of darkness. — — j— may be called the "intermittency factor". It is the fraction of time the cells are illuminated in a rapidly shaken dense cell Suspension. It is an oversimplification, of course, to assume that a given cell alternates only between the füll incident intensity ix and complete darkness, whereas all the intermediate intensities actually occur. The intermittency factor is the smaller, the smaller the illuminated volume v light of the cell Suspension and the greater the dark volume v dark of the cell Suspension. Approximately, dt! _ v üght [4] Jfl + Jr2 V Hght + ^dark' and when we insert [4] in [3] we obtain v light [5] Ix X 1 light + V dark an equation which allows one to estimate iX) approximately, from magnitudes that can all be easily determined experimentally. 3. Compensating Light Intensity Chlorella in optically thin suspensions may be illuminated with such a light inten- sity (which depends upon the temperature of the cells and the wavelength of the light) that the 02 production of photosynthesis equals the O2 consumption of respiration. This is the "compensating" light intensity for CK The same light intensity compensates the CO2 production of respiration only if the respiratory and the assimilatory quotients, CO2/O2 are equal. As a rule they are not exactly equal and so the compensating light intensities for O2 and CO2 are not exactly equal. This can easily be demonstrated in experiments with the twovessel method. When the pressure change in one vessel is brought to zero by a certain light inten- sity, the pressure change in the other vessel is as a rule not brought to zero, but may be either somewhat positive or negative. Generally "compensating intensity" in the following means compensating intensity with respect to O2. If the O2 consumption of a dense cell Suspension is compensated by light, it is possible that in a part of the cells respiration is overcompensated and in another part undercompensated. But if the Suspension is so rapidly shaken that the incident light intensity is evenly distributed over all the cells, then when no O2 enters or leaves the cell Suspension as a whole, no O2 enters or leaves any cell in any part of the Suspension. This State is therefore a State of true, not of apparent compen- The Maximum Efficiency of Photosynthesis 109 sation, and is explained by Eq. 3, where z'o is the compensating light intensity for thin cell suspensions. 4. Mechanism of Compensation Compensation of respiration by light has been generally explained by the Oz pro- duction of photosynthesis. But again and again in the history of the science of photosynthesis the question has been discussed as to whether light did not inhibit the very process of respiration itself, for example, by catalytically inactivating respiratory enzymes or by reducing intermediates of respiration14. We have investigated this problem by the following type of experimental procedure : In a rectangular vessel, bearing two side-arms, was placed 300 cu. mm. of Chlorella, suspended in 6 ml. of aeid eulture medium of pH 4.9. The side-arms contained NaOH, the gas-space air. The Suspension was illuminated by a beam of red light (630 — 660 m/0 which entered the cell Suspension in a vertical direction through the bottom of the vessel. The total intensity of the beam was about 0.25 microeinsteins min., and the cross section of the beam at the bottom of the vessel was 3 cm.- The main part of the light was absorbed in the first millimeter depth of the Suspension, so that the illuminated volume of the cell Suspension was only 0.3 cu. mm. or 0.05 of the total volume of the cell Suspension. When the vessel was shaken rapidly, no compensatory effect of the light was observed, that is, the negative pressure changes in the light and in the dark were virtually equal. When on the other hand the gas space contained 5% CO-2, everything eise being equal, quantum requirements of 3 to 5 were obtained for aliquots of the same cell Suspension. Such experiments, many times repeated with the same result, proved that light does not inhibit respiration, when employed at intensities capable of giving maximum photosynthetic efficiencies; such light, when it compensates respiration, does so by photosynthesis, the gas exchange of which happens to be the reverse of the gas exchange of respiration. This result does not contradict earlier observations that in the near absence of CO-2 in the gas space, light can compensate respiration. The light intensities then employed were much higher and were not controlled by simultaneous efficiency determinations. Moreover, in the present experiments we had the advantage of adequate intermittent illumination. In their cycles from dark to light and vice versa the cells had time to give off in the longer dark periods most of the CO 2 pro- duced in their respiration, and when they entered the illuminated volume of the cell Suspension they were relatively free of CO2. Thus in the competition between light and alkali for the CO2 produced in respiration, our special set-up worked in favor of the alkali. 5. The Significance of Compensation Cultivated as described, Chlorella has shown under experimental conditions at 20° an initial respiration of 0.5 to 1.2 times its own volume of O2 gas/hr. After long manometric experiments values as low as 0.2 times the cell volume of O2 gas/hr. have been observed. Thus very different rates of photosynthesis may be necessary to compensate respiration and the "compensating light intensity" is a highly variable magnitude. Compensation of respiration is important for the following reasons : 1. When photosynthetic efficiencies were determined manometrically below the compensation point by a sequence of dark and light periods, the experiments had to be discontinued after some hours, because not only the respiration, but also the efficiency of photosynthesis usually decreased. But when the respiration was over- compensated, so that the pressure changes throughout the whole duration of the HO The Maximum Efficiency of Photosynthesis experiment were definitely positive, then the efficiency of photosynthesis remained constant for even more than 24 hr. Compensation of respiration therefore made long experiments possible. 2. Compensation does not eliminate respiration chemically; but it eliminates respiration manometrically, and thus removes many of the difficulties of efficiency determinations. Positive pressure changes can be produced in the desired ränge. They are more constant than negative pressure changes and when the light actions are obtained as differences of two positive pressure changes at two intensities, the accuracy of the manometric method is improved. 3. Although it has been shown that light does not inhibit respiration, the theore- tical possibility still remained that the process of photosynthesis might inhibit res- piration. Thus the old problem, of whether respiration in the dark and during photosynthesis is the same, was still important in experiments below the compen- sation point. But the problem no longer exists when efficiencies are determined as differences of two positive pressure changes at two light intensities. For then, at the lower intensity photosynthesis has already had occasion to interfere with res- piration, leaving no further respiration for the higher intensity to interfere with. 4. Thermodynamically, efficiency determinations below the compensation point were uncertain because below this point chemical energy is not gained, but only the loss of chemical energy is inhibited. But when in experiments above the com- pensation point we obtain the same quantum requirement as below this point, it is proved that one molecule of Oz produced or one less molecule of O2 consumed are thermodynamically equivalent. 5. Let us consider a Chlorella Suspension to be a machine that transforms light energy into chemical energy. The maintenance of this machine requires an expen- diture of energy that is defrayed by respiration and amounts to 112,000 cal./mole of O2 consumed. If we substract this amount from our gain of energy, we obtain what may be termed the "economic efficiency," E', as distinguished from the "thermodynamic efficiency," E. When, for example, the quantum requirement is 4, the thermodynamic efficiency in red light is 112,000 E = X 100 = 65%, 4 43,000 but the economic efficiency is , ^ E' = Ex ■ where/is the "compensation factor", oxygen developed in light / = oxygen consumed in the dark At the compensation point we have/ = 1, and therefore E' = 0. At 6 times the compensation point (/ = 6), where we still obtain a thermodynamic efficiency of 65%, the economic efficiency is /— 1 5 E' = 65 —— = 65 x - = 54%. / 6 At 10 times the compensation point (f = 10), if the thermodynamic efficiency were still 65%, the economic efficiency would be /— 1 9 E' = 65 -— - = 65 x — = 59%. The Maximum Efficiency of Photosynthesis 111 Thus by experiments above the compensation point it can be shown that the economic efficiency of photosynthesis is high, even when the energy spent by nature for the maintenance of the energy- transforming machine is subtracted from the thermodynamic gain. 6. The idea has recently been discussed that nature may possibly utilize the energy of respiration by diverting it in the light to photosynthesis, away from functions it has in the dark14. If so, then the efficiencies computed for the absorbed light energy should be different at different degrees of compensation. When res- piration is compensated sixfold, it could contribute to the production of 1 mole of Oo only 112,000 6 == 18,000 cal., that is, about 11% of the absorbed light energy of 4 quanta of red light. But when respiration is but once compensated, it could contribute about 65" ,, of the absorbed light energy. The fact that the same efficien- cies of light are observed for uncompensated as for sixfold compensated cells seems to preclude the possibility that the energy of respiration contributes significantly to photosynthesis. The foregoing discussion shows how firm has become the foundation for the new efficiency determinations based on experiments above the compensation point. Most objections, procedural as well as theoretical, that have been raised concerning high photosynthetic efficiencies since 1923, have in one way or another centered around respiration. By compensating it, these objections have lost not only their quantitative significance but even their qualitative meaning. 6. The Two-Vessel Method By the two-vessel method, introduced in 1924 ", the O2 exchange as well as the CO2 exchange of cells can be determined manometrically in the presence of inde- finitely high pressures of CO-j. Equal amounts of cells are placed in two vessels, in each of which vf/vg, the ratio of the volume of the liquid phase to that of the gas phase, is different. Then the same gas exchange produces different pressure changes in the two vessels and from these different pressure changes the quotient y = CO2/O2 and the gas exchanges xo» and XCO2 maY be calculated. It is a necessary condition of this method that the gas exchange of the cells in the two vessels be exactly the same for the whole duration of an experiment. But owing to the principle of the method there must be differences of volume in the two vessels. It is an important question whether these differences of volum can possibly induce secondary differences in the gas exchanges of the cells in the two vessels, during the course of an experiment. When in two vessels, with equal amounts of cells, 5 and 7 ml. of liquid are placed, the total volume of each of the two vessels being 14 ml., vfJvg in the one vessel is 0.56 and in the other 1.0. This is an appropriate methodological difference. However, the concentration of the cells are different. The rate of the intermittency cycles of the cells in the two vessels could be different and so therefore the light actions could be different. In the course of long experiments autoinhibi- tion of the cells might conceivably occur and cause different decreases in the gas exchanges in the two vessels. Such sources of error are avoided when the volumes of the liquid phases are made equal. Then the total volumes of the vessels must be different to obtain the necessary differences in vy/vq. For example, 18 and 14 ml. total volume and 7 ml. of liquid volume is an appropriate arrangement, vf/vg being in the one vessel 0.64 and in the other 1.0. But then the gas exchange of the cells produces different partial pressures of CO2 in the two vessels, with conceivable consequences on the cell metabolism. We prefer this inequality to the inequalities of cell concentrations, be- 112 The Maximum Efficiency of Photosynthesis cause inequalities of CO-2 pressures, which have yet to be shown to have effects over wide ranges of Variation, can easily be readjusted by regassing. Thus, the greater part of our efficiency deter- minations have been carried out with equal liquid and different gas volumes. Another source of error is the differential time factor which may occur if the pressure changes produced by light in the two vessels are not observed simultaneously (an exaggerated instance of this was previously discussed in Early Experiments with respect to Ref.5). The ideal would be to illuminate the two vessels simultaneously* by two light beams, identical not only in total intensity, but also in geometrical design. We did not have such a pair of beams at our disposal and so we illuminated the two vessels one after another closely together in point of time. We illuminated in periods of usually 10 min., by moving one light beam from one vessel to the other and vice versa and taking the readings for both vessels simultaneously. When this alternation was repeated many times we obtained for every vessel a series of dark values and of light values, or of light values of the intensities z'o and i - \i; and when for each vessel all the dark values were summed up and likewise all the light values, the time factor was virtually eliminated and the pressure changes in the two vessels were obtained essentially simultaneously. 7. The Equations of the Two-Vessel Method These equations, derived in 19247, are adapted here to the special purposes of photosynthesis. Because the experiments with compensated respiration play so important a role in this work, the equations are presented not for a sequence of darkness and illumination, but for a sequence of two illuminations with two diffe- rent light intensities, one of which may approach zero as a limit. When the lower light intensity is zero, then the equations hold true for the ordinary sequence of darkness and illumination. The light intensities are denoted as J and J + AJ. They have the units of quanta/min. and are related to i by the equation J = i X cm.2 (quanta/min.). Let both vessels be illuminated first with an intensity J and then with an intensity J - AJ; and let the pressure changes be hj and Äj+^j for vessel I, and h'j and h'j^ \j for vessel II. Then when the pressure changes are observed for equal time periods, and when the two vessels contain the same amount of cells, the gas exchanges xo2 and .rcu2, which are equal in the two vessels, can be calculated by the equations : hj x &co2 — h'j X &'co2 rfil (*o2)j = ~T 77 r, TT, L J &CO2/KO2 — « COo/ß O2 hj x kp2 — h'j x k'p2 f71 (*C02)j = T ,, U, ,7/ L J K02/&CO2 — k 02/« co2 flJ+AJ > &C02 /z'j+JJ •' &'c'02 rfi-i (X0v)j+JJ = 7 TT TT rT, L dJ &C02/*02 — k CO0/& o2 hj+jj x kp2 — h'j+Aj x k'p2 r„ , (^C02)j-JJ = U IU U> IW ' ko2lkc02 k O2/« CO2 where ko2 and ^co2 are the simple vessel constants, no prime mark for vessel I and a prime mark for vessel II. All h values are positive when the light intensity J overcompensates respiration. All h values are usually negative when J = 0, except at high \J values. From Eqs. [6], [7], [6a], and [7a] we can calculate the action of the light increment AJ, if we assume that the gas exchange measured at the intensity J continues during the illumination with the intensity J -f AJ. Then we may subtract [6] from [6 a] and [7] from [7a] and obtain: (hj+AJ — hj) x £co2 — (fr'j+JJ ~- h'j) x ^'002 rgl (*o2)j+jj — (*o2)j = , ,, , , ,, , l J «C02/«02 « C02/« 02 * Zusatz 1961. Vergleiche Arbeit 11 dieses Buchs, wo die gleichzeitige Belich- tung der beiden Gefäße durch einen geteilten Lichtstrahl beschrieben ist. The Maximum Efficiency of Photosynthesis 113 (ftj+jj — ^j) X kp2 — (/z'j+zlJ — h'j) X k'p2 Oco2)j+JJ — Oco2)j = , ,r h, ,,, «O2/KC02 — k o<i\k co2 and if we write we obtain instead of [8] and [9] ^02 = (*o2)j+jj — (*o2)j 3>co2 = (^co2)j+jj — Oco2)j H = Aj+zU — hj H' = h'J+AJ — h'j H x &Co2 — H'k'coz r10i 2 &CO2/&O2 — k'cozlk'o-z H x kp2 — H' x k'p2 K02/^C02 « C2/* CO2 wherej'02 and 3*002 are tne Sas exchanges effected by the light increment \J. There can be little doubt that when the increment \J is added to a high overcompensating intensity J the action of J continues. One might have been more doubtful for the case where \J is added to dark cells (J = 0). But since the same efficiencies have been obtained for \J whether J was quite large or zero, the validity of eqs. 10 and 11 is proved. 8. The Light and Its Absorption A Steinheil glass 3-prism spectrograph, operated with a focal length of 195 mm. at//3.5 for the collimator and a focal length of 710 mm. for the telescope was used as a monochromator. The slit was illuminated with a 750-w. projection lamp. The image of the coiled filament at about 20° to its plane was projected onto the slit with an auxiliary lens. A 1000-w. voltage regulator was used to supply power to the lamp, which operated at constant current. The width of the entrance slit was about 2 mm., corresponding to about 20 m/i in the red region. A slit was placed in the focal plane of the telescope and was adjusted to have a width of about 30 m/( covering the region 630 — 660 rn.fi. A lens was placed behind this slit to throw, in a weakly convergent beam, an image of the exit prism face on the bottom of the manometer vessel. The area of the beam at the vessel was about 3 cm.2 and the energy flux was about 0.6 micro- einsteins/min., or in terms of the actinometer 13.4 cu. mm. of Oo absorbed/min. This intensity was decreased when desired by placing in the light beam just before the exit slit blackened wire screens calibrated by the National Bureau of Standards. The beam of red light entered the manometer vessel in a vertical direction from below and was completely absorbed in the cell Suspension. Its incident intensity, which therefore was also the absorbed intensity, was measured actinometrically, and is denoted in the following experiments as AJ. A second light source was a 100-w. incandescent lamp, kept constant by a 500-w. voltage regulator. The lamp was mounted above the thermostat symmetrically to the two vessels and could be moved vertically to produce the desired State of compensation or overcompensation in the cells. The total absorbed intensity of this light is denoted in all experiments as J. It was not measured,* because efficiencies were only calculated for the increment JJ and thus the action of j was eliminated. Attention may be called to the different volumes of cells which absorbed the measured red light from below and the unmeasured white light diffusely (mainly from above and the side, also some from below due to reflection back from the tank bottom). When 300 cu. mm. of Chlorella, sus- pended in 7 ml. of liquid, was placed in a rectangular vessel of 8 cm.' bottom area, as in most of our efficiency determinations, then the red light \J was absorbed in a volume of about 3 0.1 = 0.3 cc. On the other hand, the white light was absorbed in the greater part of the cell Suspension, because the white light entered the cell Suspension through a greater surface and was on the average less absorbed by the cells because of the shorter wavelengths also involved. In a discussion (Society of General Physiology, Woods Hole, June 22, 1949) the question was raised as to whether the white light from the lamp above possibly did * One must be warned against measuring J actinometrically, J may contain a speccral region that is absorbed by the Chlorophyll in the cells, but not by ethylchlorophyllide dissolved in pyridine. Other spectral regions are not absorbed completely owing to the incident angles of the white light. 8 Warburg, Zellphysiologie 114 The Maximum Efficiency of Photosynthesis not materially reach the lowest layers of the cell suspensions, so that the measured red light from below was absorbed in a cell layer of noncompensated respiration, and hence the efficiency calculated for the light increment AJ was possibly still the efficiency of an inhibition of respiration. Although this question, owing to the rapid motion of the cells, had to be answered in the negative, it has been tested experi- mentally as a result of the discussion. Respiration was also compensated mainly from below, instead of from above, by white light filtered through a red filter that transmitted wavelengths longer than 560 mu. This time the increment of measured red light from below was definitely absorbed by the very cells whose respiration was overcompensated. The same efficiencies for the increment AJ were obtained when the compensation was effected by light from below as from above. In the same discussion objections were raised against the procedure of complete absorption, and experiments with optically thin cell suspensions were suggested. But the methods used to measure light absorption in turbid media seem to be still unsatisfactorily developed in connection with manometry.* It maybe remembered that 10 years ago Noddack and coworkers15"19 determined quantum requirements of thin suspensions of Chlorella that absorbed only about 10% of the incident light. But Noddack observed quantum requirements of 4 in carbonate buffer, which suggests, according to our knowledge of today, that his light absorption measure- ments were possibly in error by more than 100"(„ unless his cultures, which were maintained in an unusual manner, had actually become adapted to give high efficiencies in carbonate buffer. The only serious objection raised against complete absorption was too high a respiration. But since efficiencies are determined with compensated respiration, this objection is no longer valid. 9. The Measurement of the Quantum Intensities Light measurements were carried out manometrically as described in 194913. Two hundred mg. of thiourea and 3 mg. of ethyl chlorophyllide,** dissolved in 7 ml. pyridine, were placed in a rectan- gular vessel of about 8 cm.2 bottom area, with 02 in the gas phase. A beam of red light of 630 — 660 m// and of a cross section of 3 cm.2 entered the Solution in a vertical direction through the bottom of the vessel and was completely absorbed in the Solution. With an adequate rate of shaking, the 02 consumption of the Solution was proportional to the light intensity and did not increase with increasing shaking rates. Let the decrease in 0± pressure in the actinometer be /; mm. in t minutes of illumination and let &o2 (mm2 be the vessel constant for oxygen in pyridine a 2°° = 0.092), then the total inten- sity . \J of the light beam is obtained by the equation: AJ = h &o2/22.4 t (//mole quanta/min.) [12] where 22.4 is the volume of one //mole of gas in cu. mm. The quantum intensity was usually determined at the order of magnitude of about 1 //mole/10 min. (i.e., 22.4 cu. mm./lO min.), as arranged by the use of suitable neutral screens. Because our application does not require the conversion of cu. mm. of O2 to //moles of quanta, we may express the light intensities most simply by the cu. mm. of O2 absorbed/min. in the actino- meter . \J = h kojt (mm3 <>/min.) [13] * Zusatz 1961. Vergleiche Arbeit Nr. 25 dieses Buchs, wo die Anwendung der Ulbrichtschen Kugel für Absorptionsmessungen in Chlorella beschrieben ist. ** The crystallized ethylchlorophyllide was prepared by Walter Christian of the Kaiser Wilhelm Institute at Berlin-Dahlem. Chlorophyll itself was not used owing to the foaming of the preparation at hand in pyridine. The Maximum Efficiency of Photosynthesis 115 10. The Measarement of Quantum Requirements In each of two rectangular vessels of unequal total volume, bearing capillary vents, were placed 300 cu. mm. of Chlorella, suspended in 7 ml. of culture medium at pH 4.9 — 5.1. The vessels were connected to simple Haldane-Barcroft blood-gas manometers (capillary diameter 0.8 mm.) and aerated in the thermostat, usually at 20C, with 5",, COj in air, with a low shaking rate at first. The shaking motion was horizontal with an excursion of 2 cm. After equilibration was reached and the vents closed, the shaking was speeded up to 150 min. and some 15 min. later the first mano- metric readings were taken. Foaming never occurred, even in experiments of more than 24 hr. duration. Splashing occurred only when by accident a manometer was too loosely fastened and jerked suddenly during horizontal motion. In all experiments the measured light, the light increment \J, was of the spectral region 630 — 660 vn.fi, isolated by the monochromator. The beam of this red light entered the thermostat in a horizontal direction through a lateral double glass window (Thermopane, to eliminate moisture condensation), and was reflected by a 45 mirror vertically into a manometer vessel. The mirror could be moved horizontally in the thermostat, reflecting the light alternately into the one or the other vessel. In both positions of the mirror the intensities of the light beam at the bottoms of the vessels were sufficiently equal, if the water in the thermostat was clean. Small inequalities were eliminated, if necessary, by interchanging the positions of the manometers. The subsequent procedure was different depending on whether the experiments were carried out with uncompensated or compensated respiration. In all experiments with uncompensated respiration the mirror was shifted, and thus the gas exchange in both vessels was obtained without interruption, the one vessel being in the dark when the other was in the light. The periods of dark and light varied in these experiments from 5 — 60 min. and the duration of the entire experiments did not exceed several hours after which the light action usually began to decrease along with the respiration. Owing to the rapid shaking, physical manometric transition effects of equilibration were not ordinarily observed when dark cells were illuminated, and vice versa, even when the readings were taken every 1 or 2 instead of 5 or 10 min. In the experiments with compensated respiration the method of shifting the mirror was not usually applied. In a thermostat diffusely illuminated by the compensating white light, shifting of the mirror could alter the distribution of the white light, and the two vessels even if equally illuminated by J before the shifting might not be after a shifting. Thus only one position in the thermostat could be used for the measurement of the \J light action, if essentially equal J values for each vessel were desired.* Hence, first one vessel was illuminated alternately with the intensities J and J 4- 1 J, and in succession the second vessel was brought to the same position and illuminated in the same manner. In the meantime the vessel not receiving \J was shaken in compensating white light (J), but not necessarily read manometrically. These experiments with compensated or overcompensated respiration could be extended for a long time without decrease of efficiency. If after 24 hr. of continuous shaking and illuminating with J the efficiency began to decrease, transfer of the cells to fresh culture medium raised the efficiency again to the initial value. When in the efficiency experiments, with or without compensated respiration, the light intensity AJ effected in t minutes the pressure changes H in the one vessel and H' in the other, vo2 and yco%, the gas exchanges effected by \J t were calculated from H and H' by eqs. 9 and 10 and obtained in cu. mm. of gas. \J was then determined manometrically. The manometer vessels, containing the cell Suspension, were replaced by a similar vessel containing, instead of the 7 ml. of cell Suspension, 7 ml. of the actinometric Solution. Two such vessels may be used, the one to be placed in the red light beam and the other as a control in the "dark." When in t minutes of Illumi- nation \J effected the pressure change h, \J was calculated by Eq. 12 and obtained in cu. mm. of O^/min. The quotient of the two oxygen exchanges, computed for the same time, is the quantum requirement per molecule of oxygen: 1 Oj absorbed by the actinometer \J x t 0 O2 produced by the cells .V02 02 [14] * Since experience eventually showed that the action produced by \J was independent of J over wide limits, it was not strictly necessary for J to be equal for both vessels, and in certain types of experiments shifting of the mirror from one vessel to the other was permissible, if distribution of the white light was not significantly altered. 116 The Maximum Efficiency of Photosynthesis - is thus obtained by the measurement of three pressure changes. Their magni- tudes were in the ränge of 25-50 mm. With every new experimental arrangement, it must be checked, both for the cell Suspension and the actinometer, that the mano- metric readings are independent of an increase in shaking rate. With regard to the outburst and inburst of CO-2, inferred during the last 10 years, even if never demonstrated by published data in quantum yield experiments, it may be emphasized that the quantum requirement per molecule of 0> obtained by Eq. 14 is independent of all alleged fluctuations of C02. When from the pressure changes H and H' the gas exchange is computed by Eqs. 10 and 11, y0l is ob- tained independent of the C02 exchange and j>co2 is obtained independent of the 02 exchange. Measurement of the 02 and C02 metabolism by the two-vessel me- thod would be improperly understood if it were insisted, as upon occasion it has been, that the 02 uptake after the interruption of Illumination could only be mea- sured after 40 min. of dark, by which time the inburst of carbon dioxide would supposedly be completed. On the contrary, for any period of time, during Illu- mination as well as after illumination, the two-vessel method yields the 02 ex- change independently of all C02 fluctuations, providing, of course, that physical equilibration is adequately maintained. The described procedure for measurement of photosynthetic efficiency repre- sents a very great simplification of the quantum requirement determination proce- dures described in 1923 that were adopted in part but never in toto by later investi- gators. The special differential manometer, inconvenient to handle, and the cathe- tometer-microscope, are replaced by simple Haldane-Barcroft blood-gas mano- meters and by direct Observation. The bolometer, with its manifold auxiliary equipment, is replaced by the simplest of all such energy measuring instruments, the manometric actinometer. Finally, especially when the monochromator is re- placed by interference or other appropriate Alters, quantum requirements of photo- synthesis may be performed as simple classroom experiments, and have been20. Experimental Details Our experimental equipment was set up by the middle of March: the Steinheil monochromator; the thermostatted water-bath with Thermopane window, made by the American Instrument Company (Silver Spring, Md.); the manometers and the rectangular vessels manufactured by E. Machlett and Sons (New York City); and culturing arrangements for growing the strain of Chlorella pyrenoidosa that was obtained through the courtesy of Dr. F. E. Allison of the Plant Industry Station (Beltsville, Md.). In the very first experiment we obtained a quantum requirement of 3. But it took us about two and a half months to find out the conditions under which high efficiencies could be obtained in every experiment. In these two and a half months we observed quantum requirements of 3 to 6, but also higher requirements, indeed as high as 20. We often observed rapidly decreasing respirations and light actions in experiments with uncompensated respiration, and could calculate by the equations of the two-vessel method a wide ränge of uncertain yields because the necessary condition of these equations— identity of metabolism in the two vessels— was not yet invariably fulfilled. Only gradually* did we come to clarify and identify the reasons for the irregularities: the Sedimentation of the cells in the cultures, the not always adequate shaking of the * Zusatz 1961. Vergleiche hierzu die Arbeiten 27, 28 und 38, durch die das hier diskutierte Problem vollständig gelöst worden ist (Notwendigkeit des blaugrünen Lichts, Züchtung mit fluktuierender Intensität). The Maximum Efficiency of Photosynthesis 117 manometer vessel, the too few cells in the manometer vessels, the too great time differences bet- ween manometric readings of the two vessels where J = 0, the damage done to the cells when shaken too long in the dark, the too high intensity of the measured red-light beam, etc. In addition, all our early experiments were carried out at 10°C. (as in 1923) where manometric uncertainties are greater than at 20° C. the temperature finally adopted here. We therefore decided to report here in detail only experiments performed since May 30th. In these experiments all necessary requirements that we know of were complied with and therefore we feit justified in averaging the results as reported in the Summary and Conclusions. Earlier reports of various aspects of the work, with various collaborators, have appeared elsewhere"20' 21> --. The present work is based upon a background of a total of more than one hundred experiments of the type illustrated in the ten examples shortly to follow. Many minor aspects of the work, and miscel- laneous control experiments, have not been detailed, but brief mention may be made of some as follows: (1) The measured red light beam (. \J) when first filtered through the actinometric Solution produced no photosynthetic action. (2) The high photosynthetic efficiency was not decreased in vessels containing Pd catalyst in the side-arm to remove IT possibly formed. Mass spectrographic analysis of the vessel gas phase at the end of a prolonged experiment (without Pd in side-arm) indicated no significant occurence of Hj or other unusual gases (oxides of nitrogen, etc.) (3) The photosynthetic yield in bicarbonate medium with 5% CO: in air, at pH ca. 7—7.5, was less {ca. 8 quanta/O-i) than in culture medium at pH 5. (4) In an experiment carried out with the cells washed and taken up in distilled water instead of culture medium, but with 5% CO2 in air as usual (pH 5), the photosynthetic efficiency remained high, indicating that low pH rather than sah composition is the more important prerequisite for high efficiency. (5) For any period that an illuminated manometer was not shaken, a considerable fraction of the photosynthetic activity might be lost; this was tested for stationary periods of 30 sec. and more. Thus, a vessel alternately shaken and halted every 30 sec. (or every 1, 2, or 5 min.) might give during a total elapsed time of 10 min. only about 60 — 70% of the pressure change shown upon 10 min. continuous shaking; it was not practic- able to use periods much shorter than 30 sec, but in this connection rotating sector intermittency experiments are projected. The letter Symbols used in the following description of the experiments signify : J Intensity of the compensating light absorbed per minute in the cell Suspension. J had to be kept constant during an experiment, but was not measured. AJ Intensity of the added measured red light, incident and absorbed per minute in the cell Suspension, measured actinometrically and expressed as cu. mm. Oo/min. hj Millimeters of observed pressure change in t minutes in vessel I, when J < * is absorbed by the cell Suspension. hJ+Aj Millimeters of observed pressure change in t minutes in vessel I, when (J — . 1 J) X t is absorbed by the cell Suspension. H hJ+Aj + hj. h'j, A'j+jj, and H' refer, correspondingly, to vessel IL 02 n simple vessel constants (mm.2) for vessel I «co-2 0-2 simple vessel constants (mm.2) for vessel II k CO2 ao, =-- 0.03 flco-2 = 0.87. yÖ2 Cubic mm. of O2 produced by the action of AJ X t in the cell Sus- pension. 118 The Maximum Efficiency of Photosynthesis j>co2 Cubic mm. of CO2 produced by the action of AJ x fin the cell Sus- pension. -r quantum requirement per molecule O2 produced \~pt~\ yo2 and jyco2 were computed by use of Eqs. 10 and 11, JJ by use of Eq. 13, and^by use of Eq. 14. In all experiments the temperature of the thermostat was 20° C. and the spectral region of the added red light of the intensity IJwas 630-660 m//. . IJshould usualla not exceed 6 cu. mm. 02/min. (0.27 microeinsteins/min.) under our prevailing conditions. Experiment 1 May 30, 1949 Acid culture medium. 270 cu. mm. of cells in each vessel. 5% CO2 in air. 47 = 5-4 Vessel No. 5 Vessel No. 3 v = 13.913 vf = 7.00 v = 17.993 vf = 7.00 k\H = 0.665 &'co2 = 1-253 ko2 = 1.046 &C02 = 1.634 mm. mm 10'dark— 10.5 10' AJ + 0.5 10'dark — 2.0 10' AJ r 3.0 10'dark 10.0 10' AJ 0 10' dark — 3.5 10' AJ + 2.0 10'dark 9.0 10' AJ - 1.5 10' dark — 2.5 10' AJ + 3.5 10' dark 8.5 10' \J 0 10' dark - 2.5 10' AJ + 3.5 10'dark 9.0 10' AJ + 1 10'dark— 0 10' AJ + 3.0 10'dark— 8.0 10' AJ + 1 60' \J + 4.0 10' dark — 1.0 60'dark— 11.5 10' AJ + 5.0 60' dark — 55.0 60' AJ + 20.0 60' H' + 59 mm. 60' H + 31.5 mm, yo2 -r 70.4 cu. yco2 — 56-° cu mm. mm. l J y = — 0.8 1 AJ x 60 0 ~ 70.4 = 4.6 AJ = 5.4 No. 5 Respiration over-compensated No. 3 Respiration over-compensated 5'jM 5.0 5'C7+ 1.7) + 11.5 5'J^ 6.5 5' (J + AJ) + 9.0 5'J^ 6.5 5' (JA- 4»+ 9.5 57J 6.5 5' (J + JJ) + 10.0 5'7 + 6.5 5' (JA- AJ)+ 9.5 5'J^ 7.0 5' (J + JJ) + 8.5 574 5.5 5'C7+ 1J)+ 13.0 574 7.0 3ÖT5 5' (J + AJ) + 15.0 25' (J + AJ) + 58.5 25'J + 15'J-f 20.0 15' {J + AJ) + 27.5 25' H' + 28.0 mm. 25' H + 12.5 mm. yoz + 46.3 cu. mm. _yco2 — 47.6 cu. mm. — 1.03 0 AJ x 25 46.3 = 2.9 The Maximum Efficiency of Photosynthesis 119 AJ = 5.4 No. 5 Respiration more over-compensated No. 3 Respiration more over-compensated 5'Jr 5'J-f 5'J^ 5'.?4 18.5 18.0 16.5 17.5 17.0 5' (J + AJ) H 22 5' (J + JJ) + 22.5 5' (J + JJ) + 22.0 5' (J + AJ) H 20.5 5' (J + JJ) ; 23.0 5'J -:- 5'JM 14 14 12.5 14.0 11.5 12.0 5' <J + A3) 5'(J - -jj) + 5' (3 25' jf + 87.5 30 25' (J + JJO H' + 27 mm. JVo2 .VC02 = 110 30' J 78 30' (3 5' (J + JJ) + 1J) + 15.0 16.5 16.5 14.0 15.0 14.5 A3) + 91.5 30' H + 13.5 mm. + 36.3 cu. mm. \ 32.6 cu. mm. — 0.9 1 /JJ x 30 0 36.3 = 4.5 Total duration of the experiment more than 7 hr. The entire experiment was performed with the same cell Suspension. The result is that the quantum requirement is the same below and well above the compensation point, within the experimental error. Experiment 2 June 1, 1949 Comparison of the quantum requirements in acid culture medium, pH 4.9. and 0.1 AI carbonate buffer (15 vol. 0.1 M K2CO3, 85 vol. 0.1 M NaHCOs) pH 9.2. Aliquots of the same cell Suspension. Two hundred cu. mm. of cells in each vessel. Gas space in the two vessels with culture medium, 5% CO2 in air; in the vessel with carbonate buffer, air. The entire experiment with the same cell suspensions in the sequence reported below. 1 3 = 5.4 for all experiments, except the last, where A3 was 2.75. Vessel Nc . 7 (pH 9.2) 7 ml. carbonate buffer v = 13.824 vf = 7.00 ko2 = 0.657 Respiration compensated 5' 3 0 15'C7+ 430+ 11.5 15' .7 0 30' (J + A3) + 23 mm. . 30' 3 — 0.5 mm. 15' (3r A3) + H.5 30' H + 23.5 mm. 10' 3 0.5 j 3,02 = 23.5 x 0.657 = 15.4 cu. mm. 1 A* x 30 - 10.5 0 15.4 No. 5 (pH 5) No. 3 (pH 5) v = 13.913 vF = 7.00 v == 17.993 v = 7.00 k'o2 = 0.665 fe'coa == 1-253 ko2 = 1.046 &co2 = 1-634 15' 3+ 15.5 15' (.7 + A3) + 29.5 lö'^ll 15' {3 + A3) + 17 15' 3+ 17.5 15' (3 + A3) + 29.0 15' 3 + 10.5 15' <J + A3) + 16 30' J + 33.0 30' (J + zlj) + 58.5 30'^+ 21.5 30' (.? H J?) + 33 30' H' + 25.5 30' H + 11.5 120 The Maximum Efflciency of Photosynthesis y02 + 41.3 cu. mm. I _ 1-04 ycoz — 43.0 cu. mm. J 1 0 AJ x 30 41.3 = 3.9 No. 7 (pH 9. 2) Respiration not compensated Carbonate buffer ko2 = 0.657 10' 10' 10' 10' 10' 20' dark - AJ - dark AJ - dark dark — 33.5 — 23.5 — 30.5 — 22.5 — 30.0 — 60.5 20' 20' AJ dark — 46.0 62.7 20' H 16.7 yo2 = 16.7 X 0.657 = 11.0 cm. 1_ AJ X 20 0~ 11 = 9.8 No. 5 (pH 5) No. 3 (pH 5) k'o2 = 0.665 &'C02 = 1.253 ko2 = 1-046 &co2 = 1-634 10' dark— 12 10' dark— 13 10' AJ 10' AJ- 10' 47- 30' Jj- -5.0 -4.5 -4.0 - 13,5 10' dark— 4.0 10' dark— 5.0 10' dark— 5.0 30' dark— 14 10' 47— 1.5 10' JJ— 1.5 20' dark— 25 30' dark— 37.6 20' AJ— 3.0 30' 47— 4.5 30' H' + 24.1 30' H+ 9.5 yo2 + 45.6 cu. mm. I _ 1#18 yco2 — 53.0 cu. mm. J ' 1= 47_x_30_=36 <P 45.6 No. 7 (pH 9.2) ko2 = 0.657 AJ= 2.75 10' AJ —24 10' dark— 28 30' AJ -71.5 10' AJ — 24.5 30' dark— 82.5 10' dark— 27.0 10' AJ — 23.0 30' H 11.0 yo2 = 11 X 0.657 = 7.2 cu. mm. 1_ AJ y 30 82.5 _ 0 ~ 7.2 7.2 The Maximum Efficiency of Photosynthesis 121 The duration of the experiment was about 8 hr. No notable decrease of the efficiency was ob- served. In culture medium at pH 5 the quantum requirement was the same below and above the compensation point and was on the average 3.75. In carbonate buffer at pH 9.2 the quantum requirement was the same below and at the compen- sation point, and 10.6 as average. Thus, the quantum requirement for aliquots of the same cell Suspension was nearly 3 times greater in carbonate buffer than in culture medium. Experiment 3 June 6, 1949 Culture medium, pH 5. Gas phase 5% CO-2 in air. 290 cu. mm. cells in each vessel. AJ = 6.05 No. 5 % No. 3 v = 13.913 vf = 7.00 v = 17.993 vF = 7.00 k'o2 = °.665 *'co2 == 1-253 k0o = 1.046 kCo2 = 1-634 10' dark — 25 10' JJ — 14 10' dark- 8.5 10' JJ- 5.5 10' dark — 22 10' JJ — 13 10' dark — 10.5 10' AJ— 5.0 10' dark — 21.5 10' AJ — 11.5 10' dark - 9.0 30' dark — 28.0 10' AJ— 3.0 30' dark — 68.5 30' JJ— 38.5 30' JJ— 13.5 30' H' 30.C 30' H H - 14.5 yo2 + 43.4 cu. mm. 1 __ g? yco2 — 42.2 cu. mm. J ' 1 JJ x 30 — = — =42 0 43.4 An aliquot of the same cell Suspension was placed in a rectangular vessel with 2 side-arms, to which were added 0.2 ml. of 1 normal NaOH and filter paper. Culture medium pH 5, gas space, air. v = 18.477; vF = 7.40; kG.2 = 1.062. 290 cu. mm. of cells. 60'dark— 183 60' JJ— 163 60' H + 20 mm. yo2 = 20 x 1.06 = 21 cu. mm. 1 JJ x 60 6.05 x 60 0 21 21 = 17.3 This was one of our first experiments to indicate that light does not act on respiration at in- tensities otherwise yielding high efficiencies with adequate CO-j pressure. Later experiments showed that with better CO-2 removal by alkali still less light action was obtained when the filter paper was replaced with glass beads. 122 The Maximum Efficiency of Photosynthesis Experiment 4 June 10, 1949 Culture medium, pH 5. Gas phase 5°0 CO-2 in air. 300 cu. mm. of cells in each vessel. AJ = 5.3 No. 5 v = 17.993 vf = 7.00 £o2 = 1-046 &co2 1-634 10' dark 9.0 10' AJ — 5.5 20' dark — 17.0 20' AJ — 10.5 30' dark — 22.5 30' AJ — 13.0 60' dark — 48.5 60' AJ — 29.0 60' H - 19.5 } y = - 1.23 = 2.8 Besides the quantum requirement of 3, this experiment shows that the "Urning" has no do- minant influence on the quantum requirement. For the pressure changes in both vessels were for different time periods : No. 5: H' = (h'j - AJ - h'j) No. 3: H = (Aj -- AJ + h3) 10' - 8 mm. 10' - 3.5 mm. 20' : 19 mm. 20' -6.5 mm. 30' -26.5 mm. 30' 4- 9.5 mm. The above values are perfectly within the limits of the possible errors. Experiment 5 June 13, 1949 Culture medium, pH 5. Gas phase 5% CO2 in air. 300 mm.3 of cells in each vessel. AJ = 5.3 No. 3 v = 13.913 vf = 7.00 k'o2 = 0.665 fe'co2 1-253 10' dark 19.5 10' IJ - 11.5 20 dark - 45.0 20' \J — 26.0 30' dark - 59.0 30' AJ — 32.5 60' dark — 123.5 60' AJ — 69.0 60' H' -} 54.5 yoz = - 114 cu. mm. JVCO2 = - - 140 cu. mm. 1 AJ X 60 318 0 114 114 No. 5 No. 3 v = 13.913 vF = 7.00 v = 17.993 VF = 7.00 k'o2 == 0.665 Ä'co2 == 1-253 ko2 = 1.046 &co2 =- 1-634 10' dark - 26.0 10' AJ— 15.0 10' dark — 10.5 10' AJ— 7.0 10' dark- 27.5 10' AJ— 14.5 10' dark— 10.5 10' AJ- 7.5 10' dark- 26.5 10' \J - 15.5 10' dark— 11.5 10' AJ— 6.5 10' dark- 22.0 10' AJ— 10.5* 10' dark — 10.5 10' AJ— 6.5 10' dark 21.0 10' AJ— 15.5 10' dark— 11.0 10' AJ - 7.0 50' dark — 123.0 50' AJ— 71.0 50' dark — 54.0 50' AJ— 34.5 50' H' 52 50' H 19.5 3>o2 = - 104 cu. mm. 1 _ jyc'02 = — 130 cu. mm. | ' 1^47x50 0 104 From the dark values in No. 5 and No. 3 the respiration was calculated : 50' dark H' = - 123 mm. H = -- 54 mm. .rn, = — 202 cu. mm. 1 , , _ 1 000 y = - 1.15 XCO2 "" 232 cu. mm. | ' 242 and X(i, for 60' - - 242 cu. mm. or - - • 100 = 81",, of the cell volume/hr. 300 The Maximum Efficiency of Photosynthesis 123 This experiment is remarkable for the low average figure of 2.5 obtained in a very good experiment. The only deviating reading among 20 readings is the one marked by*. Experiment 6 June 14, 1949 Culture medium, pH 5. Gas phase 5% CO? in air. 280 cu. mm. of cells in each vessel. Both vessels continuously illuminated with white light for 27 hr. AJ =-- 5.4 No. 5 No. 3 v == 13.913 k'o2 = 0.665 vf = 7.00 £'co2 = 1.253 v = 17.993 &o2 1.046 W = 7.00 kCoz = 1-634 I. Beginning of measurement June 14, 1 :30 p. m. 10' J- - 0.5 10' (J+Af) + 8.0 10'J- - 0.5 30'^- JJO- 22.5 10' J 1.5 30'(J-JJ) - 26.0 10' J 0 40' J - 0.5 70 (J+AJ) + 56.5 70' J- 0.9 70' H' - 55.6 10' J + 2.0 io'C7 + 47) + 4.5 10' J - 0.5 30'C7+ A3) + 14.0 10' 3 + 1.0 30' ü- J7) + 14.5 10' 3 + 1.5 io' 3 - l.o 50' 3 - 6.0 70'(.7-f 47) + 33 70' 3 + 8.4 70' ff + 24.6 jyo2 + 91 cu. mm. | ycoz — 103 cu. mm. j 1.13 \ A3 x 70 0 " 91 4.2 II. Start of 2nd measurement June 15, 9:40 a. m. No. 5 No. 3 10' .7+2.5 10'(.7-l A3) 4- 11 10' 7 -2.5 10'J+3.0 10' (.74 JJO + 12 10' 3^ 2.0 10' 07+47) + 7.0 10' (.7+47) + 6.5 20' ^ ^5.5 20' (J- JJ) + 23 20' J + 4.5 20'C7+47) + 13.5 20' ff' - 17.5 20' ff + 9.0 3»o2 + 22.4 cu. mm. ] on o y = — 0.9 jyco2 — 20.2 cu. mm. | ' 1 AJ x 20 d g 0 22.4 124 The Maximum Efficiency of Photosynthesis III. Start of 3rd measurement June 15, 4:50 p. m. The cells were washed in fresh culture medium because in the old medium the efficiency of the light appeared to decrease. No. 5 No. 3 10' dark — 17.5 10' dark— 16.0 10' dark — 16.5 10' dark— 15.5 40' dark — 65.5 30' dark — 49.2 10' AJ — 10.0 10'. J7- 8.5 10' AJ- 7.5 30' AJ — 26.0 10' dark — 8.5 10' AJ- 6.0 10' dark - 8.5 10' AJ- 5.0 10' dark — 8.5 10' AJ- 6.5 10' AJ- 5.5 30' dark — 25.5 40' AJ— 23.0 30' AJ— 17.2 30' H' + 23.2 30' H + 8.3 yo2 = - 48.5 cu. mm. yco2 — — 62 cu. mm. I A3 x 30 0 ~ 48.5 = 1.28 3.4 The respiration at the beginning of the experiment was 82",, of the cell volume Oo/hr., and at the end of the experiment 45",, of the cell volume O-2/hr. The washing of the cells in fresh culture medium had no influence on the respiration. The experiment shows that the efficiency of light remained nearly constant when the cells were continuously illuminated with white light for more than 20 hr. Experiment 7 June 16, 1949 5% CO-2 in air. The cells were washed with KNOs-free culture medium (pH 5) and the efficiency was measured in KN03-free culture medium. Later KNO3 was added and the efficiency was again measured. 300 cu. mm. of cells in each vessel. AJ = 5.4 No. 5 No. 3 v = 13.913 k'oz = 0.665 vy = 7.00 fe'co2 = 1.253 v = 17.993 ko2 = 1.046 vf = 7.00 fcco2 = 1-634 without KNO3 10' dark — 26 10' dark-- 23 10' dark — 23 10' dark — 23 10' AJ— 17 10' \J— 15 10' \J— 14 10' AJ— 15 40' AJ— 61 10' dark -- 12 10' dark-- 10 10' dark— 11 10' dark— 11 40' dark — 44 10' AJ- 7 10' AJ- 7 10' AJ - 7 10' AJ- 7 40' dark — 95 40' 47—28 40' H' i 34 40' H - - 16 yo2 = + 51.6 cu. yco-, = — 53.7 cu mm. > v = — 1.04 . mm. | ' 1 AJ x 40 0 51.6 4.2 The Maximum Efficiency of Photosynthesis 125 Then 17.5 mg. KNO3 was added to each vessel, to give 2.5 g. KNO3/I. No. 5 No. 3 10' dark 17 10' 17—9 10' dark 8 10' 1.7 5 10' dark - 15 10' AJ- 9 10' dark 7 10' 47- 5 10' dark dark - 16.5 - 48.5 10' AJ- 8.5 10' dark 7.5 10' 30' 47- 47- 5.5 30' 30' AJ— 26.5 30' dark - 22.5 15.5 30' H' \- 22 yoz = - 50 cu. mm. j yco% = -- 66.7 cu. mm. J ^ 1 = AJ x 30 = 0 50 30' H -! - 1.33 7.0 This experiment shows that there is no striking effect of KNO3 in the medium on the photo- synthetic efficiency. In very prolonged experiments, of course, removal of a necessary constituent from the culture medium must infiuence the efficiency. Experiment 8 July 20, 1949, Woods Hole 5% CO2 in air. Culture medium, pH 5. 430 cu. mm. of cells in each vessel. AJ == 5.65 No. 5 No. 3 v = 13.913 k'o2 = 0.665 vf = 7.00 v = 17.993 &'co2 = 1-253 kQ, = 1.046 vF = 7.00 kCo2 = 1-634 10' J + 29.5 10' J + 26.0 Compensated with white light from above. 10' (J + AJ) + 40.5 10' J+ 19.5 10' (J+AJ) + 26 10'(J+JJ) + 39.0 10' J+ 20.0 10' (J 4 AJ) + 24.5 20' J + 55.5 20'(J+ JJ) + 79.5 20' J + 39.5 20' (J+AJ)+ 50.5 20' //' + 24 20' H + 11 vo? = + 37.2 cu. mm. 1 ycoo = — 41.2 cu. mm. ] ' 1.10 1 _ AJ x 20 _ 3Q 0 37.2 Continued, but compensated mainly from below with light from an incandescent lamp filtered through a red glass which transmitted wavelengths longer than 560 mit. No. 5 No.3 5' J 4- 18 5/C7 + 47) + 22.5 5' J + 16.5 5' (jf + Jjf) + 25.0 5'J + 16.0 5'(J + ZlJ) + 20.0 15' J + 50.5 15' C7 -r JJ) + 67.5 20' H' + 22.7 10' J + 19 10' J -!- 16 10' (J + AJ) + 24 10' (J + AJ) + 22 20' J + 35 20' 20'C7+47) -1- 46 .7 + 11 ^02 = + 32.3 cu. mm. ) _ _ Q2 .V0C2 = — 33.0 cu. mm. J ^ 1 = iöLx_20_=35 0 32.3 126 The Maximum Efficiency of Photosynthesis Finally all light was turned off: No. 5 No. 3 10' dark— 11 10' dark — 6 10' xo2 = — 12-4 cu- mm- 60' xo2 = -~ 74 cu- mm-' 74 that is, - — ■ 100 = 18% of the cell volume/hr. 420 At (J - AJ) in vessel 5, - 45 mm. were produced in 10'. The light action was therefore 45 + 12 = 57 mm. in 10'. Assuming a value of y = 1.0, this meansjo2 = 57 !-42 6 == 485 cu- mm- O-2/hr., or 485/74 = 6.5 times respiration. This experiment shows that 1) the efficiency of the added red light was essen- tially the same whether the respiration was overcompensated from above or from below, with white light or with red-yellow light; 2) a quantum requirement of 3.5 was obtained when respiration was 6.5 times compensated with a red-yellow light and a value of 3.0 when respiration was similarly overcompensated with white light. Experiment 9 August 5, 1949, Woods Hole Culture medium, pH 5. In vessels 5 and 3, gas phase 5°„ C02 in air. In vessel 34 air, in the two sidearms NaOH. In each aessel 230 cu. mm. of cells, suspended in 7 ml. culture medium. AJ = 5.7 No. 5 No. 3 v = 13.913 vF == 7.00 v =- 17.993 vF 7.00 k'o2 == 0.665 £'co2 == 1-253 kG, =- 1-046 kCo, 1-634 Respiration not compensated 20' dark — 27.5 20' AJ — 7 20' dark — 13 20' AJ — 2 20' H' + 20.5 mm. H + 11 mm. yo2= ; 23.6 cu. mm. | „ = _ 0 82 yco-2 = — 1^-3 cu. mm. | ' 1 AJ X 20 0 23.6 4.8 Respiration overcompensated No. 5 No. 3 20' J+ 57.5 20'(.7+ 47) + 76 20' J - 39 20' (Jf + AJ) -f 48 20' H' 4- 18.5 20' H + 9 yo2 = - 26 cu. mm. ) j ^C02 = ~26 cu. mm. ) 1 _ *J X 20 4 4 0 26 No 3 V = 18.87 vf == 7.40 10' dark — 22 10' AJ -21 10' dark— 18 ■ r 10' AJ - 18 1 AJ X t <& vo2 The Maximum Efficiency of Photosynthesis 127 ko, = 1.09 no light action > 100 But when a 100-w. incandescent lamp was turned on at a distance of 12 in. from vessel 34, the respiration was compensated by the white light. This experiment shows, that at adequately low CO-j pressure there was no light action by JJ. Acknowledgments We wish to acknowledge with deep appreciation the facilities and laboratory accommodations for research and class demonstrations provided during the later phases of this work by Professor E. S. Guzman-Barron and by Dr. Charles Packard, Director, Marine Biological Laboratory, Woods Hole.We wish to thank Dr. Ernest Kun and Messrs. Jack Dureil, Richard Klein, Burlyn Michel, and Martin Schwanz of the Physiology Class of this Laboratory for valued aid. Mrs. Lois B. Macri, Mrs. Clara F. Smith, and C. R. Newhouser, of the National Cancer Institute, provided extensive technical assistance. Summary and Conclusions Experiment No. 2 shows that the quantum requirement in carbonate buffer at pH 9 was 2-3 times the quantum requirement in acid culture medium saturated with 5% CO-2 in air (pH 5). This result was obtained for aliquots of the same cell Sus- pension. It invalidates many efficiency experiments of the past, where for 10 years the conventional medium for quantum requirement determinations has been car- bonate buffer, and the view has been widely adhered to that the minimum quantum requirement could be realized in carbonate buffer. But in no experiment in carbo- nate buffer at pH 9 have we observed lower quantum values than 8, the average being about 10. Experiment No. 9 shows that in acid culture medium the quantum requirement is different according as the medium is saturated with 5% C02 or freed as nearly as possible of CO>. When the culture medium was largely freed of CO^, no 02 was produced by a light intensity that in the presence of 5% CO2 was highly efficient. In all experiments carried out by the prescribed procedure in acid culture me- dium at pH 5, and saturated with 5% CO> in air, low quantum requirements were observed.The results of Expts. Nos. 1 to 9 are summarized in the following table in sequence. The asterisks mean that the respiration was overcompensated. In the doubly asterisked experiments the respiration was more than 6-fold compensated. It may be seen from Table I that in acid culture medium saturated with 5",, CO2 in air the quantum requirements per molecule of O2 produced were between 2.5 and 4.8, on the average near to 4. The reality of 3 in several instances cannot be excluded. Four-quanta in the red at 660 mu mean 65" „ efficiency and 3-quanta would mean 87% efficiency in the transformation of light to chemical energy. 128 The Maximum Efficiency of Photosynthesis The observed assimilatory quotients, y = CO2 absorbed/O-2 produced, ranged between — 0.8 and — 1.33, with an average of — 1.06. The deviation from — 1.0 was in the opposite direction from that claimed by investigators who have re- ported outbursts of CO 2. in light4»5. On the contrary, on the average a little more CO2 was absorbed in light than O2 was produced. Thus, one of the two main loopholes that have been used to evade the high efficiency in photosynthesis is now closed. The other important loop- hoole — the participation of respiration in efficient photosynthesis in whatsoever a manner11 — is now closed too, since the same high efficiencies have been obtained at more than 6-fold compensated respi- ration as at uncompensated respiration, where light has also been shown directly to be without notable infiuence.* The fact must thus be envisaged that in a perfect nature photosynthesis is per- Table 1 fect tOO. 1 0 hv o2 4.6 2.9* 4.5* 3.9* 3.6 4.2 2.8 2.5 4.2* 4.8* 3.4 4.2 3.2 3.0** 3.5** 4.8 4.4 Average 3.7 V co2\ Oo / —0.80 —1.03* -0.90* -1.04* -1.18 —0.97 -1.23 -1.25 -1.13 -0.90* -1.28 -1.04 -1.33 -1.10** -1.02** -0.82 -1.00* -1.06 References 1 Warburg, Otto, Reprinted in Katalytische Wirkun- gen der lebendigen Substanz. Julius Springer, Berlin, 1928. 2 Warburg, Emil, Photochemie. Handbuch der Experi- mentalphysik Vol. 18, p. 619. Leipzig, 1928. 3 Manning, W. M., Stauffer, J. F., Duggar, B. M., and Daniels, F., J. Am. Chem. Soc. 60 (1938), 266. 4 Emerson, R., and Lewis, C M., Am. J. Botany 26 (1939), 808. 5 Ibid. 28 (1941), 789. 6 Warburg, Otto (trans.) Am. J. Botany 35 (1948), 194 (cf. Ref. 10, Chap. XXI). 7 Stoffwechsel der Tumoren. Julius Springer, Berlin, 1926. 8 Franck, J., and Loomis, W. E., Photosynthesis in Plants. The Iowa State College Press, Arnes, Iowa 1949. 9 Spoehr, H. A., and Miiner, H. A., Plant Physiol. 24 (1949), 120. 10 Warburg, O., Schwermetalle als Wirkungsgruppen von Fermenten, Werner Saenger, Berlin, 1948. Trans- lation. Clarendon Press, Oxford, 1949. 11 Burk, D., and Lineweaver, H., Nature 135 (1935), 621. 12 Cold Spring Harbor Symposia Quant. Biol. 3 (1935), 165. 13 Warburg, O., and Schocken, V., Arch. Biochem. 21 (1949), 363. 14 Franck, J., Arch. Biochem. 23 (1949), 297. 15 Noddack, W., Z. physik. Chem. 185 A (1939), 241. 16 Noddack, W., and Eichhoff, H., Z. physik. Chem. 185A (1939), 222. 17 Eichhoff, H., Biochem. Z. 303 (1939), 112. 18 Noddack, W., and Kopp, C, Z. physik. Chem. 187A (1940), 79. 19 Kopp, C, Biochem. Z. 310 (1941), 191. 20 Burk, D., Hendricks, S., Korzenovsky, M., Schok- ken, V., and Warburg, O., Science 110 (1949), 225. 21 Warburg, O., Burk, D., Schocken, V., Korzenovsky, M., and Hendricks, S., Arch. Biochem. 23 (1949), 330. 22 Warburg, O., Burk, D., Schocken, V., and Hen- dricks, S., Biochimica et Biophysica Acta, Meyerhof Festschrift Volume 4, pp. 335—346 (1950). * Zusatz 1961. Ein ganz anderer Zusammenhang zwischen Lichtwirkung und Atmung ist 1950 entdeckt worden (vergl. Arbeit 11 dieses Buchs). 9 Extensions of photosynthetic experimentation* by Otto Warburg, Dean Burk and Arthur L. Schade Kaiser- Wilhelm- Institut für Zellphysiologie, Berlin-Dahlem Chlorella pyrenoidosa was cultivated as previously described (Warburg & Burk, 1950) in acid culture medium prepared with water taken from a deep well. The culture bottles filled with 200 c.c. medium were inoculated with 100 cmm. cells and placed at a distance of 25 cm. from a 200 watt incandescent lamp in a water bath at 25° C. and aerated with 5% carbon dioxide in air. After 24 hr., when the cells had multiplied 4-fold, they were used for the experiments. No settling of cells occurred during the culturing. I. Centrifuging The cells were centrifuged in thin layers in broad cups for so short a time that by gentle shaking they could be resuspended in a few seconds. The use of strong, angle centrifuging, such as we had at our disposal at Urbana two years ago, is to be avoided. Heavily centrifuged cells are damaged, and partly destroyed by the process of resuspending, especially when mechanical agents are employed. II. Use of Ammonia The photosynthetic efficiency of the cells after harvest was determined in culture medium, the nitrate of which was replaced by ammonia at 1/10 the concentration of the nitrate (0.15 g. NH4CI/I.). In such Solutions the assimilatory quotient of the young cultures employed was always near 1 (cf. Myers, 1949). In experiments of long duration the pH was not shifted to the alkaline side as could happen with nitrate as a source of nitrogen, so that there was no danger of carbon dioxide retention being developed. When the pH at the beginning of the experiment was 4.8, it was about 3.5 after 7 hr. of illumination. No influence of this acidification on the efficiency was observed. It was a further advantage of using ammonia that possible discussions as to whether the oxygen of the nitrate might have to be con- sidered in the computation of the energy transformation were eliminated. III. Optical Arrangement The light source was a 200 watt high-pressure mercury lamp (Osram). A condenser of the aperture 1 : 1 provided a parallel light beam from which the green line 546 * Aus Symposia of the society for experimental biology Number V, Carbon Dioxide Fixation and Photosynthesis. 1951. Zusatz 1961. Der methodische Fortschritt dieser Arbeit ist im wesentlichen die Ausnutzung der chemischen Aktinometrie zur Messung der Lichtabsorption in dem „trüben Medium" der Zellsuspensionen, sowie die Teilung des Lichtstrahls mit 4 total reflektierenden Prismen. 9 Warburg, Zellphysiologie 130 Extensions of photosynthetic experimentation m/i was isolated by the following filters ; 5 cm. water, 2 cm. 5% C11SO4. 10H2O, 1 cm. tartrazin (20 mg./lOO c.c. H2O), and 1 cm. Didym-plate (Schott-Jena). The intensity of this green light beam was about 15 //mol. quanta (330 mm.3) per min., or one hundred times that first employed by us at Urbana and twenty-five to fifty times that used in Bethesda. The green light beam was split by four totally reflecting prisms into two beams of equal intensities. These were measured by a bolometer (Lummer-Kurlbaum) of 9 cm2, area, standardized against an American National Bureau of Standards lamp obtained through the courtesy of Dr Curtis J. Humphreys, Chief of the Radiometry Section. The manometric actinometer was standardized against the bolometer. IV. The Two-Vessel Method The divided light beam effected an improvement in the employment of the two- vessel method since the two vessels could be illuminated and darkened simultane- ously. The two vessels, each with its equal-sized thermobarometer, were fastened on two opposite sides of the thermostat. The two branches of the divided light beam entered the thermostat in horizontal directions and were reflected by two 45° mirrors into the two vessels. A second improvement that made efficiency determinations possible at high light intensities was the employment of increased motion of the cell Suspension in vessels of increased volume. In our very earliest experiments it was sometimes observed that in the smaller of the two vessels then employed (v = - 13 c.c, i)F = 7) the motion of the liquid was inhibited by striking the upper wall, whereas in the larger vessel (v = 20 c.c, vf = 7) the liquid could swing freely, the conse- quence being that the motion of the cell suspensions in the two vessels was clearly different, and stronger in the greater vessel. We have now used as the smaller vessel the volumes v — 20 c.c. and vf = 7, and as the larger vessel the volumes v = 30 c.c. and vf = 7. The bottom area of both these vessels was again about 7.5 cm.2. The vessels were shaken by horizontal motion at the increased rate of 220 per min., and when the helmets (male parts) of the attaching manometers were hollow, no splashing in the manometer capillaries occurred no matter how rapid the shaking. No foaming occurred even in experiments of 7 hr. duration. In these two vessels of 20 and 30 c.c. volume, the 7 c.c. of cell Suspension could swing freely and showed during the motion of the vessels the same geometrical outline, that is, a downwardly concave surface with a height lowest in the middle that was not less than one-half the height at the ends of the vessels. These remarks will emphasize that the two-vessel method applied to bio- photochemistry needs special considerations not demanded by routine manometry, especially when high light intensities and light actions are involved. Not only is equal physical equilibration in the two vessels demanded, but also equal intermit- tency of illumination. The unusual y (CO2/O2) values of photosynthesis reported in the literature* are in our opinion caused in part by inadequate motion of the smaller vessel. In fact, such y values can often be normalized by increasing the shaking rate. * Zusatz 1961. By R. Emerson. Extensions of photosynthetic experimentation 131 V. Adjustment of the Compensating Light By the principle of the light increment (Warburg & Burk, 1950) the technical and theoretical difficulties caused by respiration may be overcome. Respiration is overcompensated by unmeasured white light and photosynthetic yield measured only for an increment of measured light. When this increment is small in comparison with the compensating light, the general conditions of the cells are virtually not altered by the addition of the increment, as is required when photosynthesis is computed by our equations. Since it was found in our earlier experiments (Warburg & Burk, 1950) that a given light increment, added to dark or compensated or considerably overcompen- sated cells, proved to be equally efficient, it is unnecessary to adjust the compen- sating light in such a way that in both vessels exactly the same amount of compen- sating light is absorbed. But if such an exact adjustment is desired, the following method has been found to be useful. Cells are suspended in carbonate mixture and equal volumes placed into the two vessels used for the two-vessel method. A 100- watt incandescent lamp is placed above the thermostat and shifted until photo- synthesis is found to be equal in the two vessels. Because of the scattering of the light by the cells, this method is to be preferred to an adjustment by means of two corresponding chemical actinometers. VI. Long Experiments It has been confirmed that the efficiency of photosynthesis remains constant for longer periods of time when respiration is overcompensated by diffuse white light in such a manner that all cells are constantly illuminated. Such a result may be ex- pected, since the conditions are then those of the culturing; a chemical or physical explanation is lacking. VII. Use of Carbonate Media Although it is now widely considered that maximum efficiencies cannot be obtained in carbonate Solutions, such Solutions may be useful in many respects as an ex- perimental tool. Equal parts of M/10 K2CO3 and M/10 NaHCC>3 may be mixed to yield a pH of about 10. The quantum requirement of our cells suspended in such a mixture was about 10. A first application of carbonate Solution has already been mentioned in Section IV. A second application may be made to check that the motion of both vessels in the two-vessel method is adequate. Equal amounts of cells, suspended in 7 c.c, carbonate mixture, are placed in each of the two vessels that are then shaken and illuminated as in the efficiency experiments in acid medium. When equal photo- synthesis is obtained in both vessels then one has an indication that not only physical equilibration but also light intermittency are equal in the two vessels for the special conditions of vessels, amounts of liquid and cells, and light intensity, etc., em- ployed. 132 Extensions of photosynthetic experimentation A third application may be made to transmission experiments. Increasing amounts of cells, say from 25 to 300 mm.3, are suspended in 7 c.c. carbonate mixture, and placed in turn into the same vessel and photosynthesis effected by a given beam of light determined. One thereby obtains a curve showing for each amount of cells the relative photosynthesis obtained up to the maximum that may be reached with X = 546 va.ii at 300 mm3, cells where light absorption is virtually complete. Then photosynthesis at any given cell concentration, divided by the maximum photo- synthesis, represents the fraction a of the absorbed light, or (1 — a) is the trans- mission. It is necessary in applying this method that the light intensity be so low at all cell concentrations that photosynthesis is proportional to light intensity. Note. When cells suspended in carbonate mixtures are used as described for com- parative actinometric purposes, it is important to know that in carbonate there is an induction period of minutes until the light action is fully developed mano- metrically. The cause of this induction is chemical; it cannot be merely physical equilibration, because for the same shaking rates and same conditions there is no corresponding induction if the cells are suspended in acid culture medium. With cells in carbonate, therefore, transition periods of at least 5 min. have to be consi- dered, whereas with cells in acid culture medium this is not ordinarily necessary if the light intensity is not extreme. VIII. Actinometric Determination of Transmission Another method of deterrnining light transmission through cell suspensions may be based on the chemical actinometer. A small vessel, such as used for the two- Cell-suspension Actinometric liquid •Light beam Fig. 1. Actinometric vessel for measuring light transmission of. Chlorella cell Suspension, contained in inner separable compartment, under conditions of manometric shaking. vessel method, contains the cell Suspension. It is surrounded by a larger vessel that contains the actinometric liquid and is connected with a manometer for measur- ing oxygen consumption. Both vessels are quartz vessels, blown by Lempert, Extensions of photosynthetic experimentation 133 Berlin-Reinickendorf, (Fig. 1). The volume of the small vessel is about 20 c.c., that of the large vessel 120 c.c. 7 c.c. of cell Suspension are inserted into the small vessel through a small stopperable aperture (not illustrated), and 80 c.c. of actino- metric liquid are put into the big vessel. The small vessel is not connected to the large vessel but is held in place by rubber bands. The combined two vessels are shaken at a rate of 200 turns per min. A collimated light beam enters through the bottom of the small vessel. The fraction of the light not absorbed leaves the vessel only negligibly (less than 1%) in the back direction, but goes mainly through the upper wall and secondarily the side walls into the actinometric Chamber, where it is completely absorbed, producing oxygen con- sumption. Two measurements have to be made, first while the small vessel contains water, and second when it contains the cell Suspension. Let the first pressure change be (^)water and the second ( J/>)cens, then if <p = Ozjhv = 1, then the light transmission through the cell Suspension is (zJ/>)cells (AP) water There is the difficulty that 0 = ■- 1 only at low light intensities. At higher light intensities 0 declines. In consequence, the transmission has to be determined at light intensities of 1/15 itmoh quanta per min., as used in earlier calibration experiments (Warburg & Schocken, 1949). Experiments at higher light intensities, corrected by an intensity response curve, are not generally advisable, because of the difficulty of estimating the intensities at which the scattered light enters the actino- metric vessel. IX. Results With the various extensions of technique described here we have continued to confirm our previously reported results (Warburg & Burk, 1950). With 300 mm.3 of cells per vessel where absorption of the green mercury line is essentially com- plete, a quantum requirement of 4, with fluctuations between 3 and 5, per mole- cule of carbon dioxide consumed or oxygen produced, has been observed. Again, with low light intensities, no influence of timing on yield was noted. The yield re- mained the same whether the light increment was added and removed every 5 (or 10 or 15) min., or if the sequence was 1 hr. with increment and 5 (or 10 or 15) min. without increment, and so forth. Again, the assimilatory quotient and the respiratory quotient were either equal or different. Equality of these two quotients is immaterial, and to ask that they should be equal is to misunderstand the equa- tions of the two-vessel method. With 50 mm.3 cells per vessel, that is, about 6.5 mm.3 cells per sq.cm. of bottom area, about 50% of the wavelength 546 mit was transmitted by the cell Suspension in motion. To obtain the same or greater light action pressure changes, as obtained with 300 mm.3 of cells, higher light intensities were applied, so high that photo- 134 Extensions of photosynthetic experimentation synthesis often amounted to 30% of the value at light Saturation. Under such con- ditions the observed quantum yields were consistent with the minimum require- ment of 3 to 5 quanta at lower light intensities, and were a function of light in- crement intermittency1 and intensity. References 1 See Burk, D., and Warburg, O., Naturwissenschaften 37 (1950), 560, and Z. Naturforsch, (in the Press, 1951). Myers, J., Chap. 17 of Photosynthesis in Plants, by J. Franck and W. F. Loomis. Iowa: The Iowa State College Press (1949). Warburg, O., and Burk, D., Arch. Biochem. 25 (1950), 410. Warburg, O., and Schocken, V., Arch. Biochem. 21 (1949), 363. 10 1 -Quanten-Mechanismus und Energie-Kreisprozeß bei der Photosynthese* Von Dean Burk und Otto Warburg Belichtet man Chlorella intermittierend und monochromatisch mit hohen Licht- intensitäten, indem man je eine Hellminute und eine Dunkelminute aufeinander- folgen läßt, und mißt dabei die absorbierte Lichtenergie sowie den Gaswechsel der Algen, so finden wir nunmehr maximal eine „Quantenausbeute" von 1 in jeder Hellminute, d. h. 1 Mol absorbierter Lichtquanten bewirkt die Absorption von 1 Mol Kohlensäure und die Entwicklung von 0,8 bis 1 Mol Sauerstoff (y = COj 02 = — 1 bis — 1,25). In jeder Dunkelminute finden wir den umgekehrten Pro- zeß, Entwicklung von Kohlensäure und Absorption von Sauerstoff, auch hier y = CO2/O2 = —1,0 bis — 1,25. Dieser Verbrennungsprozeß ist nahezu proportional der Lichtintensität in der Hellperiode und erreicht in unsern Versuchen bis zu dem 12fachen der gewöhnlichen Atmung (12faches Volumen der Zellen an Sauer- stoffverbrauch je Stunde). Beide Prozesse, der durch das Licht angeregte Ver- brennungsprozeß und der im Licht hinzukommende umgekehrte Prozeß, sind gegenseitig voneinander abhängig; sie sind durch einen Kreisprozeß miteinander verbunden. Offenbar ist dieser Kreisprozeß die Lösung des Quantenproblems der Kohlen- säureassimilation. Wenn etwa 120000 cal für die Reduktion eines Mols CO> not- wendig sind, so liefert das Licht davon (im rot) 40000 cal und der Verbrennungs- prozeß 80000 cal. Dabei wird im Licht ein ganzes Mol C02 je Mol absorbierter Quanten gewonnen, aber 2 '3 dieses Gewinns werden in der Verbrennungsphase des Kreisprozesses wieder verbraucht, so daß in der Bilanz der Gewinn nur 1/3 Mol Kohlenstoff je Mol Quanten beträgt; d. h., daß 3 Mole Quanten absorbiert werden müssen, damit 1 Mol CO2 durch den vollständigen Kreisprozeß reduziert wird. Chemosynthese und Photosynthese wirken also bei der Assimilation der Kohlen- säure in den grünen Pflanzenzellen zusammen. Die Chemosynthese liefert die dem Lichtquant fehlende Energie, erhält aber, nachdem das Lichtquant gewirkt hat, ihren aufgewendeten Brennstoff von der Photosynthese wieder zurück. So erreicht die Natur, daß die energiearmen Quanten des sichtbaren Sonnenlichts eine photo- chemische Reaktion bewirken können, die das 3fache der Energie eines Licht- quantums erfordert. Die Versuchstechnik war eine weiterentwickelte 2-Gef äß-Methode : geteilter Lichtstrahl, hohe monochromatische Lichtintensität (z. B. 2 Mikromole Quanten je Minute in jedem der beiden Teile des Strahls), bolometrische Messung der Intensität, bezogen auf die Lichtstandardlampe des Bureau of Standards in Washington; wenig Zellen im Gefäß, Transmissionsmessung mit dem kürzlich beschriebenen Transmissions-Aktinometer1 ; und so schnelle Schüttelung der * Aus Die Naturwissenschaften 37 (1950): 560 136 1 -Quanten-Mechanismus und Energie-Kreisprozeß bei der Photosynthese Gefäße, daß keine physikalisch bedingten Übergangserscheinungen beim Wechsel hell — dunkel auftraten. Zur Untersuchung des Kreisprozesses ist der Wechsel hell — dunkel in 1-min- Perioden geeignet. Zur Messung des Nutzeffektes des Kreisprozesses ziehen wir den Wechsel von 2 Heil-Perioden verschiedener Lichtintensität vor, also die im vorigen Jahr eingeführte Methode des Lichtinkrements (z. B. 1-min-Wechsel von grün und grün der halben Intensität). Das Ergebnis war, unabhängig von der Wellen- länge, ein Quantenbedarf von 1 in der Photophase für blau (/ 436 m//), grün (/ 546 m/0 und rot (/ 644 mit). Jedoch muß hervorgehoben werden, daß der Quantenbedarf für die Bilanz der Kohlensäureassimilation nunmehr, nach der Entdeckung des Kreisprozesses, nicht mehr ganzzahlig zu sein braucht. Etwa 2,5 Quanten je Molekel Sauerstoff ist die thermodynamisch zulässige Grenze. Etwa 3 ist die Zahl, die wir am häu- figsten gefunden haben. Dies entspricht einer Ausnutzung der absorbierten Licht- energie von über 80 % im rot. Literatur 1 Warburg, Otto, Burk, Dean, and Schade, Arthur L., Extensions of Photosynthetic Experimentation, Symposium Volume V, Society for Experimental Biology, 1951 (covering Symposium on Carbon Dioxide Fixation, Sheffield, July, 1950). 11 Ein- Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese* Von Dean Burk** und Otto Warburg Die Resultate dieser Arbeit1 ergaben sich aus einer Weiterentwicklung der Me- thoden zur Messung der Photosynthese. Durch Verwendung von Quecksilber- und Cadmium-Hochdrucklampen konnte die Intensität des monochromatischen Lichts bis auf das 20-fache gesteigert werden. Der Strahl des monochromatischen Lichts wurde in zwei Strahlen gleicher Intensität geteilt, so daß nunmehr bei der Zwei-Gefäß-Methode die beiden Gefäße gleichzeitig belichtet werden konnten. Die Gesamtintensitäten der beiden Lichtstrahlen wurden mit einem Großflächen- Bolometer gemessen, das gegen eine Standard-Lampe des amerikanischen Bureau of Standards geeicht war. Eine Methode zur Messung der Lichtabsorption in dünnen, schnell schwingenden Zellsuspensionen wurde auf der Grundlage der manometrischen Aktinometrie entwickelt, so daß das Prinzip der vollständigen Lichtabsorption aufgegeben werden konnte, d. h., daß die Zdlmengen und damit der Ballast der Atmung bis auf Vio verkleinert werden konnten. Die schwingende Bewegung der Zellsuspensionen in den manometrischen Meßgefäßen wurde so- weit beschleunigt, daß selbst bei Übergängen von den größten Lichtintensitäten zu Dunkel der GasausgWch zureichend war und keine manometrischen Nach- wirkungen auftraten. Wurde mit dieser Technik die Photosynthese bei einem Wechsel von 1 Min. hell und 1 Min. dunkel gemessen, so wurde unter geeigneten Bedingungen in jeder Hellminute pro absorbiertes Lichtquant etwa 1 Mol. Kohlensäure absorbiert und etwa 1 Mol. Sauerstoff entwickelt. Der assimilatorische Quotient CO2/O2 war dabei — 1 bis — 1,2. Die manometrischen Ausschläge waren trotz der kurzen Meßzeiten hinreichend groß. Rot (644 m/0, Grün (546 m//) und Blau (436 m//") gaben nahezu die gleichen Resultate. 15 mm3 Zellen und 200 mm3 Zellen pro Ge- * Aus Zeitschrift für Naturforschg. 66 (1951): 12—22. ** Guest Research Worker of the Kaiser-Wilhelm-Institut für Zellphysiologie, and United States Public Health Service Special Research Fellow (permanent address: National Cancer Institute, Bethesda, Maryland). Zusatz 1961. Da es keine Mehrquantenreaktionen in der Photochemie gibt, so beginnt die Aufklärung des Mechanismus jeder photochemischen Reaktion mit der Entdeckung der Ein-Quanten-Reaktion. Deshalb wird diese Arbeit von 1951 immer an die Spitze aller Arbeiten zu stellen sein, deren Problem der chemische Mechanismus der Photosynthese ist. Alle Schlußfolgerungen der Arbeit von 1951 sind in den folgenden 10 Jahren mit unabhängigen Methoden bestätigt worden; und stillschweigend ist das „Quantenrätsel" aus der Literatur der Photosynthese verschwunden. 1 Lichtquantum entwickelt aus dem Photolyten der Photosynthese — einer Kohlensäureverbindung — 1 O2, von dem 2/s zurückreagieren und dabei neuen Photolyten bilden. Besser als in dieser ersten Darstellung sind die Ergeb- nisse in einem Vortrag vor der Deutschen Bunsengesellschaft im Mai 1951 beschrie- ben worden, der als Beitrag 11 dieses Buchs abgedruckt ist. 138 Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese faß gaben die gleichen Resultate. Wurden aber die Zellen in der Meßlösung 10 Min. auf 55° erhitzt, so wurden keine Druckänderungen beim Wechsel Hell -> Dunkel beobachtet. Wurden die Wechselzeiten zwischen Hell und Dunkel ver- längert, so wurden die photochemischen Ausbeuten kleiner. Die Einschaltung von Dunkelminuten zwischen die Hellminuten war also notwendig, um bei den hohen Lichtintensitäten die hohen photochemischen Ausbeuten zu erhalten. In der Tat hängt mit der Lichtreaktion eine Dunkelreaktion zusammen, die ein Verbrennungsprozeß ist, bei dem umgekehrt wie im Licht Sauerstoff verbraucht und Kohlensäure entwickelt wird. Es ist gleichgültig, ob man diese durch Licht induzierte Dunkelreaktion Atmung oder anders nennt. Die Dunkelreaktion ver- läuft um so schneller, je schneller — bei dem Wechsel von Hell und Dunkel — die Lichtreaktion verläuft, d. h., je höher die Lichtintensität ist. Die Dunkel- reaktion verläuft um so langsamer, je größer die Wechselzeiten Hell -- Dunkel sind, verhält sich also in dieser Hinsicht wie die Lichtreaktion. Die Größe der geschilderten Effekte wird anschaulich, wenn wir den Gaswechsel auf die Stunde umrechnen und ihn mit dem Zellvolumen vergleichen. Für Chlorella fanden wir früher bei Sättigung mit Licht und 20° eine Sauerstoffentwicklung von etwa 2000" 0 des Zellvolumens pro Stunde und im Dunkeln eine Sauerstoffauf- nahme von etwa 100",, pro Stunde. Auch hier finden wir im Licht Sauerstoff- Entwicklungen von 2000% pro Stunde, aber nicht als Sättigungswert, sondern mit hohen photochemischen Ausbeuten; und wir finden im Dunkeln Sauerstoff- aufnahmen bis zu 1000% pro Stunde. Diese schnellen Licht- und Dunkelreaktionen sind zeitlich und ursächlich mit- einander verbunden und hängen quantitativ voneinander ab. Nach der Definition geht die Lichtreaktion nur im Licht vor sich. Von der Dunkelreaktion jedoch muß angenommen werden, daß sie auch im Licht vor sich geht. Dann hat die Dunkel- reaktion, bei Gleichheit von Hell- und Dunkelperioden, die doppelte Zeit wie die Lichtreaktion zur Verfügung und scheint deshalb oft die halbe Geschwindigkeit der Lichtreaktion zu haben. In der Koppelung zwischen Licht- und Dunkelreaktion sehen wir die Lösung des Quantenproblems der Photosynthese. Die Lichtreaktion, in der Sauerstoff abgegeben und Kohlensäure fixiert wird, ist eine Ein-Quanten-Reaktion wie alle photochemischen Reaktionen der unbelebten Welt. Aber damit diese Ein-Quanten- Reaktion möglich wird, hat die lebende Natur die Lichtreaktion mit einer energie- liefernden Dunkelreaktion gekoppelt, die von den notwendigen etwa 110000 cal. 70000 cal. zu liefern hat, während das Licht nur die fehlenden 40000 cal. hinzu- fügt. Es ist eine Besonderheit dieses eminent biologischen Mechanismus, daß die- selbe Substanz, die im Licht gewonnen wird, ihrerseits der Brennstoff der Dunkel- reaktion ist. So verzehrt die Dunkelreaktion in einem Kreisprozeß immer wieder den größeren Teil des Lichtgewinns, und der bleibende Substanzgewinn ist nicht der Substanzgewinn in der Lichtreaktion, sondern die Differenz zwischen Licht- gewinn und Dunkelverbrauch. Wie groß ist dieser bleibende Gewinn ? Aus thermodynamischen Gründen kann er höchstens etwa 1j% des Lichtgewinns sein, da die Energie eines Mols Licht- quanten im Rot 40000 cal., also nur etwa 1/3 des Energiebedarfs der Photosynthese Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese 139 beträgt; während nach der unteren Seite keine Grenzen gesetzt sind und die Dunkelreaktion alle Substanz verbrauchen kann, die im Licht gewonnen worden ist. Wir fanden unter optimalen Bedingungen einen bleibenden Gewinn von !/3 bis 1/5 der im Licht gewonnenen Substanz, d. h., daß 3 bis 5 Quanten absorbiert werden mußten, damit 1 Molekül Sauerstoff in der Bilanz des Kreislaufes ent- wickelt oder 1 Molekül Kohlensäure aufgenommen wurde. So haben wir den Anschluß an unsere früheren Versuche erreicht, in denen wir bei niedrigen Licht- intensitäten und kontinuierlicher Belichtung einen Quantenbedarf von im Mit- tel 4 für die Entwicklung von 1 Molekül Sauerstoff gefunden hatten. Offenbar sind die meisten unserer früheren Messungen, da es nur einen Mechanismus der Photosynthese gibt, Bestimmungen der Bilanz des Kreisprozesses gewesen. Hrn. Curtis J. Humphreys, Chief, Radiometry Section, des Amerikanischen Bureau of Stan- dards danken wir für 2 Standardlampen zur Eichung unsres Bolometers. Für die Hilfe bei unsrer Arbeit sprechen wir Hrn. Walter Schröder und Hrn. Horst Geleick unsern Dank aus. 1. Züchtung der Zellen Chlorella pyrenoidosa wurde, wie früher2, in Gaswaschflaschen gezüchtet, die mit 5% CO2 in Luft so schnell durchströmt wurden, daß keine Sedimentierung ein- trat. Die Flaschen standen bis zu 1/z ihrer Höhe in Wasser von 25° und 20 cm von einer 200-Watt-Metallfadenlampe entfernt. Der Raum war nicht verdunkelt, so daß die Zellen auch Tageslicht erhielten. Die Einsaat betrug 50 mm3. Die Kultur lösung wurde bereitet durch Lösen von 10 g MgSC>4 • 7 H2O, 5 g KH2PO4, 4 g NaCl und 5 g KNO3 in 2 / Brunnenwasser, das einem im Institutsgarten befindlichen Abessinier- brunnen (18 m tief) entnommen wurde. Zusatz von 2,8 ccm «-H2SO4 brachte ph auf 4,5. 12 mg FeSC>4 • 7 HjO wurden nach dem Ansäuern zugesetzt. Hatten sich die Zellen nach 2 ■: 24 Stunden von 50 auf 800 mm3 vermehrt, so wurden sie in breiten Zentrifugiergläsern aus so niederer Schicht abzentrifugiert, daß etwa 1 Minute Zentrifugieren genügte. Scharfes Zentrifugieren, besonders ir. Winkelzentrifugen, ist zu vermeiden. Die abzentrifugierten Zellen müssen sich beim Aufgießen neuer Lösung sofort wieder verteilen. Bei der Messung (nicht bei der Kultur) wurde, einer Anregung von Jack Myers3 folgend, Ammoniumchlorid als Stickstoff quelle benutzt. In obiger Kultur- lösung wurden die 5 g KNO3 durch 0,3 g NH4CI ersetzt. Mit dieser „Meß- lösung" wurden die Zellen einmal auf der Zentrifuge gewaschen. Dann wurden sie in neuer Meßlösung resuspendiert, pn in den Meßgefäßen war dann 4,5 und sank in langen Versuchen bis auf 3,5, ohne daß die Ausbeute schlechter wurde. Die Gefahr der Ausbildung einer CO-2-R.etention, wie in langen Versuchen bei Be- nutzung von KNO3 als Stickstoffquelle, war also hier vermieden. 2, Manometrie Bei allen Versuchen wurde die 2-Gef äß-Methode benutzt, deren Gleichungen für die besonderen Zwecke der Photosynthese-Messungen in einer vorhergehenden Arbeit zusammengestellt sind2. Das Flüssigkeitsvolumen in den beiden Gefäßen war immer gleich und betrug 7 cm3. Die Grundfläche der Kästchen war etwa 140 Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese 8 cm2, die Gesamtvolumina waren verschieden und betrugen z. B. für ein Paar 31 und 21, für ein anderes Paar 21 und 16 cm3. Jedes Gefäßpaar war an den Mano- metern so montiert, daß sich die Böden der Gefäße im Thermostaten auf gleichem Horizontal-Niveau befanden. Wenn es die Größe der Ausschläge erlaubte, zogen wir das erste Paar dem zweiten vor. Der Durchmesser der Manometer-Kapillaren betrug 1,2 mm. Die Helme der Kapillaren waren hohl geschliffen. In den Gasraum wurde Luft mit etwa 10 Vol.-% C02 eingefüllt. Die Bewegung der Gefäße war horizontal mit einer Exkursion von 1,7 cm und einer Frequenz von 200 pro Minute. Hierbei wurde die Flüssigkeit in den Ge- fäßen in eine schwingende Bewegung versetzt und der Gasaustausch zwischen Flüssigkeit und Gasraum so beschleunigt, daß selbst bei Wechselzeiten von nur 1 Minute zwischen Hell und Dunkel, und trotz sehr hoher Lichtintensitäten, physikalische Nachwirkungen nicht beobachtet wurden. Keine Flüssigkeit spritzte dabei, wenn die Gefäße richtig montiert waren, in die Kapillaren. Keine Schaum- blasen bildeten sich selbst in 7stündigen Versuchen. Man achte darauf, daß die Gefäßböden klar und farblos sind. Quarzgefäße sind am sichersten. Für jedes Gefäßpaar und für jeden benutzten Spektralbezirk über- zeuge man sich mit Hilfe des Bolometers, daß die Licht-Transmission der Gefäß- böden gleich ist. Der Thermostat hatte die Maße 76 X 20 x 18 cm. Eine der beiden kurzen Wände war durch eine Glasscheibe ersetzt, durch die die Lichtbündel eintraten. Die beiden Gefäße des Paares wurden einander gegenüber auf den Längsseiten des Thermostaten eingehängt, jedes Versuchsgefäß mit einem Thermobarometer- gefäß gleicher Abmessungen. Zwei Beobachter waren notwendig, da die Druck- änderungen auf den beiden Seiten des Thermostaten gleichzeitig abgelesen werden mußten. 3. Teilung des Lichtstrahls Während bei unsern bisherigen Anwendungen der 2-Gefäß-Methode nur ein Lichtstrahl benutzt wurde, der zwischen den beiden Gefäßen des Paares hin- und Abb. 1. Teilung des Lichtstrahls hergeschoben wurde, haben wir nunmehr unseren Lichtstrahl geteilt, so daß beide Gefäße des Paares gleichzeitig belichtet werden konnten. Auf Vorschlag von Herrn Dr. Ritter der Firma Halle, Berlin- Steglitz, bewirkten wir diese Teilung Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese 141 durch 4 total reflektierende bewegliche Prismen in der skizzierten Anordnung (Abb. 1), bei der die Verteilung des Lichts auf die beiden Strahlen mit Hilfe der inneren Prismen und der Abstand der beiden Strahlen mit Hilfe der äußeren Prismen reguliert werden konnte. Wir justierten die Intensität der beiden Strahlen mit Hilfe des Bolometers. War die Intensität der beiden Strahlen außerhalb des Thermostaten gleich, so wurde sie innerhalb des Thermostaten, am Ort der Versuchsgefäße, mit dem Actinometer geprüft, indem die Versuchsgefäße durch Actinometergefäße gleicher Abmessungen ersetzt wurden. So überzeugten wir uns, daß gleichviel Licht in die beiden Versuchsgefäße eingestrahlt wurde. Wir überzeugten uns weiterhin, daß in den beiden bewegten Gefäßen des Paares bei gleicher Einstrahlung auch gleichviel Licht absorbiert wurde — was nicht selbstverständlich war. Anstatt Zellen, suspendiert in saurer Lösung, gaben wir Zellen, suspendiert in Carbonatlösung (pH 9,5), in die beiden Gefäße des Paares und erhielten für gleiche Zellmengen gleiche Lichtwirkungen. 4. Strahlengang Strahlungsquellen waren Quecksilber-Hochdrucklampen von 200 Watt und Cad- mium-Hochdrucklampen von 500 Watt Stromverbrauch, beide von der Osram- Studiengesellschaft in Berlin. Ein Kondensor von 7 cm Brennweite und 5 cm Durchmesser erzeugte ein paralleles Lichtbündel, dessen Querschnitt durch eine hinter dem Kondensor angebrachte Irisblende variiert werden konnte. Es folgten 5 cm Wasser, Filter für Wärme- und sichtbare Strahlen, dann das Prismensystem zur Teilung des Strahls und weiterhin auf dem Weg eines jeden der beiden Strahlen eine Linse von 17 cm Brennweite und 5,5 cm Durchmesser. Die nun- mehr konvergierenden Strahlen traten in horizontaler Richtung in den Thermo- staten ein, wo sie durch zwei 45°- Silberspiegel vertikal nach oben in die beiden Meßgefäße reflektiert wurden. Die beiden Linsen wurden dabei so eingestellt, daß sie auf den Böden der Meß- gefäße ein Halb-Bild der Irisblende erzeugten, das so klein war, daß es bei der Bewegung der Meßgefäße innerhalb der Grundflächen blieb. 5. Wellenlängen Die Wärmestrahlen wurden in jedem Fall durch 5 cm Wasser und 2 cm lOproz. CuS04 • 5 H20 entfernt. Es folgten Farbgläser von Schott (Jena) oder im Rot Interferenzscheiben. Im besonderen dienten zur Isolierung von 644 m/t aus Cd-Lampe Interferenzscheibe. 578 m/t aus Hg-Lampe 2 mm O.G. Nr. 3. 546 m/t aus Hg-Lampe 2 mm O.G. Nr. 4 und 10 mm Didymglas. 436 m// aus Hg-Lampe 2 mm B.G. Nr. 12 und 2 mm G.G. Nr. 13 366 m/t aus Hg-Lampe 2 mm U.G. Nr. 1. Es war leicht, auf diese Weise Intensitäten zu gewinnen, die für jeden der beiden Strahlen 2 bis 3 Mikromole Quanten pro Minute betrugen. Wenn man die Wahl 142 Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese zwischen Filtergläsern und Interferenzscheiben hat, sind Filtergläser vorzuziehen, weil sie größere Intensitäten liefern. Nur im Rot ist man auf die Interferenzschei- ben angewiesen. Zur Prüfung, ob den benutzten Spektralbezirken Ultrarot oder Rot langwelliger als 670 beigemengt war, wurde hinter die Filter oder Interferenzscheiben ein 1-cm-Trog gebracht, der eine Lösung von 3 mgÄthylchlorophyllidinö ccm Pyridin enthielt. Dieser Trog mußte die bolometrische Wirkung der Lichtstrahlen bis auf einen zu vernachlässigenden Bruchteil zum Verschwinden bringen. 6. Bolometer Zur Messung der Lichtintensitäten diente ein Flächenbolometer nach Kurl- baum, das von der Firma Christian Lassen, Berlin hergestellt war. Die Fläche eines der 4 mit Platinstreifen bespannten Rahmen betrug 10 cm2, die „nutzbare Fläche", die durch Blenden festgestellt wurde, betrug 5 cm2. Die Rahmen waren in einem Schutzkasten aus Kupfer, Hartgummi und Holz montiert und durch eine 2 mm starke herausnehmbare Lithiumfluoridscheibe gegen Luftströmungen geschützt. Die bei der Bestrahlung in der Brücke entstehende PotentialdirTerenz wurde potentiometrisch gemessen, wobei ein Zernicke-Galvanometer als Null-Instru- ment diente. Zur Eichung des Bolometers dienten zwei Kohlefadenlampen des Amerikani- schen Bureau of Standards, C 506 und C 507. In 2 m Entfernung strahlten diese Lampen 62,5 x 10"6 Watt pro cm2, bei einer Betriebs-Stromstärke von 0,350 Am- pere. Die Durchlässigkeit der Fluoridscheibe für die Standardstrahlung betrug 92%. Der Potentiometerausschlag bei der Eichung betrug etwa 36 Mikrovolt, wenn der Bolometerstrom 60 Milliamdere betrug, und die Bolometerblende in 2 m Entfernung vom Standard eine Fläche von 3,974 cm2 hatte. Die bei den Versuchen angewendeten Lichtintensitäten erzeugten 150 bis 1500 Mikrovolt. Mit Hilfe eines rotierenden Sektors überzeugten wir uns davon, daß innerhalb dieses Intensitätsbereichs die Potentiometerausschläge proportional den Lichtintensitäten waren. Wir überzeugten uns ferner davon, daß innerhalb der nutzbaren Bolometer-Fläche die Potentiometerausschläge konstant blieben, wenn bei konstantem Strahl die belichtete Bolometerfläche verkleinert oder vergrößert wurde. Aus der bolometrischen Messung erhielten wir die Lichtintensität in cal pro Minute. Dividierten wir durch den kalorischen Wert eines Mikromols Quanten (für / 546 0,052 cal), so erhielten wir die Lichtintensität in Mikromolen Quanten pro Minute, und multiplizieren wir dann mit 22,4, so erhielten wir die Licht- intensität in mm3 Quanten pro Minute — dem für manometrische Versuche be- quemsten Maß der Lichtintensität. Falls die Lichtstrahlen, wie es in unseren Versuchen der Fall war, vor ihrem Eintritt in den Thermostaten bolometrisch gemessen wurden, so war der Inten- sitätsverlust der Strahlen auf ihrem Weg durch den Thermostaten bis zum Ein- tritt in die Zellsuspension zu berücksichtigen. Dies geschah mit Hilfe des mano- metrischen Actinometers, dessen Ausschlag zunächst außerhalb des Thermo- Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese 143 [m/<] leingestrahlt mm3 Quanten Minuten 578 2,14 578 10,1 578 30,6 578 65,4 O-2-Verbrauch mm3 0-2 Minuten 1,84 7,68 22,5 45,4 7> o2 Quanten 0,86 0,76 0,74 0,69 Tab. 1. 3 mg krist. Äthylchlorophyllid, 300 mg Thioharnstoff, 7 cm3 reines Pyridin. 20°. Gasraum Sauerstoff- ko2 = 1>15. Lichtabsorption vollständig. [m/(] leingestrahlt O-2-Verbrauch 9° mm3 Quanten Minuten mm3 O2 Minuten o2 Quanten 578 1,03 1,03 Iß 578 5,57 5,28 0,95 578 11,4 10,4 0,92 578 33,1 28,8 0ß7 578 68,6 58,8 0,86 546 1,06 1,09 1,03 436 0,93 0,92 0,99 436 2,91 2,63 0,91 436 7,66 6,73 0,88 436 25,9 21,3 0,82 Tab. 2. Wie Tab. 1, aber mit Zusatz von 6 mg Piperidin zu 7 cm3 Pyridin. staten (in Luft) und dann innerhalb des Thermostaten (in Wasser) an der Stelle der Versuchsgefäße gemessen wurde. 7. Actinometer Da ein Bolometer zur Verfügung stand, haben wir das Actinometer nicht mehr zur absoluten Messung von Lichtintensitäten verwendet, sondern nur noch zum Vergleich von Lichtintensitäten. Hierbei hat uns das Actinometer gute Dienste geleistet, z. B. bei der Bestimmung des Lichtverlustes auf dem Weg durch den Thermostaten, wie im vorigen Abschnitt erwähnt; vor allem aber bei der Be- stimmung der Lichtabsorption in dünnen Zellsuspensionen.* Zu diesem Zweck war das Actinometer genauer zu untersuchen. Wir fanden, daß die photochemische Ausbeute kleiner als 1 wird, wenn man über die früher vorgeschriebenen4 Lichtintensitäten hinausgeht. Wir fanden ferner, daß die photochemische Ausbeute bei Verwendung von reinem Pyridin als Lösungs- mittel (reinst Merck) auch bei niedrigen Lichtintensitäten kleiner als 1 ist, daß * Zusatz 1961. Die Absorptionsbestimmung mit dem Actinometer ist seit 1954 ersetzt worden durch die Bestimmung mit der Ulbrichtschen Kugel. Vergl. Bei- trag 25 dieses Buchs. 144 Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese aber bei Zusatz gewisser Basen, wie Piperidin, die Ausbeuten höher werden. Wir fanden ferner, daß man für viele Zwecke das Äthylchlorophyllid durch das leichter erhältliche kristallisierte Phäophorbid ersetzen kann, schließlich, daß die Aus- beuten größer werden, wenn man das Licht in größere Flüssigkeitsvolumina ein- strahlt. Einige Beispiele seien in den Tab. 1 — 3 angeführt. [mit] 546 546 546 546 546 546 leingestrahlt mm3 Quanten Minuten 24,8 24,8 50,7 50,7 103 103 O'2-Verbrauch mm3 0-2 Minuten 17,1 17,6 35,6 35,2 73 73 <P Quanten 0,69 0,71 0,70 0,70 0,71 0,71 0,70 0,70 0,71 Tab. 3. Großes Gefäß mit Phäophorbid anstatt Chlorophyllid. Gesamt- volumen 120,5 cm3, Flüssigkeitsvolumen 80 cm3 (25 mg Phäophorbid a + b, 4000 mg Thioharnstoff, 100 cm3 reines Pyridin) Gasraum Luft. 20° • ko, = 4,46. Aus diesen Beispielen sieht man, daß man bei Verwendung großer Flüssigkeits- volumina, von Luft im Gasraum und von Phäophorbid als lichtabsorbierender Sub- stanz eine bemerkenswerte Unabhängigkeit von der Lichtintensität beobachtet, was für Bestimmungen der Lichtabsorption in dünnen Zellsuspensionen erwünscht ist. 8. Messung der Lichtabsorption Strahlen wir paralleles Licht vertikal von unten in eine Chlorella- Suspension ein, die sich wie bei den manometrischen Messungen der Photosynthese in einem schnell bewegten Kästchen befindet, so verläßt Licht, wenn die Absorption un- vollständig ist, das Kästchen zum Teil durch die obere Wand, zum Teil durch die 4 Seitenwände und zu einem zu vernachlässigenden Teil durch die untere Wand. Dabei wird der absorbierte Bruchteil des Lichts außer von dem Pigment- gehalt der Chlorella auch von der Zerstreuung des Lichts (wegen des Lichtwegs) und von der Art und der Geschwindigkeit des Schütteins abhängen. Will man also wissen, wieviel Licht unter den Bedingungen der manometrischen Messungen der Photosynthese von den Zellen absorbiert wird, so muß man die Absorption des Lichts unter den gleichen Bewegungsbedingungen messen, eine Aufgabe, die wir folgendermaßen gelöst haben: Wir benutzen 2 Quarzgefäße, ein kleineres von 19 cm3 Inhalt und ein größeres von 120 cm3 Inhalt, das eine Einbuchtung hat, in der das kleinere Gefäß befestigt werden kann (Abb. 2). Das kleinere Gefäß wird mit 7 cm3 Zellsuspension beschickt, dann verschlossen und in der Einbuchtug des größeren Gefäßes befestigt. In das größere Gefäß geben wir 80 cm3 Actinometerlösung (Phäophorbid, Thioharnstoff und Pyridin). Dann verbinden wir das größere Gefäß mit einem Manometer, schütteln es wie die Gefäße bei der Messung der Photosynthese und strahlen Licht von unten in vertikaler Richtung in das kleinere Gefäß ein. Ist die Lichtabsorption in dem Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese 145 kleineren Gefäß unvollständig, so dringt das nicht absorbierte Licht in die Actino- meterlösung ein und erzeugt hier einen Sauerstoffverbrauch, der an dem an- geschlossenen Manometer abgelesen wird. Indem man das kleinere Gefäß einmal mit Zellsuspension und einmal mit Wasser beschickt, erhält man 2 manometrische Ablesungen, die, auf gleiche Zeiten bezogen, durch Division die Transmission der bewegten Zellsuspension ergeben. Es sei hervorgehoben, daß hierbei die Lichtabsorption in dem Actinometer- gefäß nicht vollständig zu sein braucht; und daß man die photochemische Ausbeute -Actinomefrische Lösung ■ Zellsuspension i 4 Lichtstrahl Abb. 2. Transmissions-Actinometer. der actinometrischen Reaktion nicht zu kennen braucht, ja nicht einmal die Gefäß- konstante des Actinometers, da man nur Verhältnisse von Druckänderungen mißt. Erwünscht aber ist, daß die photochemische Ausbeute der actinometrischen Reaktion unabhängig von der Lichtintensität ist, wovon man sich in jedem Fall durch Einschalten von Neutralgläsern in den Lichtweg überzeuge. Andernfalls muß man die Ausbeute als Funktion der Lichtintensität graphisch darstellen und mit Hilfe einer Kurve das Verhältnis der Drucke korrigieren. Nach den Daten des vorigen Abschnitts ist Phäophorbid a Thioharnstoff, gelöst in reinem Pyridin (Luft im Gasraum) als Actinometerflüssigkeit geeignet. Beispiele: Kleines Gefäß: 19 cm3 Inhalt, Grundfläche 3,5x2,1 = 7,35 cm- innere Grundfläche, vp immer 7 cm3. Größeres Gefäß: v = 120,5 cm3, v-p = 80 cm3. Gasraum Luft. Actinometer- lösung 25 mg Phäophorbid a + b, 3000 mg Thioharnstoff, gelöst in 100 cm3 reinstem Pyridin (Merck). 20° -#02 = 4,46. Trotz der großen Menge an Actinometerflüssigkeit wurde eine Dunkel- reaktion nicht beobachtet. Als Kontrolle gegen Streulicht ist ein zweites Actionmetergefäß zu empfehlen, das neben dem ersten eingehängt, aber nicht belichtet wird (Tab. 4). 9. Versuche in Carbonatgemischen Wiederum haben wir uns davon überzeugt, daß die photochemische Ausbeute bei der Photosynthese der Chlorella in alkalischen Carbonatgemischen viel schlechter ist als in den sauren Medien bei höheren Kohlensäuredrucken. Unser Carbonat- 10 Warburg, Zellphysiologie 146 Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese gemisch bestand aus 85 Vol. m/10-NaHCO3 und 15 Vol. w/10-KHCO3 (pH 9,4). Im Gasraum war Luft. Bei einem 1 -Minuten- Wechsel von Hell und Dunkel war der Quantenbedarf pro Molekül entwickelten Sauerstoffs etwa 7, während er unter sonst gleichen Bedingungen bei pn 4,5 und Sättigung mit 10 Vol.-0,, CO2- Luft nahezu 1 gewesen wäre. Auch bei unsrer neuen Anordnung also erhält man in Carbonatgemischen nur kleine Bruchteile der maximalen Ausbeute. Andrerseits haben uns die Carbonatgemische bei der Prüfung methodischer Fragen gute Dienste geleistet, z. B. bei der Prüfung der Frage, ob in den beiden ungleich großen Gefäßen, in denen bei der 2-Gefäß-Methode gleiche Zellmengen in gleichen Flüssigkeitsvolumina bewegt und mit gemessenem Licht belichtet wurden, gleichviel Licht absorbiert wurde. Tatsächlich entwickelte Licht gleicher Intensität in den beiden Gefäßen gleichviel Sauerstoff aus Zellen, die in Carbonat- gemisch suspendiert waren, ein Beweis, daß eine der Hauptbedingungen der 2-Gefäß-Methode erfüllt war. Zellen im Druck- Wellen- kleinen änderungen Trans- Ab- längen Gefäß in 7 cm3 im Licht im großen Gefäß mission sorp- tion [m/<] [mm3] [mm] °/ /o /o 436 0 — 20 in 10' _ __ __ 436 4 — 13 in 10' 65 35 436 8 — 8 in 10' 40 60 436 16 — 7 in 20' 18 82 546 0 — 34 in 5' 546 50 — 35 in 10' 51,4 48,6 546 100 — 35 in 20' 25,5 74,5 546 200 — 13 in 30' 6,3 93,8 644 0 — 22 in 10' 644 24,5 — 12,5 in 20' 28,4 71,6 644 49 — 5,5 in 30' 8,3 91,7 Tab. 4. Transmission von C/z/ore//a-Suspensionen für 3 Wellenlängen. Und ferner: Wenn bei der 2-Gefäß-Methode die beiden Gefäße von oben mit weißem Licht (nicht gemessener Intensität) belichtet wurden, so war es oft er- wünscht, daß gleichviel Licht in den beiden Gefäßen absorbiert wurde. Wurden nun gleichviel Zellen, in Carbonatgemisch suspendiert, in die beiden Gefäße eingefüllt und im Licht der weißen Lampe bewegt, so war es leicht, die weiße Lampe zwischen den beiden Gefäßen so zu justieren, daß gleichviel Sauerstoff in den beiden Gefäßen entwickelt wurde. Dann war in den beiden Gefäßen die Lichtabsorption gleich. 10. Die 1-Quanten-Reaktion in Grün Zwei Kästchengefäße der Abmessungen v = 31,23 vf = 7 cm3 und v 20,93 vf == 7 cm3 enthielten je 49 mm3 Zellen, die von der eingestrahlten Wellenlänge Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese 147 546 48",, absorbierten. Der Gasraum enthielt 11 Vol.-% C02-Luft; pH war 4,5. Die Temperatur des Thermostaten war 20°. Die Lichtintensität, die in jedes Gefäß eingestrahlt wurde, betrug 44 mm3 Quanten pro Minute. Die Druck- änderungen wurden ohne Unterbrechung der Schüttelung abgelesen. Die Wechsel- zeiten zwischen Hell und Dunkel betrugen 1,5 Minuten (Tab. 5). Großes Gefäß Kleines Gefäß *o2 &co2 k'o2 k CO» = 2,281 mm2 = 2,870 mm2 = 1,321 mm2 = 1,910 mm2 mm mm 1,5' hell + 0,5 1,5' hell _i_ 1,5 1,5' dunkel — 0,5 1,5' dunkel — 2,0 1,5' hell 0 1,5' hell + 2,0 1,5' dunkel — 0,5 1,5' dunkel — 2,0 1,5' hell + 0,5 1,5' hell + 1,5 1,5' dunkel — 0,5 1,5' dunkel — 2,5 1,5' hell - 0,5 1,5' hell 2,0 1,5' dunkel — 0,5 1,5' dunkel — 2,0 1,5' hell - 0,5 1,5' hell _|- 1,5 1,5' dunkel — 0,5 1,5' dunkel — 2,0 1,5' hell + 0,5 1,5' hell -f 2,0 1,5' dunkel — 0,5 1,5' dunkel — 2,0 Z 9' hell - 2,5 Z 9' hell + 10,5 Z 9' dunkel — 3,0 Z 9' dunkel — 12,5 Differenz H = + 5,5 Differenz H' = + 23,0 H' 1 <P = 4,18; y = — l,15;K'o2 xo2 =150 mm3 hv 9 • 44 • 0,48 190 6,50 150 150 1,27 Tab. 5. In dem gleichen Versuch wurden die gleichen Gefäße in längeren Perioden belichtet und verdunkelt, wobei die Hell- und Dunkelzeiten immer gleich waren. Die Lichtintensitäten waren 44 oder 24 mm3 Quanten pro Minute. Im folgenden sind die beobachteten Druckänderungen angegeben, aus denen mit Hilfe der Daten der Tab. 5 die y- und I/9 -Werte berechnet werden können, die in den bei- den letzten Stäben der Tab. 6 verzeichnet sind. Aus Tab. 6 sieht man, daß der Quantenbedarf pro Molekül entwickelten Sauerstoffs oder absorbierter Kohlensäure abnimmt, wenn die Wechselzeit ab- nimmt und daß der Ouantenbedarf für kurze Wechselzeiten sich dem Wert 1 nähert. Man sieht ferner, daß die Druckänderungen in den Dunkelzeiten, bezogen auf die Zeiteinheit, ungefähr in demselben Maße bei Verkürzung der Wechselzeiten zunehmen wie die Lichtwirkungen. Wie groß hierbei die Stoffumsätze sind, erkennt man, wenn man den Gaswechsel mit dem Zellvolumen vergleicht. Im allgemeinen nimmt man an, daß Chlorella bei 20° im Dunkeln 100",, ihres Zellvolumens an Sauerstoff pro Stunde verbraucht und daß sie bei Sättigung mit Licht etwa 2000° 0 ihres Zellvolumens an Sauerstoff 148 Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese pro Stunde entwickelt. Hier haben wir im Dunkeln Sauerstoffaufnahmen bis zu 1100% des Zellvolumens pro Stunde und im Licht (^-Entwicklung bis zu 2000% des Zellvolumens pro Stunde, aber diese 02-Entwicklung bei einem Quanten- bedarf von 1,3 pro Molekül entwickelten Sauerstoffs! Zum Beleg dient Tab. 7, die berechnet ist aus den Daten der Tab. 5 und 6. Licht- intensitäten (eingestrahlt) mm3 Quanten Minuten 44 44 44 44 24 24 Wechsel- zeiten [Minuten] 1,5 2,5 5,0 7,5 5,0 10 Druckänderungen Großes Gefäß [mm] 9'd 9'h — 3 + 2,5 + 5,5 12,5' d 12,5' h — 3,0 - 1,5 + 4,5 15' d 15' h -4,0 - 2,0 + 6,0 22,5' d 22,5' h -4,0 + 3,5 + 7,5 15' d 15' h -3,5 + 3,0 + 6,5 30' d 30' h — 5,5 + 4,0 9,5 Druckänderungen Kleines Gefäß [mm] 9'd 9'h 12,5 10,5 12,5' d 12,5' h - 23,0 — 13,0 + 12,0 15' d 15' h 25,0 9,5 7,0 + 16,5 22,5' d —10,0 8,5 22,5' h 15'd 15' h 18,5 9,5 8,0 30' d 30' h - 17,5 -12,5 + 9,0 21,5 CÖ2 02 — 1,15 1,19 — 1,03 — 0,97 — 1,02 — 0,90 9 hv o2 1,27 1,4 4,1 5,3 2,2 4,6 Tab. 6 (49 mm3 Zellen pro Gefäß). Quanten- intensität eingestrahlt mm3 Quanten Minuten 44 44 44 44 24 24 Wechselzeit [Minuten] 1,5 2,5 5,0 7,5 5 10 — mm3 O-2 dunkel mm3 Zellen • Stdn. mm" mm-' in 1 0 1100 850 300 222 340 180 + mm3 0-2 hell_ mm3 Zellen • Stdn. mm 3 mm in % 2000 1830 620 400 640 310 1^ <P hv 9i 1,26 1,40 4,1 6,4 2.2 4,6 Tab. 7. Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese 149 11. Die 1-Quantenreaktion im Grün, bei Kompensation der Atmung mit Weiß Zwei Kästchen der Abmessungen?; = 20,93 vF = -- 7 cm3 und v=- 16,59 vF = - 7 cm3 enthielten je 50 mm3 Zellen, die von der eingestrahlten Wellenlänge 546 m// 48% absorbierten. Der Gasraum enthielt Luft mit 11 Vol.-0,, C02. Die Temperatur des Thermostaten war 20°. In jedes Gefäß wurden 19,7 mm3 Quanten pro Minute von unten eingestrahlt; außerdem brannte in der Mitte über den beiden Gefäßen in 30 cm Entfernung eine 200- Watt-Metallfadenlampe, die die Atmung, aber nicht den durch das Grün erregten Verbrennungsprozeß überkompensierte (vgl. dazu Abschn. 13). Die Wechselzeiten zwischen Hell und Dunkel betrugen 1 Minute. Nachdem die Versuchsreihe, die in Tab. 8 wiedergegeben ist, beendigt war, wurde die 200-Watt-Lampe über dem Thermostaten ausgelöscht und der Ver- such im übrigen wie vorher fortgesetzt, d. h. die Intensität / = 19,7 mm3 Quanten pro Minute, wurde im 1 -Minuten- Wechsel eingestrahlt, aber nunmehr nicht im Wechsel gegen Weiß, sondern gegen Dunkel. Wurde 40' lang intermittiert, so wurde erhalten: Im großen Gefäß: Im kleinen Gefäß: E 20' dunkel — 12,5 mm - 20' dunkel — 27,5 mm I 20' hell - 15,5 mm E 20' hell 27,0 mm Differenz H 28,0 Differenz H' - 54,5 E. = 1,94 H = — 1,07 K'oo = 2,68 1 hv <p O2 20 • 19,7 • 0,48 189 9Q 2,68 • 54,5 146 Der Versuch zeigt, daß man bei gleicher Wechselzeit für ein gegebenes Licht- inkrement die gleichen Ausbeuten erhält, ob man das Inkrement zu Zellen hin- zufügt, deren Atmung durch Weiß kompensiert oder nicht kompensiert ist. In beiden Fällen war I/95 = 1,29. Es sei darauf aufmerksam gemacht, daß der negative Druck in den Dunkel- minuten beim 1 -Minuten- Wechsel von dem durch das Licht induzierten Ver- brennungsprozeß herrührt. Die Atmung bei kontinuierlicher Belichtung mit der weißen Lampe war tatsächlich überkompensiert. 12. Die 1 -Quantenreaktion im Blau Zwei Kästchen der Abmessungen v = 20,93 vF = 7 cm3Äund v =-- 16,59 vF = 7 cm3 enthielten je 50 mm3 Zellen, die die eingestrahlte Wellenlänge 436 m// vollständig absorbierten. Der Gasraum enthielt Luft mit 11 Vol.-0,, CO2. Die Temperatur des Thermostaten war 20°. In jedes Gefäß wurden 11,7 mm3 Quanten pro Minute eingestrahlt. Die Wechselzeiten zwischen Hell und Dunkel betrugen 1 Minute. 150 Ein-Quanten-Reaktion und Kreisprozeß der Energie bei der Photosynthese es 1) Ü a s CS :M (4-1 Ü CO <U CS O !h 0 s 1 E lO r— t o ^53 O '-■ ,*> CS CO m o m o m in r\ r\ *\ #"\ *\ *\ T- 1 T-H tH CS T—< T-H lO LTJ O